Helse og Rehabilitering (JLB), Norveç Araştırma Konseyi (GH ve JCG) ve Oslo Üniversitesi (NK ve JCG) hibe tarafından desteklenen oldu.

1. İzolasyon ve embriyolar içine insan kök hücreleri ve enjeksiyon için hazırlık kültürü <ol><li> Bu protokol örnekleri (beyin, yağ, kemik iliği) olarak kullanılan insan kök hücreleri, farklı dokulardan farklı şekillerde izole edilmiştir. Örneğin, yetişkin nöral kök hücreler, sonra tek tek hücrelerin in vitro kültürü ayrışmış endoskopik nöroşirürji sırasında beynin ventrikül duvar alınan doku parçalarından izole edilmiştir . Nöral kök hücreler kendiliğinden diğer hücre tipleri 7 çanak alt uymak kültür ortamı float neurospheres oluşturur. Adipoz elde edilen mezenkimal kök hücreler, fibröz doku kaldırmak için enzimatik sindirilir ve gergin ve daha sonra olgun adipositlerin kaldırmak için santrifüj liposuction malzeme elde edilir. Ortaya çıkan hücreler diğer hücre türleri üzerinde 8 Hematopoetik kök ve progenitör hücreler kemik iliği aspiratlar manyetik partiküller (Myltenyi Biotec, Almanya konjuge özel antikorları kullanarak olumlu seçim izole edilebilir kök hücrelerin çoğalmasını teşvik etmek serumu kültür ortamında yeniden süspanse veya Dynal-Invitrogen, ABD) ve manyetik hücre ayırma ve / veya fluorophores ve floresan aktif hücre sıralama (FACS) 9 konjuge antikorları kullanarak. </li><li> Tavuk embriyoları içine implantasyon öncesinde floresan işaretleyici ile daha sonra kimlik, etiket, kök hücreler kolaylaştırmak. Kök hücreler, implantasyon öncesi kısa bir süre ya da kirlenmesine neden olan ana hücreler aslında hiçbir tehlike ile kalıcı bir etiket kadar tedarikçi önerilen protokolleri kullanarak DII (Invitrogen, ABD) veya PKH26 gibi lipofilik floresan boyalar (Sigma, ABD) etiketli olabilir hala kültür 10 iken, lentiviral vektörleri kullanılarak, Yeşil Floresan Protein gibi bir flüoresan protein geni taşıyan transduced olabilir. </li><li> Insan kök hücrelerin kültür ve yayılma için protokolleri değişir. Detaylı protokolleri literatürde bulunabilir. Kısaca, yapışık kök hücreler genellikle petri kaplarına kültüre ise küre oluşturan kök hücreleri genellikle uygun bir ortamda, (yarma, aşağıya bakınız öğütme kolaylaştırmak), matara kültürü vardır. Bölme veya hasat için, pelet küre oluşturan hücreleri en fazla 5 dakika süreyle 37 º C önceden ısıtılmış tripsin / EDTA çözeltisi 1200rpm ve tekrar süspansiyon az 5 dakika santrifüj. Yapışık hücreler petri tripsin / EDTA çözeltisi ekleyin ve 5 dakika sonunda çiğnemek için. Ca 2, bazen albümin ile tamamlanmaktadır orta, + içeren ekleyerek trypsinization sonlandırın . Tripsin / EDTA kaldırmak hücreleri (1200rpm az 5 dakika) santrifüj için, soğuk enjeksiyon araç içinde tekrar süspansiyon (genellikle orta veya fosfat tamponlu salin solüsyonu), süpernatant kaldırmak ve tekrar santrifüj (1200rpm az 5 dakika). Bu supernatant en kaldırın ve yavaşça, oldukça konsantre bir hücre süspansiyonu oluşturmak için hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Birkaç saat önce enjeksiyon için, buz üzerinde, küçük, kapaklı flakon veya mikrofuge&#39;de tüp insan kök hücreleri süspansiyon tutun. Bu durumda Survival hücre tipine bağlı olabilir. Enjeksiyon araç adhesivity (örneğin bir düşük Ca 2 + araç topaklanma önlemeye yardımcı olabilir) ve hipoksi ve pH değişiklikleri direnci de dahil olmak üzere, hücrelerin özelliklerine göre optimize edilmelidir. </li></ol> 2. Yumurta kuluçka ve hazırlık <ol><li> ° C inkübasyon için önce 14-15: Mağaza bir soğutma odası (Termaks, Bergen, Norveç gibi) yumurta döllenir. Inkübasyon başlayana kadar bu sıcaklık geliştirme tutuklandı. Yaklaşık 10 gün daha fazla veya daha düşük sıcaklıklarda saklanan döllenmiş yumurta daha düşük bir sonraki gelişim ve hayatta kalma oranına sahip. </li><li> Istenilen gelişme aşamasında ulaşılana kadar (evreleme için bkz. Ürün, 38-39 ° C ve inkübe 11: geliştirme yeniden başlatmak için, yumurta, zorla nemlendirilmiş bir taslak inkübatör (Binder, New York, ABD gibi) yerleştirin. .) </li><li> Yumurta açmadan önce, (Şekil A) yumurta kabuğu (çok derinden sarısı piercing önlemek için) ile 18 gauge bir şırınga iğnesi takılması ve 4 ml albümin tahliye embriyo üzerinde bir hava cebi oluşturun. Bu, birkaç dakika içinde gözenekli kabuğun hava yoluyla giriş eşitledi bir basınç düşüşü oluşturur. Hava girerken, böylece kabuk iç yüzeyine embriyo ayıran kabuk içinde en yüksek noktada toplar. </li><li> Şırınga iğnesi ile geleneksel plastik bant ile oluşturulan delik