Bu çalışma Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın (NSERC) Mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada Yenilik Vakfı (CFI proje numarası 30381) den CDCB bir John R. Evans Liderler Fonu araştırma altyapısını hibe ve tarafından gelen CDCB bir Discovery Grant tarafından desteklenmiştir NSERC dan NJM bir Discovery Grant. ELL bir Ontario Yüksek Lisans Bursu ile ve Guelph Üniversitesi&#39;nde Ontario Veteriner College&#39;dan ovc Burs tarafından desteklendi. CDS NSERC bir Lisans Öğrencisi Araştırma ASİSTANLIK tarafından desteklenmiştir. ALM NSERC bir Alexander Graham Bell Burs tarafından ve Guelph Üniversitesi&#39;nde Ontario Veteriner College&#39;dan ovc Burs tarafından desteklendi.

Yetişkin dişi CD1-türü fare Bu çalışmada kullanıldı. Benzer boyama çeşitli yaşlarda her iki cinsiyeti kullanılarak gerçekleştirilebilir. Deney hayvanları ilke ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi kurallarına uygun olarak bakıldı ve deneysel protokol Guelph Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Golgi Cox Boyama <ol><li> Beyinlerin Golgi-Cox Emprenye <ol><li> ayrı ayrı, yüksek kaliteli su içine potasyum dikromat ve potasyum kromat eritilerek% 1 Golgi-Cox çözeltisi (ağırlık / hacim) potasyum dikromat,% 0.8 (ağırlık / hacim) potasyum kromat ve% 1 (ağırlık / hacim) cıva klorür yapmak . Çözeltiler karıştırın cıva klorür ekleyin ve sınıf 1 filtre kağıdı kullanılarak nihai çözelti filtre. en fazla bir ay süreyle karanlıkta çözüm saklayın. </li><li> % 5 izofluran kullanılarak fare anestezisi. </li><li> kafaları kesilmek suretiyle fare Euthanize ve hızlı bir şekilde beyin kaldırmak. </li><li> Golgi Cox çözeltisi 17 mL içeren 20 mL&#39;lik bir cam sintilasyon şişesi içine beyin yerleştirin ve 25 gün süreyle oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edilir. </li><li> 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de karanlıkta (0.1 M fosfat tampon maddesi, pH 7.4 içinde / hacim) sukroz (% 30) sükroz, dondurarak saklama 40 mL içeren 50 ml konik bir tüp içine yerleştirerek beyin cryoprotect. NOT: Aşağıdaki isteğe bağlı üç adım, uzun süreli depolama için bu aşamada beyin dondurmak amacıyla, ana protokol için bir alternatif olarak kullanılabilir. </li><li> kuru buz üzerinde soğutulmuş olan 200 ml izopentan içine daldırarak tüm beyin dondurun. </li><li> -80 ° C&#39;de karanlıkta, 50 ml konik bir tüp ve deposuna dondurulmuş beyin yerleştirin. </li><li> Hazır devam etmek için zaman, 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de karanlıkta sükroz dondurarak saklama koruyucusunun 40 mL içeren 50 ml konik bir tüp içine yerleştirerek beyin Çözülme. </li></ol></li><li> Beyin Kesit <ol><li> sükroz ve bloktan beyin çıkarınBir ustura kullanılarak beyincik keserek ve beynin kalan kuyruk ucunda düz bir kenar bırakarak kesit için k. </li><li> Isı agar (% 3 (w / v) su içinde) eritilmiş ve erime noktasının biraz üzerinde olduğu kadar soğuması kadar. </li><li> onun kaudal ucu aşağı bakacak şekilde, küçük bir tek kullanımlık tartmak çanak içinde beyin yerleştirin ve beyin kapsayacak şekilde erimiş agar yeterli miktarda ekleyin. </li><li> Agar katılaşmasından sonra, yaklaşık 2 ayrılan fazla agar Döşeme - beyni çevreleyen, 4 mm ve etil siyanoakrilat yapıştırıcı bir miktar kullanarak kuyruk tarafındaki ucu aşağı bakacak şekilde, bir vibratome aşamasına beyin tutkal. </li><li> 400 bir dilim kalınlığında beyin ve bölüm beyin kapsayacak şekilde sükroz dondurarak saklama koruyucusunun yeterli bir miktarı ile vibratome sahne alanı doldurmak - 86 Hz&#39;lik bir titreşim frekansı kullanılarak (incelenecek olan beyin bölgesine bağlı olarak) 500 um ve 0,125 mm / s bir bıçak ilerleme hızı. </li><li> küçük bir boya fırçası kullanarak, Ticari olarak temin edilebilen ağ alt uçlar ihtiva eden bir 6-yuvalı doku kültür plakasının bir kuyuya yer beyin kesitleri önceden doldurulmuş 6 10 mL% 0.1 M fosfat tamponu, pH 7.4 (w / v) sakaroz ile. </li><li> 4 ° de CO / N karanlıkta bölümleri inkübe edin. </li></ol></li><li> Beyin Bölümler Gelişmekte <ol><li> ağ-alt uçlar kullanılarak, 0.1 M fosfat tamponu, pH 7.4 içinde içinde% 2 5 mL paraformaldehid (w / v) (PBD) içeren yeni içine beyin bölümleri aktarın. 15 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında yavaş bir hızda hareket eden bir rocker üzerinde inkübe edin. </li><li> 5 mL su ihtiva eden yeni gözlere aktarılması iki kez bölümleri yıkayın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir orta hızda hareket eden bir rocker yıkayın. </li><li> % 2.7 (h / h) amonyum hidroksit, 5 ml ihtiva eden yeni bir kuyu içine aktarın bölümleri. 