Primat IPSC'ler yararlıdır, ancak etik ve teknik sorunlar nedeniyle elde edilmesi genellikle zordur. Bu protokol, primat IPSC'lerinin oluşturulması ve bakımı için en erişilebilir yolu sağlar. İdrar hücrelerinin IPSC'lerin birincil kaynağı olarak kullanılması, herhangi bir özel teknik olmadan tamamen invaziv olmayan bir şekilde elde edilebildikleri için büyük bir avantaja sahiptir.
Prosedürü gösteren, Wolfgang MS Laboratuvarı'ndan doktora öğrencisi Jessica Radmer olacak. Başlamak için, idrar içeren tüpü 400G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Daha sonra süpernatanı dikkatlice aspire edin, tüpte yaklaşık bir mililitre bırakın ve peleti içine yeniden askıya alın.
Amfoterisin içeren 10 mililitre idrar yıkama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve süspansiyonu serolojik bir pipet kullanarak dikkatlice karıştırın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve tüpte yaklaşık 0.2 mililitreden az bırakın. Hücre peletini, başlangıçta işlenmiş idrarın 50 mililitresi başına amfoterisin içeren bir mililitre birincil idrar ortamında yeniden askıya alın.
Jelatini çıkarın ve süspansiyonun bir mililitresini jelatin kaplı 12 kuyucuklu bir kutucuk içine ekleyin. Plakayı% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir bazal membran matrisi kaplamalı 12 kuyu plakası hazırlamak için, kuyu başına 500 mikrolitre bazal membran matrisi ekleyin.
Sıvıyı dağıtmak için plakayı hareket ettirin ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bazal membran matrisini 900 mikrolitre REMC ortamı ile değiştirin ve kullanıma kadar 37 santigrat derecede saklayın. Denklemi kullanarak beş enfeksiyon çokluğu için gereken Sendai virüslerinin hacmini hesaplayın.
Sendai yeniden programlama kitinin bileşenlerini 37 santigrat derecede temperlenmiş su banyosunda hızla çözün. Sendai virüslerinin hesaplanan hacmini eklemeden ve karıştırmadan önce bir tüpe toplam 100 mikrolitre REMC ortamı ekleyin. Üriner hücrelerin makalede açıklandığı gibi ayrışmasından sonra, hücre sayacını kullanarak hücreleri sayın ve istenen sayıda hücreyi 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Pelet santrifüjleme ile elde edin ve hazırlanan Sendai virüsü karışımının 100 mikrolitresinde tekrar askıya alın. Süspansiyon enfeksiyonu için tüpü 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücre süspansiyonunu bazal membran matrisi kaplı 12 kuyucuk plakasına tohumlamadan önce toplam bir mililitreye REMC ekleyin.
Transdüksiyondan sonra, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin veya IPSC'nin, beşinci günde PSC üretim ortamına geçerek kolonilerin gelişmesine kadar her iki günde bir ortamı değiştirin. IPSC kolonileri kümelenme geçişi için yeterince büyüdüğünde, ortamı kültürlenmiş hücrelerden aspire edin ve hücreleri 500 mikrolitre DPBS ile dikkatlice yıkayın. DPBS'yi çıkardıktan sonra, kuyuya 500 mikrolitre 0.5 milimolar EDTA ekleyin ve iki ila beş dakika boyunca inkübe edin.
Koloniler ayrılmaya başlayana kadar mikroskop altındaki hücreleri dikkatlice gözlemleyin. Kolonilerin kenarları soyulmaya başladığında ve hücreler arasındaki boşluklar görünür hale geldiğinde, EDTA'yı çıkarın ve dikkatlice 500 mikrolitre DPBS ekleyin. DPBS'yi aspire edin ve bir P-1000 pipet kullanarak kuyuyu 500 mikrolitre PSC kültür ortamıyla yıkayın.
Kolonileri uygun büyüklükte kümelere dağıtmak için pipet yukarı ve aşağı. Akıcılığa, tohumlanan hücrelerin istenen yoğunluğuna ve IPSC klonal tercihine bağlı olarak, hücre küme süspansiyonunun 1/10 ila 1/50'sini yeni kuyucuklara aktarın. Kümeleri kuyuya eşit şekilde dağıtmak için plakayı birkaç kez yavaşça ileri geri hareket ettirin.
Kümelerin yapışmasına izin vermek için plakayı 37 santigrat derecede en az 30 dakika boyunca inkübe edin. Koloniler geçiş için yeterince büyüyene kadar ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin. İzolasyondan sonra, idrarla atılan skuamöz hücreler ve çeşitli küçük yuvarlak hücreler görülebilir.
İlk yapışkan çoğalan hücreler görülebilir ve bu hücreler geçilebilen büyük kolonilere dönüşür. Biri epitel benzeri bir fenotipe sahip, diğeri ise uzatılmış şekle sahip daha mezenkimal benzeri bir fenotipe sahip iki farklı hücre tipi görülebilir. İlk geçişten sonra, idrar hücreleri tek katmanlı olarak büyür.
IPSC'nin oluşumu sırasında, bazı yapışkan hücreler görülebilir ve bu hücreler, hücrelerin yeniden programlandığını gösteren morfolojik değişiklikler göstermeye başlar. Ayrıca, kolonileri oluşturan hücreler tipik embriyonik kök hücre morfolojisini gösterir. Üretilen tüm IPSC'ler, açıkça tanımlanmış kenarlara sahip sıkıca paketlenmiş hücrelerle karakterize edilen tipik embriyonik kök hücre benzeri koloni morfolojisini paylaşır.
İmmünositokimya, goril IPSC'lerinde pluripotens ile ilişkili belirteçlerin ekspresyonunu test etmek için kullanıldı. Ayrıca, akış sitometri analizi, analiz edilen orangutan IPSC'lerinin TRA-1-60 için pozitif olduğunu göstermiştir. Ayrıca, goril IPSC'leri endoderm, mezoderm ve ektoderm soylarına ayrılabilir.
Farklılaşmış hücre sayısının artması ve sınır bütünlüğü ve homojenlik kaybı, düşük IPSC kalitesini gösterir. Buna karşılık, tanımlanmış sınırlar, sıkı hücresel ambalajlar ve belirgin nükleoller, yüksek kaliteli IPSC'leri ifade eder. Koronal değişkenlik nedeniyle, primat IPSC'lerinin sağlıklı büyümesini sağlamak için bölme oranı, geçiş zamanlaması ve küme boyutu gibi klona özgü koşulları optimize etmek gerekir.
Yerleşik IPSC'lerin kalite kontrolleri olarak, marker gen ekspresyonunu kontrol etmenin yanı sıra, in vitro EV farklılaşması gibi doğrudan veya dolaylı farklılaşma indüksiyonu ile pre-potens doğrulanabilir.