Seal. </li></ol> 3. Cam mikropipetler Çekme <ol><li> Borosilikat cam, cam mikropipetler çekin (örneğin, 1.2mm OD x 0.94 mm kimliği, Harvard Apparatus, ABD), geleneksel bir elektrot çektirmesi (örneğin, Model P-2000, Sutter Instruments, ABD). Microel olarak kullanılan, yüksek giriş direnci mikropipetler elde etmek için çektirmenin ayarlarını yapınectrodes. İpuçları yaklaşık 1-1.5 cm uzunluğunda olması gerekir. Milleri çıkarılır hacimleri hesaplamak için 1 mm aralıklarla işaretlenmiş olabilir. </li><li> Bükme veya bir forseps ile mikroskop altında izlerken sağlam bir zemine karşı iterek uygulanabilir bir boyutu mikropipet ipuçları kırın. Break cam çevresinde mümkün olduğunca düz olmalı ve ucunda ortaya çıkan iç çapı tıkanmış almak alınmadan kullanılamaz hücrelerin boyutuna uyması gerekir. Genellikle 20-30 mikron iç çapı iyi çalışır. </li></ol> 4. Hızlı Yeşil boya solüsyonu (zıt reaktif) hazırlanması <ol><li> Hızlı Yeşil boya (Sigma-Aldrich, ABD) bir tavuk serum fizyolojik (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM eriterek% 0,1 (w / v) solüsyonu hazırlayın Na- fosfat, 5 mM Hepes, 11 mM glikoz, pH 7.4). </li><li> 0.22 mikron Millex GP filtresi (Millipore Co, Bedford, ABD) ile Hızlı Yeşil çözüm Filtre. </li></ol> 5. Açılış yumurta ve embriyo zıt <ol><li> Hava cebinin boyutları kapsayan iki adet yumurtanın üstüne bant yerleştirin. Yumurta odaklı tutulması bantlanmış alan (ve dolayısıyla hava cebinde) üst olduğunu, sağlam bir diseksiyon makas kullanarak bantlanmış alanının sınırları içinde küçük bir pencere kesmek. Bant desteği ekler ve kabuğu parçaları embriyo üzerine düşmesini önlemeye yardımcı olur. Hava cebi ile ilişkili hava kabarcıkları, plastik bir pipet veya diğer künt prob arka uç kullanarak attı. </li><li> 25 gauge iğne ile 1 ml şırınganın içine bazı Hızlı Yeşil çözüm çizin. Şırınga ve iğne herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın. 45 derecelik bir açı ile iğne Bend, embriyonik plaka (bu çemberle kan damarlarının halka tarafından belirlenen, embriyonik plaka artar ölüm içinde piercing) dışında bir noktada nüfuz ve embriyo dikkatle altında nakış kılavuzu. Arzu edilen kontrast elde edilinceye kadar boya enjekte edilir. Normalde şeffaf olan embriyo, koyu yeşil renkli (Şekil B) karşı beyazımsı bir hayalet olarak göze çarpıyor. Birçok araştırmacı, Hindistan Mürekkep (% 10 v / v seyreltilmiş) Hızlı Yeşil yerine kullanın. Bu durumda Pelikan Fount Hindistan Mürekkep gibi toksik olmayan Hindistan Mürekkep, kullanılması önemlidir. </li></ol> 6. Beyin ve omurilik nöral tüp lezyonları <ol><li> Bilenmiş tungsten iğneler üretin alev gravür asetilen / oksijen meşale ile 100 mikron çapında tungsten çubuk (katalog numarası 719.000, A &amp; R Sistemleri, Seattle, Washington) kısa (2-3 cm) adet. Bu meşale alev içine keskin bir ucu geride bırakarak, patlayıcı erozyon tungsten dış katmanları temsil eden bir kıvılcım, görüldüğü kadar çok kısa çubuğun sonuna ekleme yapılır. </li><li> Yoluyla, bilenmiş bir tungsten iğne, dilim kullanma ve mikrocerrahi alanında kapsayan vitellin membran saptırmak. </li><li> Ikinci bilenmiş bir tungsten iğne (vitellin zarından dilimleme sonra ilk iğne ucu genellikle zarar görmüş ve daha sonraki mikrocerrahi için uygun değil) kullanarak, nöral tüp örten epitel ile dikkatlice kesilmiş ve saptırmak, sonra etrafını kesin ve parçanın altında nöral tüp kullanarak, kısa, hızlı yukarı doğru hareketlerle (Şekil C) kaldırılacak. Genellikle uzunlamasına keser sonra enine keser ilk ve en başarılı. Çok derin kesmeyin ya da genellikle ölümcül penetran yatan kan damarları, riske. </li><li> Nazikçe çevirin veya tungsten iğne ile lezyon yerinde uzak rezeke edilen doku parçası sürükleyin. Bu zor görünüyorsa, aynı zamanda esnek borular bağlı bir cam mikropipet kullanarak ağız emme kaldırılmış olabilir. </li></ol> 7. Insan kök hücre enjeksiyonu a. Nöral tüp bir lezyon içine enjeksiyon , Plastik bir tüp kullanarak ağız emme ucu bir cam mikropipet içine küçük bir miktar hücre çizin. Hücre süspansiyonu çalışma konsantrasyonu enjekte edilecek hücre tipi için optimize edilmiş olmalıdır. Mount bir micromanipulator mikropipet ve mikroenjektör pompası (örneğin: PV830 Pnömatik PicoPump, TEFE, Washington, ABD) bağlayın. Diseksiyon mikroskobu kullanılarak görsel kontrol altında, lezyon içine mikropipet ucu kılavuzu ve hava basıncı (ya sabit basınç darbe veya basınç yavaş yavaş yukarı Ramping) (Şekil C) artırarak hücreleri dikkatli bir şekilde sınırdışı. Lezyon