15 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında yavaş bir hızda hareket eden bir rocker üzerinde inkübe edin. </li><li> 5 mL su ihtiva eden yeni gözlere aktarılması iki kez bölümleri yıkayın. o yıkayın5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir orta hızda hareket na külbütör. </li><li> Iyi Sabitleme A&#39;nın 5 mL içeren yeni içine aktarın bölümler orjinal satın konsantrasyona su 10x içinde seyreltilmiş olduğunu (Malzeme Tablo). 25 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta yavaş bir hızda hareket eden bir rocker üzerinde inkübe edin. </li><li> 5 mL su ihtiva eden yeni gözlere aktarılması iki kez bölümleri yıkayın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir orta hızda hareket eden bir rocker yıkayın. </li></ol></li><li> Beyin Bölümler Montaj <ol><li> Küçük bir boya fırçası kullanarak, mikroskop lamı üzerine bölümleri monte. fazla suyu çıkarın ve cımbız ve küçük bir doku kullanılarak agar. Tüm Agar dehidratasyon devam etmeden önce kaldırılmış olduğundan emin olun. </li><li> yaklaşık 45 dakika boyunca (400 um&#39;lik kesitler) ya da 90 dakika (500 um bölümler), oda sıcaklığında hava içinde kurumasına bölümleri izin verin. Not: kuruyana zamanlaması ve uygun seviye kritiktir ve her tespit edilmesi gerekebilirLaboratuar ortam sıcaklığı ve nem miktarına göre değişir. Çok kısa bir kurutma süresi müteakip dehidrasyon adımları sırasında slaytların düşme bölümlere yol açar ve çok uzun bir kurutma süresi çatlama bölümlere yol açar. Bölümler hala kuruluk uygun düzeyde parlak olmasını görünecektir. </li><li> belirtildiği gibi Coplin boyama kavanoz içine slaytlar koyarak, kresil moru ile Leke bölümleri. NOT: Bu isteğe bağlı adım kresil moru ile nöronal çekirdekleri leke amacıyla, dondurulmuş asla bölümler için kullanılabilir. Biz temizlenmesi ve kresil menekşe inkübasyon öncesi bölümler cildimizi hatta boyama ve bölümleri arasında düşük arka plan yol bulduk. <ol><li> 5 dakika boyunca madde temizleme yerleştirin. bir kez tekrarlayın. </li><li> 5 dakika boyunca% 100 etanol içinde yerleştirin. bir kez tekrarlayın. </li><li> su içinde, daha sonra su içinde% 95 etanol içinde% 75 etanol yerleştirin ve 2 dakika her biri için daha sonra su içerisinde% 50 etanol. </li><li> 5 dakika su içinde yerleştirin. </li><li> % 0.5 koyun CRE (w / v)7 dakika su içinde Syl mor. </li><li> 2 dakika için su içinde yerleştirin. bir kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> belirtildiği gibi Coplin boyama kavanoz içine slaytlar koyarak bölümleri kurutmak. <ol><li> su içinde, daha sonra su içinde% 50 etanol içinde% 75 etanol yerleştirin ve 2 dakika her biri için daha sonra su içerisinde% 95 etanol. </li><li> 5 dakika boyunca% 100 etanol içinde yerleştirin. bir kez tekrarlayın. </li><li> 5 dakika boyunca madde temizleme yerleştirin. bir kez tekrarlayın. NOT: Bu dehidratasyon ve takas süreleri Bu yazıda anlatılan şekilde fare beyinleri işlemek için yeterlidir. Bununla birlikte, son temizleme aşaması 15 dakika toplam kadar uzatılabilir gerekebilir, sıçan ve inek kuşu dahil olmak üzere diğer türler için gözlenmiştir. </li></ol></li><li> susuz bir montaj ortamı kullanılarak Lamel bölümleri. </li><li> slaytlar en az 5 gün süreyle karanlıkta oda sıcaklığında yatay kurumaya bırakın. </li></ol></li></ol> Kalın Beyin Bölümler içinde 2. Görüntüleme Vitray Nöronlar <ol><li> Görüntü Yığınları yakalama </strong&gt; <ol><li> Mikroskop ampul, kamera ve sahne kontrolörü açın. </li><li> Mikroskop yazılımı (örneğin Neurolucida) açın. </li><li> Mikroskop sahnede bir slayt yerleştirin. </li><li> Bu tür 1.25x 0.4 NA PlanAPO veya 4X 0.16 NA gibi düşük büyütme objektif kullanarak beyin kesitinin bir 2D geniş açılı görüntü yakalama <ol><li> Görüntüyü odaklayın ve maruz kalma süresi ve beyaz dengesi gibi kamera ayarlarını yapın. </li><li> bölümünde herhangi bir yerinde sol tıklayarak bir referans noktası oluştur </li><li> görüntü elde etme penceresinde &quot;tek görüntü elde&quot; seçerek görüntüyü yakalama. </li></ol></li><li> 10X 0.3 NA UPlan FL, N objektif kullanılarak, ilgi konusu nöronlar (ler) i ihtiva eden alanın orta çözünürlükte görüntü yığınları çeker. <ol><li> Görüntüyü odaklayın ve maruz kalma ve beyaz dengesi gibi kamera ayarlarını yapın. </li><li> Bölüm A üstüne odaklanarak görüntü