Biz Dr kabul etmek istiyorum. Ilk sırasında yardım için Ping Haziran Zhu ve Susumu Koyama tekniğin kurmak ve yardım için yazılmış bir el yazması biçimlendirme Dr Veronica Alvarez. Bu çalışmada NIAAA İntramural Klinik ve Biyomedikal Araştırma Bölümü tarafından finanse edildi.

1. Hazırlanması Alev Sızdırmaz Cam Mikropipet <ol><li> Mikroelektrot cam kullanarak, Flaming-Brown ya da eşdeğer bir mikropipet çektirmesi (ucu çapı ~ 2 mm) standart bir yama klemp mikropipet çekin. Yeri mikropipet ~ 2 saniye boyunca erimiş top kıvamına gelinceye kadar 200-300 mikron çapında bir Bunsen beki alev ucu. </li><li> Piezoelektrik bimorph, röle veya eşdeğer etkili cihaz kullanarak hızlı bir şekilde (seyahat mesafesi 100-200 mikron) yan-yan titreşilecek bir mikromanipülatör tutucu üzerine yerleştirin alev sızdırmaz yama pipet. </li></ol> 2. P1-P21 Sıçanlar ya da Fare Beyin Dilimleri hazırlanması <ol><li> 124 NaCl, 4.5 KCl, 1.2 NaH 2 NaHCO 3 PO 4, 26 ve 10 D-glukoz: Aşağıdaki kompozisyonu (mM) ile yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlayın. ~ 15 dakika süreyle% 95 oksijen /% 5 CO 2 gaz Bubble çözümü, daha sonra 2 mM CaCl 2 ve 1 mM MgCl 2 ekleyin. </li><li> Kesme beyin kesitleri: <ol><li> Halotan ve izofluran ile hayvan anestezisi. Hayvan başını kesmek - beyin kaldırmak istenilen açıda (koronal parasagital, enine, vb) blok beyin ilgi bölgesini de dahil etmek. </li><li> Yapıştırmayın aCSF batmış bir titreşimli beyin dilimleyiciyi aşamasında bloke beyin 250-400 mikron kalınlığında bölümünde beyin - aCSF dilimler tüm yüzeylerde sıvı / gaz maruziyeti sağlar file &quot;preinkübasyon&quot; odasına carbogen ile kabarmış dilimleri, bu ortamda en az bir saat gelmesini sağlayınız. </li></ol></li></ol> 3. Vibrodissociation <ol><li> Ve NaOH 150 NaCl, 5 KCl, 10 Hepes, 1 MgCl 2, 2.5 CaCl 2, 10, pH 7.4 &#39;e ayarlanmış olan D-glukoz: Aşağıdaki kompozisyonu (mM) Hepes-tamponlu salin solüsyonu ile 35 mm çap kültür kaplarına doldurun ozmolarite ~ 300 mOsm sakaroz kullanılarak ayarlanabilir. Kültür yemekleri süspansiyon yemekleri, standart hücre kültürü yemekleri, cam lamel ekler ile kültür kaplarına veya yemekler çanak alt güçlü hücre bağlılık için ihtiyaç bağlı olarak, örneğin, poli-L-lizin ile kaplı olabilir. </li><li> Dilim kültür çanak yerleştirin ve 250 x. bir diseksiyon Stereoskop ile görselleştirmek Dilim dilim üst yüzeyine yerleştirilen bir ağırlık olarak hareket etmek bükük bir platin tel (0,5 mm çap) kullanarak alt tutun. </li><li> Istenen beyin bölgesi dilim yüzeyinde alev sızdırmaz mikropipet ucu yerleştirin. Gezi mesafe ~ 100 mm, 10-30 Hz&#39;de yanal ucu titreşmeye mikromanipülatör etkinleştirin. Mikromanipülatör kullanarak, ~ 30 saniye içinde tüm dilim geçtiği gibi dilim doku derinliklerine ucu hareket ettirin. Verilen bir beyin bölgesi elde izole nöronların sayısını en üst düzeye çıkarmak için gerekli olan bu adımı yineleyin. </li><li> Dilim ucu Kaldır - dilim forseps ile pick up ve hala bir çözüm ise yavaşça sallayın sonra tamamen dilim çıkarın ve atın. </li><li> Ayrışmış hücreleri en az 10 dakika boyunca çanak alt uymak ve yerleşmek için izin verin. </li></ol> 4. Elektrofizyolojik Kayıt <ol><li> Ters bir mikroskop sahnede nöron içeren çanak yerleştirin ve 10 x 63 x objektif ile görselleştirmek. Düzgün bir patent membran, hiçbir blebbing ve algılanabilir ama büyük boyutlu değil çekirdeği ile nöronlar için bakın. Faz kontrast optik kullanılması durumunda da mavi değil, sarımsı-belirti ile faz-parlak nöronlar için. Istenen tuzlar, besinler, reseptör antagonistleri içeren ekstrasellüler çözümü ile Superfuse hücreleri, vb (standart yukarıda belirtilen Hepes-tamponlu salin (bkz. bölüm 3.1)), genellikle 5 mcM 2,3-dioxo-6-nitro-1 ile desteklenmiş 2,3,4-tetrahidrobenzo hızlı GABA izolasyonu sağlar inotropik glutamat reseptörleri bloke [f] quinoxaline-7-sülfonamid disodyum (NBQX) ve 25-100 mcM D-2-amino-5-phosphonopentanoic asit (AP5) reseptör-aracılı IPSCs 1,2. </li><li> Flaming-Brown veya eşdeğer çektirmenin kullanarak standart bir yama mikropipet çekin. Pipet ucu direnci M 2-4 (hedef hücre boyutuna bağlı olarak) bir Cl ile dolu olmalıdır - tabanlı bir çözüm. </li><li> Standart elektrofizyolojik teknikler kullanılarak görüntülenmiştir nöron bir tam hücreli kayıt oluşturulması. </li><li> Bir boşluk ücretsiz veri toplama protokolü kullanılarak spontan postsinaptik akımlar (sPSCs) kaydedin. 