Bu çalışma RESCEJ için HL için G. Harold &amp; Leila Y. Mathers Ödülü ve bir NIH hibe (R24 GM080527) tarafından NRSA Doktora Sonrası Araştırmacı (NIH F32GM9037222) idi desteklenen ve şu anda Ulusal bir mentored Araştırmacı Geliştirme Ödülü tarafından desteklenmektedir Yaşlanma Enstitüsü (K01AG04435). Biz yorumları için teşekkür etmek istiyorum.

Plazmit DNA, iğneler ve enjeksiyon Züccaciye 1. Hazırlık <ol><li> Yüksek Hızlı Maxi Midi Kiti kullanılarak plazmit DNA&#39;nın hazırlanması ve mi etanol çökeltmesi / 2.5 mg DNA konsantre edilir. DNA pelleti, nükleaz içermeyen, deiyonize su içinde çözündürülmelidir. -20 ° C de 10-20 ul alikolar içinde DNA saklayın. (Mevcut vektörlerin listesi için Ek Tablo 1&#39;e bakınız) </li><li> 100 x 15 mm Petri kabı embriyolar tutulması için bir oluk oluşturmak için agaroz kullanılarak bir enjeksiyon çanak yapın. <ol><li> Bir açıda, 100 x 15 mm Petri kabı içine, bir 75 x 50 cam mikroskop slayt yerleştirin. Agaroz Petri kabı içine 24 Nem ortamında erimiş% 2 arasında, yaklaşık 50 ml dökün. Alternatif olarak, ilk çanak içine agaroz dökün ve üstüne bir &quot;Mikroenjeksiyon balık Kalıp&quot; yüzer. </li><li> Agaroz katılaşmış sonra, cam slayt veya kalıp çıkarın. Bir cam slayt, kullanılmış ise, bir traş makinesi ile fazla bla agaroz kesilmişde bir duvar oluşturur. Çanak içine Hydra orta dökün ve hemen kullanmaya veya gerekli olana kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın. Not: kullanımlar arasında 4 ° C&#39;de saklandığında Enjeksiyon yemekleri tekrar edilebilir. </li></ol></li><li> 75, çekme, 525 ısı hız 100, zaman onlar böyle bir Petri kabındaki kil dar bir şerit içine basarak 50. Mağaza iğneler: aşağıdaki koşullar kullanılarak mikropipet çektirmenin bir filamanın borosilikat cam kılcal damarlardan iğne çekin tabağın tabanına paralel tutulur. </li><li> , Enjeksiyon çözeltisinin hazırlanması% 10 fenol kırmızısı, 2 ul 2.5 mg / ml plazma DNA solüsyonuna 3 ul birleştirmek için. Vorteks ve solüsyon kısa bir süre sonra iğne tıkanmasına neden olabilecek parçacıkların ayrılması için bir mikrosantrifüj içinde en yüksek hızda 10 dakika için dönmeye. </li><li> Bir mikroskop altında küçük bir açıklık oluşturmak için forseps ile iğneyi ucundan birkaç milimetre klibi. Not: açık olan uygun boyutta bir esneklik vardırBasınç bu farklılaşmanın Adım 3.3 &#39;de de ayarlanabilir ing. </li><li> Bu uç aşağı dikey bir pozisyonda iğne tutma şekilde Petri tabağına yerleştirin. İğnenin arka ucuna sıvı pipetleme enjeksiyon çözeltisi, yaklaşık 0.5 ul iğne yerleştirin. Kılcal iğnenin ucu içine çözeltinin çekmeye izin verir. </li></ol> Enjeksiyon için Embriyolar 2. Hazırlık <ol><li> Bir günlük bazda yumurta üreten poliplerin Hydra AEP gerginlik kültürünü tarayın. Bu polipler toplayın ve ayrı bir kültür çanak bunları bir kenara koyun. Yumurta oluşumu ilerlemesini izlemek için gün boyunca bu poliplerinde birkaç saatte gözlemleyin. Yumurta ektoderm kırmaya ve geri ektodermal hücrelerin bir halka üzerinde oturup onlar enjeksiyon 25 için hazır. Döllenme için izin vermek için enjeksiyon için en az 1 saat boyunca testisler sahip olan birden fazla Hydra bir tabak, bu poliplerin yerleştirin. Hydra &lt;/ Em&gt; erkekler herhangi bir özel manipülasyon olmadan sperm yayınlayacak. </li><li> Kadın, yaklaşık 400 mikron çapında 25 veya 1- 8 hücreli aşamada embriyo için vardır tam oluşmuş yumurta ile AEP koloni bulunursa, ayrıca enjeksiyon için bu toplamak. Hemen yarma başladı embriyolar enjekte. Not: Bu tam oluşmuş yumurta ve tek hücreli zigot arasındaki farkı söylemek mümkün değildir, dolayısıyla bu enjeksiyon öncesinde erkek ile inkübe edilmelidir. </li><li> Enjeksiyondan önce, bir # 15 bıçak ile bir neşter kullanılarak embriyo altında ve üstünde ebeveyn dokusunun en çıkarmak. Ekli vücut sütunun küçük bir parça, sadece embriyo bırakın gerekirse forseps ile embriyo işlemek için kullanılacak. Not: yeniden uzağa embriyo disseke ve kadın Hydra kolonisinde kalmasını sağlamak için kaydedilmesi gerekir doku. </li><li> Pasteur pipeti kullanarak, bunları duvarına paralel düzenlenmesi, enjeksiyon çanak embriyoları taşımakagaroz yalak. </li></ol> Plasmid DNA 3. Mikroenjeksiyon <ol><li> Bir demir plaka üzerinde oturur bir manyetik stand mikropüskürtücüden monte edin. Bir joystick micromanipulator üzerinde, iğne tutan mikropüskürtücünün parçası enjeksiyon tutucu, montaj. Manyetik bir stand ile, demir plaka joystick manipülatör monte edin. Inceleyici