yığını için üst ve alt sınırları ayarlamand seçerek görüntü elde etme penceresinde &quot;yığının en üstüne&quot; yanında, sonra da bölümün altına odaklama ve görüntü elde etme penceresi içinde yanında &quot;alt yığının&quot; &quot;set&quot; seçerek &quot;set&quot;. </li><li> görüntü elde etme penceresinde &quot;görüntü arasındaki mesafeye&quot; nın yanındaki &quot;5 mikron&quot; girerek 5 um adım uzaklığını ayarlayın. </li><li> görüntü elde etme penceresinde &quot;acquire görüntü yığınını&quot; seçerek görüntü yığını yakalama. </li><li> Tüm görüntü yığınları X ve Y eksenlerinde en az% 10 üst üste emin, ilgi konusu tüm alanı yakalamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın. </li></ol></li><li> bir 30X 1.05 NA silikon yağ daldırma objektif kullanarak, ilgi konusu nöron içeren bölgenin yüksek çözünürlüklü görüntü yığınları çeker. <ol><li> objektif ve oi ile ilişki kurmak için sağlanması, sürgünün silikon immersiyon 4 damla ve slayt üzerinde amacı yer - 3 uygulal. </li><li> Görüntüyü odaklayın ve maruz kalma ve beyaz dengesi gibi kamera ayarlarını yapın. </li><li> bölümün üstüne odaklanan ve &quot;set&quot; seçerek görüntü yığını için üst ve alt sınırları ayarlayın sonraki ardından görüntü elde etme penceresi içinde ve &quot;yığının üst&quot; bölümünün altına odaklama ve seçmenin &quot;set&quot; görüntü elde etme penceresinde &quot;yığının altında&quot; yanında yer almaktadır. </li><li> görüntü elde etme penceresinde &quot;görüntü arasındaki mesafeye&quot; nın yanındaki &quot;1 mikron&quot; girerek 1 um adım uzaklığını ayarlayın. </li><li> görüntü elde etme penceresinde &quot;acquire görüntü yığınını&quot; seçerek görüntü yığını yakalama. </li><li> Tüm görüntü yığınları X ve Y eksenlerinde en az% 10 üst üste emin, ilgi konusu tüm alanı yakalamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın. </li></ol></li><li> veri dosyasını kaydedin ve dış işleme için TIFF formatında tüm resim dosyalarını kaydedin. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Z-projeksiyon Görüntüleri ve Görüntü Montajları Oluşturma <ol><li> ImageJ Z-projeksiyon görüntüler oluşturun <ol><li> Biyo-Biçimleri eklentisi yüklü olan Açık ImageJ yazılımı. </li><li> &quot;Plugins&quot; Seç -&gt; &quot;Biyo-Biçimleri&quot; -&gt; &quot;Biyo-Biçimleri İthalatçı&quot;. </li><li> Görüntü yığını dosyasını seçin açılacak. </li><li> &gt; &quot;Tür&quot; - -&gt; &quot;RGB Renk&quot; dosya açıldığında, &quot;Resim&quot; i seçerek RGB&#39;ye biçimini değiştirmek. </li><li> &quot;Image&quot; seçeneğini seçerek Z-projeksiyon oluşturma -&gt; &quot;Yığınlar&quot; -&gt; &quot;Z Projesi ...&quot;. </li><li> TIFF dosyası olarak iki boyutlu Z-projeksiyon görüntüsünü kaydedin. </li></ol></li><li> bütün ilgilendiren alanın iki boyutlu görüntü montaj oluşturun. <ol><li> (Örneğin, Adobe Photoshop) yazılımını açın. </li><li> &quot;Dosya&quot; seçin -&gt; &quot;Otomatik&quot; -&gt; &quot;Photomerge&quot;. </li><li> Seç &quot;Gözat&quot; ve sonra tüm imag eklemekes dosyalar birleştirilecek. </li><li> &quot;Birlikte Görüntüleri Blend&quot; seçilirse ve ardından &quot;Tamam&quot; seçeneğini emin olun. </li><li> TIFF dosyası olarak ilgilenilen bölgenin tamamını çıkan montaj görüntüsünü kaydedin. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Golgi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulla+struttura+della+sostanza+grigia+del+cervello.">Sulla struttura della sostanza grigia del cervello.</a> Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).</li><li>Cox, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impr&#228;gnation+des+centralen+Nervensystems+mit+Quecksilbersalzen.">Impr&#228;gnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen.</a> Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).</li><li>Zaqout, S., Kaindl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi-Cox+Staining+Step+by+Step.">Golgi-Cox Staining Step by Step.</a> Front Neuroanat. 10, 38 (2016).</li><li>Levine, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+thin+tissue+Golgi-Cox+impregnation:+fast,+reliable+methods+for+multi-assay+analyses+in+rodent+and+non-human+primate+brain.">Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain.</a> J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).</li><li>Ranjan, A., Mallick, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+method+for+consistent+and+reliable+Golgi-Cox+staining+in+significantly+reduced+time.">A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time.