yerinde istenilen miktarda hücre içinde yatırılır, mikropipet dikkatlice geri çekin. b. Nöral tüp lümeni içine enjeksiyon Hücreleri, sinir doku lezyonlarının yokluğu erişmek için yeterli invaziv, bazı durumlarda bu, örneğin, gelişmekte olan beyinde ventriküller içine hücreleri enjekte etmek istenebilir. Herhangi bir br lümenine hücre Enjeksiyondeğil bölgesi lümen yeterince büyük bir priz sağlar ve kolayca erişilebilir olduğu bir gelişimsel aşaması gerektirir; 12 ila 18 HH aşamalarında, bu konuda olumlu. Bir lezyon gerekli değildir. Sadece nöral tüp cam mikropipet önce hücre enjeksiyonu ile duvar delmek. Bu yöntemin başarısı için kilit unsurları mikropipet ve penetrasyon abruptness keskinliğini, çok yavaş bir hareket ve mikropipet ucu sadece nöral tüp duvar delmeden Köşelerini olabilir. c. Sistemik enjeksiyon Sistemik enjeksiyonları (bu gemiler iyi gelişmiş, HH aşamada 15 itibaren) ekstra embriyonik kan damarları aracılığıyla yapılabilir. Bu müstesna bir miktar kanama ile birlikte, çok sayıda küçük arterlerin ve daha az büyük damarlar vardır çünkü embriyonun hayatta kalması için söz konusu olduğunda, intra-arteriyel enjeksiyonlarının genellikle güvenli değildir. Öte yandan, intravenöz enjeksiyonlar hücrelerin daha eşit dağılımı ve böylece muhtemelen kalp hücrelerinin daha hızlı erişim sağlamak ve. Başarılı bir enjeksiyon hedeflenen gemi daha küçük bir çapa ile keskin bir mikropipet gerektirir. Küçük bir açıyla (30 derece) yatay ekseni boyunca gemi Yaklaşım. Gemi karşı mikropipet gemi kapamak için başlayana kadar itin. Sonra daha da nüfuz etmek için bir firma, ani hareket itin. Kan kapiller eylem mikropipet ucu içine çekmek görüldüğü kadar yavaşça geri çekin. Hücre enjeksiyonu sonra mikropipet hızlı bir hareket ile geri çekilir sonra, sabit basınç kullanarak olmalıdır. 8. Yumurta Sızdırmazlık <ol><li> Enjeksiyondan sonra, yumurta enjekte edilen hücrelerin yerleşmek ve uyması için birkaç dakika için hala ayakta. Dehidratasyon (hızlı oluşabilir ve ölümcül) önlemek için, bir parça, bu dinlenme döneminde pencere üzerinden, doku ya da filtre kağıdı nemlendirilmiş yatıyordu. </li><li> Bir kaç dakika ve hücrelerin yerleştikten sonra, pencerenin etrafında kabuk kuru ve geleneksel plastik bant ile pencere mühür. Bu mühür sıkı ve açıklıktan ya da kabuk ve bant (bu genellikle sonraki kuluçka sırasında ölümcül kanıtlıyor) arasında hiçbir albümin kaçağı emin olun. </li><li> Daha da geliştirilmesi için zorunlu taslak inkübatör yumurta değiştirin. Gözlem penceresi üzerine bandı kaldırarak aralıklarla yapılabilir. </li></ol> 9 - Embriyo diseksiyonu <ol><li> Sonra embriyo istenilen aşamaya ulaşmıştır, buz gibi soğuk serum fizyolojik veya fosfat tamponlu salin (pencere bandı kapsayan iki yarısı kabuğu ayırmak için izin vermek için ilk kesilmiş olmalıdır). Bir kase içine yumurta açık çatlamak Buz gibi soğuk salin hipotermi embriyo uyutmak için hizmet vermektedir. Kalp hızlı, yavaş ve birkaç dakika içinde durması gerekir. </li><li> Extraembryonic membranlar embriyo ayırın ve ref kullanarak sahne. 11. </li><li> Silikon kauçuk zemin ve glikoz (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na-fosfat, 5 ile desteklenmiş oksijenli serum fizyolojik içeren bir diseksiyon çanak transferi, embriyo başını kesmek mM HEPES, 11 mM glukoz, pH 7.4) ve hızlı ventral tarafta pin up. Abdominal ve torasik organlar çıkarın. Açılı bir makas kullanarak, vertebral kolonun her ventrolateral yönü boyunca uzunlamasına insizyonlar olun. Özellikle ileriki aşamalarında (gelişim 6 gün sonra), omurga ve omurilik arasındaki boşluğu büyük lumbosakral bölgede bulunan en iyi ilk kesi yapılır. Vertebral kolonun ventral omurilik ortaya çıkarın. Serum fizyolojik saf medikal oksijen ile yaklaşık 10 dakikalık aralıklarla köpürme oksijenli kaldığından emin olun. </li><li> Dikkatli bir şekilde, her iki tarafta doğmakta olan dorsal ve ventral kökleri kesmek istenilen düzeyde omurilik transect ve vertebral kanal yavaşça dışarı çıkarın. Omurilik bu durumda kaç saat boyunca hayatta ve anatomik ve fizyolojik 12 13,14 deneyler tabi tutulabilir. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2071/2071fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Albumin tahliye edilmesi için Şekil 1 A) uygun bir yaklaşım. Embriyonun konumu ve iğne yerleştirilmesi unutmayın. B) embriyo Karşıt. Embriyonik diskin dışında iğne penetrasyon noktası unutmayın. C), tek taraflı spinal nöral tüp lezyon için prosedür şematik hücre nakli izledi.