bir mikroskobun sağ tarafındaki tüm bu kurulum yerleştirin ve bu gözlem alanında görülebilir, böylece enjeksiyon tutucu yerleştirin. </li><li> Agaroz oluğun dikey duvar sola olduğu gibi dönük mikroskop altında embriyoları ile, enjeksiyon çanak yerleştirin. Enjeksiyon tutucu içine iğne takın ve çanak Hydra ortama iğne ucu indirin. </li><li> Mineral yağ iğne ve enjeksiyon çözeltisinin bir akışı üst doldurana kadar yavaşça Hydr içine iğne çıkan görülmektedir saat yönünde şırınganın düğmeyi çevirinbir ortamdır. Akışı çok güçlü ise, saat yönünün düğmeyi çevirerek basıncını düşürebilir. Rutin olarak (iğne 1.5 adım kırpılan nasıl yani,), iğne açıklık boyutuna bağlıdır uygun bir basınç elde etmek için bu işlemini gerçekleştirmek. Not: akışı çok güçlü ise, embriyo enjeksiyon hayatta olmaz. </li><li> Mikroskop aracılığıyla görüntülerken, ilk embriyo alanının merkezinde olacak şekilde enjeksiyon çanağı. O embriyoyu değecek şekilde iğneyi hareket ettirin. Iğne ile embriyo delmek için mikromanipülatör kullanın. Not: Agaroz teknenin dikey duvar iğne tarafından kenara itilmesini embriyo devam edecektir. </li><li> Enjeksiyon çözüm embriyo 1 veya 2 saniye akmasına ve sonra hızlı bir şekilde iğneyi çıkarmak için izin verin. Embriyo birden fazla hücre varsa, her bir hücre enjekte edilir. Iğne ucu ile bir sonraki hücreyi hizalamak için embriyo yeniden yönlendirmek için forseps kullanır. </li><li> İlk Embry sonrao sonraki embriyo enjeksiyon pozisyonda olacak şekilde çanağı ve prosedürü tekrar enjekte edilir; Tüm embriyolar enjekte edilene kadar devam eder. </li></ol> 4. ekimi ve Embriyolar Kuluçka <ol><li> Testisleri var birkaç Hydra ile bir çanak içine enjekte edilen embriyoların tüm taşıyın (bu tüm embriyolar döllenmiş olmasını sağlamak için). Onlar embriyojenezinin devam ederken, bir 18 ° C inkübatör embriyolar kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Kütikül aşama ulaşıldığında, Hidra ortam ile doldurulmuş bir 24-çukurlu plaka tek bir kuyusuna enjekte her embriyo hareket. </li><li> 18 ° C&#39;de karanlıkta 2 hafta içinde enjekte edilen embriyolar inkübe edin. </li><li> 2 haftalık kuluçka döneminden sonra, mikroskop altında her embriyo enjekte edin. Manikür-embriyo ebeveyn doku küçük bir parça kopmuş ve ebeveyn doku rejenere olduğu herhangi bir olgu unutmayın. O mi değil mi ki hemen bu rejenere polip çıkarmakYeni bir yavru için staken. </li><li> RT&#39;de bir akvaryum ışığı altında enjekte edilen embriyoların çanağı hareket. Her gün plakaları kontrol ve yavru toplamak. Hydra poliplerin tipik pembe renk yedikleri Artemia geliyor çünkü yeni yavru beyaz olacaktır. </li><li> Transgen ekspresyonunu tespit etmek için flöresanlı bir mikroskop altında yavru dikkate alınmalıdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis.">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li><li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydra.">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li><li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra.">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li><li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra.">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li><li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation.">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li><li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells.">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li><li>David, C. N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning.">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li><li>Chapman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+genome+of+Hydra.">The dynamic genome of Hydra.</a> Nature. 464, 592-596 (2010).</li><li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra.">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li><li>Glauber, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra.">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li><li>Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+complexity+in+the+basal+metazoan+Hydra+is+maintained+by+both+stem+cell+based+mechanisms+and+transdifferentiation.">Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation.</a> Dev Biol. 313, 13-24 (2008).</li><li>Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+epithelial+cell+shape+in+response+to+upstream+signals:+a+whole-organism+study+using+transgenic+Hydra.">Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra.</a> Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).</li><li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity.">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li><li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells.">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li><li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra.">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li><li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type.">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8 (2009).</li><li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer.">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li><li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra.">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li><li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+an+early+branching+metazoan,+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides.">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li><li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris.">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686 (2010).</li><li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra.">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li><li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers.">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li><li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution.">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643 (2012).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).</li><li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells.">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 53-62 (1983).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Hydra rutin üretir asexually, ancak üreten garnetleri başlamak için çevresel uyaranlara gerektirir. Bu uyaranlar çoğu Hydra türler için iyi tanımlanmış değildir ve zorlanma zorlanma farklı olabilir. Cinsel olmak Hydra uyarılması için bir laboratuvar ortamında zor olabilir çünkü, transgenik Hydra üretimi için önemli bir engel düzenli olarak embriyolar elde etmektir. AEP 25 suşu, ancak, laboratuarda kolayca gamet üretir ve bu defa transgenik line&#3...

Hydra rejenerasyon, desen oluşumunu incelemek ve yaklaşık 250 yıl 2 kök hücre için kullanılır olmuştur Hydra üç hücre soylarının oluşan basit vücut planı vardır:. Ektodermal epitel, endodermal epitel ve interstisyum. Boru şeklindeki gövde, tek bir hücre tabakası, her biri ve ektodermal endodermal epitel soylar tarafından oluşturulur. Vücut sütunundaki epitel hücrelerinin mitotik tüm bulunmaktadır. Epitel hücreleri ekstremitelerde 3 yerdeğiştiren zaman, aboral sonunda ağız ucuna veya ayak (bazal disk) de baş (ağız ve dokunaçlarının), bunlar, hücre döngüsünün G2 fazında hücre kaderine 4 değiştirin. Interstisyel soyunun hücreleri, epitel hücreleri arasındaki boşlukları içinde bulunur. Bu soy vücut sütun 5 ektodermal epitel tabakasında bulunan multipotent kök hücreler tarafından desteklenmektedir. Interstisyel kök hücreler üç somatik cel doğuranl türleri (sinirler, bezi hücreleri ve nematocytes) ve germ hücreleri 6,7. Filumuna Sölenteralar bir üyesi olarak, tüm bilaterians için kardeş grup, Hydra çok hücreli hayvanlar arasında paylaşılan temel biyolojik süreçlere ışık tutabilir. Yakın zamana kadar, bu çabalar gen fonksiyonu pertürbasyon güvenilir yöntemlerin eksikliği tarafından engellenir edildi. Ancak, transgenik metodoloji 1 gelişmesiyle birlikte, biz şimdi böyle kök hücre fonksiyonu, yenilenme ve desenlendirme gibi çok hücreli hayvanların, ortak temel mekanizmalarının daha iyi anlayabilmek için Hydra tam olarak yararlanmak mümkün. Transjenik hatlar Hydra yavru önemli bir frekans rasgele entegrasyon ve kimerik ifadesi ile embriyoların, plazmid DNA enjeksiyonu ile belirlenir. Belirli bir soy üniforma ifade ile bir çizgi eşeysiz çoğalması ile kurulabilir. Klonal Transg yaymak için yeteneğienic Hydra hatları sadece cinsel üreme tarafından yayılan olabilir hayvan modellerinin çoğunluğu, bir avantajdır. Buna ek olarak, transgenik hücreler nedeniyle hayvanın şeffaflık ve endojen floresan proteinleri 8 söz konusu olmaması nedeniyle in vivo kolayca izlenebilir. İlk transgenik Hydra hatları yana yedi yıl içinde bu tür çizgiler, çeşitli uygulamalar için kullanılmıştır, 1 yapılmıştır. Farklı hücre tipleri floresan proteinlerin sentezlenmesi mümkün, hücre hareketini takip hücre şekli değişiklikleri