</a> Front Neurosci. 1, 157 (2010).</li><li>Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+vibratome+sectioning+of+Golgi-Cox+stained+whole+rat+brain.">A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain.</a> J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).</li><li>Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Golgi+staining+protocol+for+use+in+the+human+brain+stem+and+cerebellum.">A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).</li><li>Narayanan, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appraisal+of+the+effect+of+brain+impregnation+duration+on+neuronal+staining+and+morphology+in+a+modified+Golgi-Cox+method.">Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method.</a> J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).</li><li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Golgi-Cox+method.">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li><li>Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hippocampus+makes+a+significant+contribution+to+experience-dependent+neocortical+plasticity.">The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity.</a> Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).</li><li>Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+binge-like+alcohol+exposure+decreases+dendritic+complexity+while+increasing+the+density+of+mature+spines+in+mPFC+Layer+II/III+pyramidal+neurons.">Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons.</a> Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).</li><li>Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressive-like+behaviours+and+decreased+dendritic+branching+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+mice+with+tumors:+A+novel+validated+model+of+cancer-induced+depression.">Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression.</a> Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).</li><li>Frauenknecht, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+with+experimental+antiphospholipid+syndrome+display+hippocampal+dysfunction+and+a+reduction+of+dendritic+complexity+in+hippocampal+CA1+neurones.">Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).</li><li>Camacho-Abrego, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangement+of+the+dendritic+morphology+of+the+neurons+from+prefrontal+cortex+and+hippocampus+after+subthalamic+lesion+in+Sprague-Dawley+rats.">Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats.</a> Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).</li><li>Redila, V. A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+changes+in+dendritic+structure+and+complexity+in+the+adult+hippocampal+dentate+gyrus.">Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus.</a> Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).</li><li>Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+alpha5+subunits+drive+developmental+changes+in+the+activation+and+morphology+of+prefrontal+cortex+layer+VI+neurons.">Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons.</a> Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).</li><li>Lytton, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , (2002).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Ha, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Golgi-Cox+method+with+counterstain+for+the+study+of+synapses.">A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses.</a> Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+coeruleus:+a+cytoarchitectonic,+Golgi+and+immunohistochemical+study+in+the+albino+rat.">The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat.</a> Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).</li><li>Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+combining+Golgi+and+Nissl+staining+to+study+neuronal+morphology+and+cytoarchitecture.">A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture.</a> J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Biz kalın beyin bölümlerinde nöronların görselleştirilmesi için burada Golgi-Cox boyama protokolü iki yararlı varyantları ile birlikte açıklar. Temsili Sonuçlar gösterildiği gibi, uzun bir 800 mikron çalışma mesafesine sahip yüksek çözünürlüklü hedefi kullanımı 500 um kesilerek beyin bölümlerinin derinliği boyunca tüm nöronların güvenilir olarak gösterebilir. nispeten kalın beyin kesitlerinin Bu çalışma, her tür lekeli nöronlar olarak uzun ve karmaşık apikal dendrit ağaçlar ...