<ol>
	<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li><li>Sigurjonsson, O. E., Perreault, M. C., Egeland, T., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+hematopoietic+stem+cells+produce+neurons+efficiently+in+the+regenerating+chicken+embryo+spinal.">Adult human hematopoietic stem cells produce neurons efficiently in the regenerating chicken embryo spinal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 5227-5232 (2005).</li><li>Pochampally, R. R., Neville, B. T., Schwarz, E. J., Li, M. M., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+adult+stem+cells+(marrow+stromal+cells)+engraft+and+differentiate+in+chick+embryos+without+evidence+of+cell+fusion.">Rat adult stem cells (marrow stromal cells) engraft and differentiate in chick embryos without evidence of cell fusion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9282-9285 (2004).</li><li>Goldstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cells+to+the+chick+embryo.">Transplantation of human embryonic stem cells to the chick embryo.</a> Methods Mol. Biol. 331, 137-151 (2006).</li><li>Lee, H., Shamy, G. A., Elkabetz, Y., Schofield, C. M., Harrsion, N. L., Panagiotakos, G., Socci, N. D., Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+motoneurons.">Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons.</a> Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).</li><li>Wichterle, H., Peljto, M., Nedelec, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+embryonic+stem+cell-derived+motor+neurons+into+the+developing+chick+spinal+cord.">Xenotransplantation of embryonic stem cell-derived motor neurons into the developing chick spinal cord.</a> Methods Mol. Biol. 482, 171-183 (2009).</li><li>Westerlund, U., Svensson, M., Moe, M. C., Varghese, M., Gustavsson, B., Wallstedt, L., Berg-Johnsen, J., Langmoen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoscopically+harvested+stem+cells:+a+putative+method+in+future+autotransplantation.">Endoscopically harvested stem cells: a putative method in future autotransplantation.</a> Neurosurgery. 57, 779-784 (2005).</li><li>Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+stromal+stem+cells+from+human+adipose+tissue.">Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue.</a> Methods Mol. Biol. 325, 35-46 (2006).</li><li>Smeland, E. B., Funderud, S., Kvalheim, G., Gaudernack, G., Rasmussen, A. M., Rusten, L., Wang, M. Y., Tindle, R. W., Blomhoff, H. K., Egeland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+hematopoietic+progenitor+cells:+an+effective+method+for+positive+selection+of+CD34++cells.">Isolation and characterization of human hematopoietic progenitor cells: an effective method for positive selection of CD34+ cells.</a> Leukemia. 6, 845-852 (1992).</li><li>Zhang, X. Y., La Russa, V. F., Bao, L., Kolls, J., Schwarzenberger, P., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+sustained+transgene+expression+in+human+bone+marrow-derived+stromal+cells.">Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells.</a> Mol. Ther. 5, 555-565 (2002).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morph. 88 (1), 44-92 (1951).</li><li>Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+and+anterograde+axonal+tracing+with+fluorescent+dextrans+in+the+embryonic+nervous+system.">Retrograde and anterograde axonal tracing with fluorescent dextrans in the embryonic nervous system.</a> Neuroscience Protocols. 30, 1-13 (1995).</li><li>O'Donovan, M. J., Bonnot, A., Mentis, G. Z., Arai, Y., Chub, N., Shneider, N. A., Wenner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+spatiotemporal+organization+of+neural+activity+in+the+developing+spinal.">Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal.</a> Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).</li><li>Mendelson, B., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+monosynaptic+sensory-motor+connections+form+in+the+absence+of+patterned+neural+activity+and+motoneuronal+cell+death.">Specific monosynaptic sensory-motor connections form in the absence of patterned neural activity and motoneuronal cell death.</a> J. Neurosci. 11, 1390-1403 (1991).</li><li>Glover, J. C., Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Animal+Models+in+Human+Stem+Cell+Biology.">Chimeric Animal Models in Human Stem Cell Biology.</a> ILAR Journal. 51, 62-73 (2009).</li><li>Lee, G., Kim, H., Elkabetz, Y., Al Shamy, G., Panagiotakos, G., Barberi, T., Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).</li><li>Jiang, X., Gwye, Y., McKeown, S. J., Bronner-Fraser, M., Lutzko, C., Lawlor, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+neural+crest+cells+derived+from+in+vitro+differentiated+human+embryonic+stem+cells.">Isolation and characterization of neural crest cells derived from in vitro differentiated human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 18, 1059-1070 (2008).</li></ol>