gözlemlemek ve vahşi tip koşullarda ve kimyasal pertürbasyondan 1,5,9-12 sonra her iki hücre kaderlerini izlemek için yaptı. Buna ek olarak, çeşitli soy farklı floresan protein sentezlenmesinin spesifik hücre popülasyonlarının FACS izolasyonu sağlar. Bu teknik, kök hücre spesifik mRNA ve seri spesifik küçük RNA 13,14 dizilenmesi için kullanılmıştır. Yükselticisi iseİki Hydra aktin genlerinden biri en yaygın olarak kullanılan bir kaç hücre tipi özel hızlandırıcılar tanımlanmış ve transgenik Hydra 9,11,15,16 GFP sentezlenmesini tahrik etmek için kullanılmaktadır. Gelecekte, hücre türüne özgü promoterler herhangi bir hücre tipi gözlem ve toplanmasını sağlayacak. Buna ek olarak, transgenik bir yaklaşım başarılı Wnt3 promoterinin 17 cis-hareket eden düzenleyici öğeleri tanımlamak için kullanılmıştır. Hydra transgenik yöntemlerinin geliştirilmesi ektopik ekspresyonu aşırı ifadesi ve devirme ile genlerin fonksiyonunu test etmek için güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır. Transgenik hayvanlar fonksiyonu ve hücresel lokalizasyonunu 18-20 hem de incelemek için floresan-etiketli proteinleri eksprese eden yapılmıştır. Buna ek olarak, bir GFP transgenin 3&#39;UTR saç tokası RNA ekspresyonunun hedef genlerin 21,22 demonte yol açar. Bu yaklaşımların GFP tanımlamak için gereklive transgenik hattın oluşturulması sırasında transgenik doku izleyebilirsiniz. Bununla birlikte, bazı durumlarda GFP molekülü etiketli protein işlevine müdahale olasıdır. Yeni bir çalışma Nem genler operon konfigürasyonda düzenlenebilir gösterir, yani, daha sonra, polisistronik transkriptleri, trans-eklenmiş lider sıra ile ayrılmış ve ayrı ayrı 23 çevrildiği, yapılır. Bir protein veya bir operon ve aşağı doğru pozisyonda bir floresan protein geninin üst akış konumunda bir saç tokası RNA kodlayan bir geni yerleştirilerek, bir protein veya bir RNA firkete kodlayan geni etiketlemek zorunda olmayan transgenik doku izleyebilir. Bu yöntem, gen 14 demonte elde etmek için olan bir operasyon DsRed2 konfigürasyonunda bir saç tokası RNA ifade etmek için kullanılmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AEP Hydra Strain</td>
			<td style="width:112px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:576px;">Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High Speed Maxi Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 15 mm Petri Dishes</td>
			<td style="width:112px;">BD Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">75 x 50 mm Glass Microscope Slide</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection Fish Mold</td>
			<td style="width:112px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FM-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Borosilicate Glass with Filament</td>
			<td style="width:112px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">BF100-50-10</td>
			<td>O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:112px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers Forceps, Durmont #5</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel Blade #15</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-822-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IM-9B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnetic Stand</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iron Plate</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Joystick Micromanipulator</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of transgenic hydra by embryo microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Transgenik Hydra hatları kurulması Artemia nauplii&#39;ye her 2-3 gün transgenik yavru besleyin. Yavru bazen yumurtadan çıktıktan sonra bir veya iki gün boyunca yemek yok. Bazı yeni yavrular hayatta olmaz, böylece yemek ve asla. Yavru ektodermal (Şekil 1A), ya transgenik veya endodermal epitel doku ise, hayvan, tomurcuk ve en transjenik doku (Şekil 1B, C) ​​bulunmaktadır tomurcukları toplamak için izin verir. Bir transgen do?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection at JoVE.com

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Transgenik Üretimi<em&gt; Hydra</em&gt;: Mikroenjeksiyon yolu ile embriyo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

generation-of-transgenic-hydra-by-embryo-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

13.9K Görüntüleme.  Yale University School of Medicine. Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi. 