Doku örnekleri içindeki tek tek nöronların görselleştirme beynin anlaşılmasını önemli ölçüde ve endojen hastalık veya eksojen çevresel faktörlerden etkilenebilir nasıl nöron morfolojik özelliklerinin yerinde analizi için izin verir. Golgi Cox boyama yöntemi beyin içindeki nöronların rasgele örnek boyama bir düşük maliyetli, nispeten basit bir yöntemdir. İlk 1800&#39;lerde Golgi 1 tarafından geliştirilen ve Cox 2 modifiye araştırmacılar ayrıca, görselleştirmek ve dendritik bitkilerin morfolojik ve omurga yoğunluğu 3, 4, hem ölçmek için kullanılabilecek net, iyi boyanmış nöronlar üretmek için yılda bu tekniği rafine 5, 6, 7, 8, 9. beyin bölümlerinde boyanan nöronların görüntülenmesi için önemli bir teknik göz mevcut olan, yüksek büyütme / yüksek çözünürlüklü mikroskop hedeflerin çalışma mesafesi ile sınırlıdır, maksimum kesit kalınlığı vardır. 60 ortak yağ daldırma amaçlar - 100X mükemmel çözünürlük temin aralığı, fakat tipik olarak 200 um daha büyük olan çalışma mesafesi ile sınırlıdır. 200 um aralığında kesilmiş beyin kesitleri serebral korteks 10, CA1 bölgesindeki 11, 12, piramidal nöronlar sığ tabakalarda, örneğin piramit nöronlar için bu dilim kalınlığı içinde ihtiva edilebilir bazı nöron türleri, görselleştirmek için yeterli olabilir hipokampus 15 dentat girus hipokampus 13, 14, ve granül hücreleri. Nispeten uzun olan NöronlarBu tür beyinler bütün dendrit ağaç içeren bir mükemmel bir açıyla kesitli olması gerekir, çünkü hücre gövdesi 16 &#39;den fazla 800 um uzanabilir fare için, daha büyük bir meydan okuma sağlayan serebral korteksin derin katmanlannda içinde piramidal nöronlar gibi dendritik ağaçlar, 200 um dilimleri içinde. dendrit ya da dallarından herhangi rostral veya kaudal yönde uzanan, bu da mümkün olmayabilir. Birden çok bitişik beyin bölümleri arasında bir nöron takip ederek bu sınırlamayı ele almak mümkün olsa da, bu yaklaşım 17 izleme için doğru bölümlerini ayarlamak önemli bir teknik sorun tanıtır. Daha pratik bir yaklaşım, daha büyük bir kalınlıkta kesilir beyin kesitleri içinde bulunan tüm nöronlar görselleştirmek için olacaktır. Golgi Cox yöntemi kullanılarak farelerin 500 um kalınlığında beyin bölümleri ve bunların mo görselleştirmek için - Burada 400 içindeki nöronlar leke bir teknik raporrphology 800 um çalışma mesafesine sahip bir yüksek çözünürlüklü silikon yağ daldırma objektif kullanarak. Bizim tarif Golgi Cox emdirme ve işleme protokol literatürde 6&#39;da en çok atıf modern protokoller birinden modifiye edilir. Kalın beyin kesitleri ile Yaklaşımımız tam bölüm içinde yer alan herhangi bir tipte nöronları belirlenmesi ihtimalini arttırmaya yönelik bir avantaj sağlar. Ana protokole ek olarak, aynı zamanda eşsiz yararlar sağlar, bu iki varyasyon: sırayla monte kesitlerin yüzeyi üzerinde kresil menekşe karşıt (1) Golgi Cox boyama beyin bölgelerinin sınırları tayin ve tabakalarını tanımlamak için kesit ve son işlem öncesi emdirilmiş tüm beyinlerinden uzun süreli depolama için bir ara dondurma adımı ile serebral korteks, ve (2) Golgi Cox boyama.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="775">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">potassium dichromate</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">P188-100</td>
			<td style="width:167px;">Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">potassium chromate</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">P220-100</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mercuric chloride</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">S25423</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Whatman grade 1 filter paper</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">1001-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">isoflurane</td>
			<td style="width:147px;">Pharmaceutical Partners of Canada</td>
			<td style="width:175px;">CP0406V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">20 mL scintillation vial</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">03-337-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Bioshop Canada</td>
			<td style="width:175px;">SUC700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S5011-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S9390-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">12-565-271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">isopentane</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AC126470010</td>
			<td>also known as 2-methylbutane. Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">agar</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">A1296-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">small weigh dish</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">vibratome</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:175px;">VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">6 well tissue culture plates</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">08-772-1b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mesh bottom tissue culture inserts</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">07-200-214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:288px;">paraformadelhyde, 16%</td>
			<td style="width:147px;">Electron Microscope Sciences</td>
			<td style="width:175px;">15710-S</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">A669S-500</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Kodak Fixative A</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">P7542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">superfrost plus slides</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">CitroSolv clearing agent</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">22-143-975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">anhydrous ethyl alcohol</td>
			<td style="width:147px;">Commercial Alcohols</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">cresyl violet</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C1791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">permount</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">upright microscope</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">BX53 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">colour camera, 12 bit</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">DV-47d</td>
			<td style="width:167px;">QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:288px;">three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td>Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">4x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">4x 0.16 N.A. UplanSApo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">10x 0.3 N.A. UPlan FL N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">30x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td>30x 1.05 N.A. UPlanSApo&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">60x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td>60x 1.42 N.A. PlanAPO N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">silicone immersion oil</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">Z-81114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Neurolucida software</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">Version 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:147px;">U. S. National Institutes of Health</td>
			<td style="width:175px;">Current version</td>
			<td>With the OME Bio-Formats plugin installed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:147px;">Adobe</td>
			<td style="width:175px;">version CS6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging neurons within thick brain sections using the golgi-cox method