Tavuk embriyo xenotransplantation deneyler için uygun ve çok yönlü bir hayvan modeli. Embriyonik ve fetal gelişim sırasında fonksiyonel bir bağışıklık sistemi eksikliği inkübasyon sıcaklığı tolere bir tür hücrelerin hayatta kalma ve gelişme izin verir. Tavuk embriyolar kök hücreler (ref yorumlanan 15) çeşitli türleri rejeneratif potansiyelini test etmek için kullanılmaktadır. Memeli kök hücrelerin, merkezi sinir sistemi, aksonal projeksiyonlar nöronlar ortaya çıkmasına neden olabilir de dahil olmak üzere tavuk embriyo dokuları içine entegre edebilirsiniz, sinaptik bağlantı ve elektrofizyolojik özellikleri fonksiyonel nöral devreleri 1,2 bağlamında değerlendirilebilir. Cerrahi işlemler nispeten kolay ve enjeksiyonlar yerine stereotaksik kontrolü görsel altında yapılır için, embriyo sayısı kolayca tek bir deney içinde farklı deneysel koşullara uyum sağlamak için arttırılmış olabilir. Genelde hücrelerin içinde 20-30 embriyolar 4 saatlik deneme içine enjekte edilebilir. Embriyoların enjeksiyon sonrası ölüm başlıca sınırlayıcı faktör. Önlemler, kanama ve dehidratasyonu önlemek için alınmalıdır. Doğal ölüm oranı artar bazı kritik gelişim evreleri vardır farkında olun. Sıcak, steril tavuk zil sesi aşağıdaki enjeksiyon ve kritik gelişim evreleri bir gün önce bir kaç mL embriyo ilave yanı sıra yumurta pencere, sızıntıyı önlemek için mühürlü ve odaklı bir hayatta kalma geliştirir sağlamak. Bant mühür aracılığıyla sızıntı meydana gelirse, yüzeyler ve yeniden-teyp bandı çıkarın kuru. Bazı araştırmacılar, pencere mühür, mum ve cam veya plastik lamelleri kullanın. Mortalite plasebo çalışan embriyolar karşı enjekte önemli ölçüde farklı olmamalıdır. Biz burada insan kök hücreleri, beyin ve omurilik anlage içine enjeksiyon odaklı olmasına rağmen, kök hücreleri de diğer organların anlage (örneğin ref 4) içine enjekte edilir. Her organ kendi zorlukları teşkil etmektedir. Örneğin, kalp içine enjeksiyon çünkü penetrasyon pipetle yüksek mekanik direnci ve diğer yandan embriyoların enjeksiyonu önce oda sıcaklığına soğutma önlenebilir hareketleri, çünkü zor olabilir. Lümen eksikliği Organları yeterli miktarda enjeksiyon uygun olmayabilir ve bu nedenle bir priz oluşturmak için cerrahi lezyon gerekebilir. Insan kök hücreleri, doku içine entegrasyonu teşvik çünkü deneyimlerimiz, lezyon sonrası doku rejenerasyonu bir avantajdır. Hücreler aynı zamanda nöral krest-türetilen periferal ganglionlarda 16,17 mezenkimal türevleri de dahil olmak üzere, içine dahil ulaşmak için bir yol olarak dispersiyon somitic mezenşimin veya göç eden nöral krest gibi embriyonik mezenşimin içine enjekte edilebilir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fluorescent microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Olympus IX-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereo Investigator</td>
<td>Program</td>
<td>MicroBrightField</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MIP-GFP mice</td>
<td>Mice</td>
<td>Jackson Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mathematica</td>
<td>Program</td>
<td>Wolfram</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Image J</td>
<td>Program</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slidebook</td>
<td>Program</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo

Tavuk embriyo normal embriyonik ve fetal gelişim eğitim ve xenotransplantation deneyler için standart bir hücre davranışlarını incelemek için klasik bir hayvan modeli<em&gt; In vivo</em&gt; Ortam. Tavuk embriyonun ana avantajı, düşük maliyetli, yüksek erişilebilirlik, kolay cerrahi manipülasyon ve tam gelişmiş bir bağışıklık sistemi eksikliği sayılabilir. Tavuk embriyolara Xenotransplantation hücre proliferasyonu, farklılaşması ve davranış, sinyalleri embriyonik doku nişler tanımlanan hücreler yanıtları, ve tümörojenik potansiyeli hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Tavuk embriyoları hücrelerin nakli, diğer hayvan modellerinde nakli deneyleri doğru bir adım olabilir. Son zamanlarda tavuk embriyo, insan kök ve progenitör hücreleri, sinir anlage içine yerleştirilmesini izleyen nörojenik potansiyelini değerlendirmek için kullanılır olmuştur<sup&gt; 1-6</sup&gt;. Bu video tavuk embriyo gelişen santral sinir sistemi, insan kök hücreleri nakli için tüm prosedür belge. Istenilen yaş geliştirilen embriyolar kadar prosedürü, döllenmiş yumurta inkübasyon ile başlar. Kabuğu sonra açıldı ve embriyo, embriyo ve yumurta sarısı arasında boya enjekte edilerek tezat. Küçük lezyonlar ana dokusu içine sonraki entegrasyonu teşvik hücre birikimi için bir rejeneratif sitesi oluşturma, mikrocerrahi kullanarak nöral tüp yapılır. Biz insan kök hücreleri, arka beyin ve omurilik formları ve beyni oluşturan nöral tüp parçası lümenine nöral tüp kısmında yapılan bu lezyonların içine enjeksiyonu göstermektedir. Extraembryonic venler ve arterler içine Sistemik enjeksiyonları da, merkezi sinir sistemi de dahil olmak üzere vaskülarize dokulara hücreleri sunmak için alternatif bir yol olarak gösterilmektedir. Sonunda embriyonun gelişmesi birkaç gün sonra yumurtadan kaldırmak için nasıl ve sonraki fizyolojik, histolojik veya biyokimyasal analizler için ücretsiz omurilik nasıl incelemek göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo at JoVE.com