nöron boyama Golgi-Cox yöntemi histolojik beyin numuneleri içinde nöron morfolojisi anlayışımızı ilerletmek için fazla iki yüz yıldan kullanılmıştır. tam olarak tek bir bölüm içinde bulunan lekeli nöronların tanımlama olasılığını arttırmak amacıyla, mümkün olan en büyük kalınlıkta beyin kesitler hazırlamak için pratik bir bakış açısından tercih edilir olsa da, bu yaklaşım, yüksek çalışma mesafesi ile teknik açıdan sınırlıdır -magnification mikroskop amaçları. Burada 500 um kalınlığında kesilir fare beyin bölümlerinde, Golgi-Cox yöntemiyle nöronlar leke ve yüksek çözünürlüklü 30X 1.05 NA silikon ile donatılmış dik bir mikroskop kullanarak bu bölümlerin derinliği boyunca nöronlar görselleştirmek için bir protokol rapor 800 um çalışma mesafesine sahip yağ daldırma objektif. Ayrıca yüzeyini counterstain için kullanılabilir bu protokolün iki faydalı varyantları raporkresil violet Nissl leke beyin bölümleri monte edilebilir veya önceden kesit ve son işlem uzun süreli depolama için bütün beyin dondurma. Ana protokolü ve iki varyantları, tam nöron dendritik ağaçları ve dendrit dikenleri güvenilir görüntülenmiştir ve sayısal edilebilen boyunca lekeli kalın beyin bölümleri üretir.