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Bu yazıda, tavuk embriyo merkezi sinir sisteminin çeşitli bölgelerinde insan kök hücrelerinin nakli için bir yöntem mevcut. Bu bir<em&gt; In vivo</em&gt; Çeşitli türleri, insan embriyonik doku ortamlarda kök hücrelerin çoğalmasını ve farklılaşmasını değerlendirmek için modeli.

Tavuk embriyo haline İnsan Kök Hücre Xenotransplantation

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

xenotransplantation-of-human-stem-cells-into-the-chicken-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

19.2K Görüntüleme.  University of Oslo. Bu yazıda, tavuk embriyo merkezi sinir sisteminin çeşitli bölgelerinde insan kök hücrelerinin nakli için bir yöntem mevcut. Bu bir In vivo Çeşitli türleri, insan embriyonik doku ortamlarda kök hücrelerin çoğalmasını ve farklılaşmasını değerlendirmek için modeli.

Video: Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Amaxa Nucleofector İnsan Sinir Kök Hücreler Transfecting

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Biyoloji

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest, most commonly a protein, in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable researchers to conserve primary and secondary antibodies while getting high quality, reproducible qualitative and quantitative data out of their staining. There are two aspects of this protocol that help to conserve the volume of antibody necessary for staining. For one, the cells are grown on small, circular coverslips that are placed in wells of a tissue culture plate. After fixation, the cells on coverslips can be removed from the wells of the plate. For antibody staining, the coverslip with cells is inverted onto a small drop of antibody solution on parafilm and is covered with a second piece of parafilm to prevent drying. Using this method, only ~25 &mu;l of antibody solution is needed for each coverslip (or sample) to be stained. This protocol describes immunostaining of human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can be used for many other cell types.

Immunocytochemistry is a powerful method to determine the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable one to conserve antibodies and get the most out of one's staining.

İmmünositokimya: İnsan Sinir Kök Hücreler

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

HH Sahne 10 Tavuk Embriyolar Ovo Electroporations

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Transgenik Üretimi<em&gt; Hydra</em&gt;: Mikroenjeksiyon yolu ile embriyo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular mechanisms of disease, development, and evolution. To make primate induced pluripotent stem cells (iPSCs) more accessible, this paper presents a non-invasive method to generate human and non-human primate iPSCs from urine-derived cells, and their maintenance using a feeder-free culturing method.
The urine can be sampled from a non-sterile environment (e.g., the cage of the animal) and treated with a broad-spectrum antibiotic cocktail during primary cell culture to reduce contamination efficiently. After propagation of the urine-derived cells, iPSCs are generated by a modified transduction method of a commercially available Sendai virus vector system. First&#160;iPSC colonies may already be visible after 5 days, and can be picked after 10 days at the earliest. Routine clump passaging with enzyme-free dissociation buffer supports pluripotency of the generated iPSCs for more than 50 passages.

The present protocol describes a method to isolate, expand, and reprogram human and non-human primate urine-derived cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs), as well as instructions for feeder-free maintenance of the newly generated iPSCs.