500 um kalınlığında beyin kesitleri - Bu Golgi Cox boyama protokolü ve iki tarif edilen isteğe bağlı varyantları 400 içindeki tek tek nöronlar görselleştirmek için kullanılabilmektedir. 10X objektif ve Z ekseninde 5 um adımlar kullanılarak çekilen iki boyutlu Z çıkıntıların Örnek görüntü montajları, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir: A1 - ön singulat kortekste alanı 1 ve şunları içerir koronal beyin kesitleri büyük bir alan için <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method at JoVE.com

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

Biz bir doku örnekleri içinde bulunan uzun dendritik ağaçlar nöronlar görselleştirmek amacıyla, kalın beyin bölümlerinde, Golgi-Cox boyama yöntemi kullanılarak bir protokol mevcut. Bu protokolün iki varyantları da cresyl menekşe karşıtboyama ve uzun süreli depolama için işlenmemiş beyinleri dondurulmasını içerdiğini sunulmaktadır.

Golgi-Cox Yöntemiyle Kalın Beyin Bölümler içinde Görüntüleme Nöronlar

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

imaging-neurons-within-thick-brain-sections-using-the-golgi-cox-method

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.2K Görüntüleme.  University of Guelph.  Biz bir doku örnekleri içinde bulunan uzun dendritik ağaçlar nöronlar görselleştirmek amacıyla, kalın beyin bölümlerinde, Golgi-Cox boyama yöntemi kullanılarak bir protokol mevcut. Bu protokolün iki varyantları da cresyl menekşe karşıtboyama ve uzun süreli depolama için işlenmemiş beyinleri dondurulmasını içerdiğini sunulmaktadır. 

Video: Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Nörobilim

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Retina Bölüm morfometrik Analizleri

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile stimulation is a positive early experience that mimics maternal licking and grooming in the rat. Exposing rat pups to this positive experience can be completed easily and cost-effectively by using highly accessible materials such as a household duster. Using a cross-litter design, pups are either stroked or left undisturbed, for 15 min, three times per day throughout the perinatal period. To measure the neuroplastic changes related to this positive early experience, Golgi-Cox staining of brain tissue is utilized. Owing to the fact that Golgi-Cox impregnation stains a discrete number of neurons rather than all of the cells, staining of the rodent brain with Golgi-Cox solution permits the visualization of entire neuronal elements, including the cell body, dendrites, axons, and dendritic spines. The staining procedure is carried out over several days and requires that the researcher pay close attention to detail. However, once staining is completed, the entire brain has been impregnated and can be preserved indefinitely for ongoing analysis. Therefore, Golgi-Cox staining is a valuable resource for studying experience-dependent plasticity.

This paper describes the procedures for tactile stimulation of rat pups and subsequent Golgi-Cox staining of neuronal morphology. Tactile stimulation is a positive experience that is administered in the perinatal period by stroking pups with a household duster. Golgi-cox staining is a reliable procedure permitting the visualization of entire neurons.

Golgi-Cox Boyama ile dendritik morfoloji ve sinaptik bağlantı üzerinde olumlu bir Erken Deneyimi, Tactile uyarılması Etkileri, görselleştirme

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Uyarı, Baş-ölçülü Sıçanların Alt-kortikal Beyin Yapıları içinde Juxtacellular İzleme ve Yerelleştirme Single Nöronlar

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Yaşlı Bir Farede Hipokampal Dendritik Karmaşıklığın Golgi-Cox Yöntemi ile Değerlendirilmesi

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...