0,2-1 mcM tetrodotoxin ve / veya düşük Ca 2 + uygulayın ekstrasellüler çözüm içeren minyatür postsinaptik akımlar (mPSCs) kayıt için. </li><li> Çözümler ve farmakolojik ajanları, hücrelere doğrudan uygulanabilir. Biz bir step motor tahrikli mikromanipülatör üzerine monte edilmiş boru yanal hareket içeren bir çözüm değişimi ile kare uçlu erimiş cam tüpler yerel superfusion kullanın. Bu alloekstrasellüler moleküler içeriği hızlı değişimler, reseptör agonistleri uygulaması, vb elde etmek için 100&#39;ün üzerinde ms 10s çözüm alışverişi için </li><li> Akaike ve arkadaşları tek presinaptik BOUTONS 3,4 uyarmak için teknikler geliştirdik. Mikropipet görüntülenmiştir bouton yakın yerleştirilir ve stimülasyon (5-10 uA olumsuz uyaran akımları, 0.1-0.2 ms süresi) verilir. Üniter IPSCs kaydedilir ve presinaptik ve postsinaptik fonksiyon değişiklikleri incelemek için bu tür hataları yöntemi gibi yöntemler kullanılabilir. </li></ol> 5. Görüntüleme Presinaptik Terminalleri <ol><li> Postsinaptik nöron yama pipet ile çeşitli boyalar ile dolu olabilir. Nöronlar da seçili hücre popülasyonlarında yeşil floresan proteininin (GFP) gibi floresan proteinleri (FP) ifade farelerden alınan yapılabilir. </li><li> Belirli interneuron popülasyonlarda Çerçeve ifade farelerde yapılan vibrodissociated nöronların presinaptik terminaller üzerinde görselleştirilebilir olabilir. Örneğin, glutamat dekarboksilaz 65 (GAD65) hipokampal sepet hücreleri ve diğer internöronlar organizatörü gösterisi yeşil somata ve süreçler tarafından tahrik GFP ifade fareler. Hipokampal CA1 bölgeden Vibrodissociated piramidal nöronlar somata ve proksimal dendritler (Şekil 1A) apposed GFP pozitif akson terminalleri var. Ifade synaptopHlourin (pH hassas GFP mutant sinaptik vezikül ilişkili VAMP2 protein için erimiş) pH duyarlı floresans (Şekil 1B), FP-pozitif bağlı BOUTONS Thy1 promotör kontrolü altında olduğunu fareler vibrodissociated piramidal nöronlar. </li><li> Presinaptik BOUTONS AM-esterleşmiş bileşikler 5 kullanılarak kalsiyum göstergesi boyalar ve diğer floresan moleküller yüklü olabilir. Şekil 2 kalsiyum göstergesi boya Fluo4-AM kullanarak yükleme bir örnek gösterir. İlk önce, 1-2 mcM esterleşmiş boya, 10 dakika süreyle 37 ° nöronlara uygulanır. Boya, ücretsiz, hücre geçirgenliği olmayan ve unquenched boya verimli tutunmaya esterazlar molekülün hücre içi ortamı, içine nüfuz edebilir. Bu yaklaşım, hem de pre-ve postsinaptik hücresel elemanları yükler. Yükleme sonrasında, hücrelerin Hepes-tamponlu salin solüsyonu ile yıkanır ve ek bir 10 dakika için 37 ° &#39;de tuttu. Cam bir pipet elektrot ile bir GΩ-mühür yapmak için, önce hücrelerin dış tampon çözelti ile 3 defa durulanır. </li><li> A tam hücreli kayıt sonra boya içermeyen hücre içi bir çözüm ile kurulur. 2-5 dakika sonra kayıt boya çoğunlukla Fluo-4 yüklü sinaptik BOUTONS görselleştirme sağlayarak, postsinaptik nöron kaldırılır. Bu teknik, Ye ve ark 5 öncülük . </li><li> Boya yüklü BOUTONS sonra, ya bir kamera tabanlı veya multiphoton mikroskop ile yüksek büyütme, yüksek sayısal açıklık amacı ile görüntülenebilir. Eşzamanlı tam hücreli kayıt ve kalsiyum görüntüleme Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi bir kurulum kullanarak elde edilebilir. Nöron ve Şekil 2C olarak gösterilen BOUTONS bir elektron çarparak şarj bağlı cihaz (EMCCD) kamera görüntüleri ele geçirildi. Uyarma için ışık kaynağının gücü% 12 çıkışı için ayarlanabilir bir nötr yoğunluk 1.0 filtre ve iris filtresi ile% 1.2 &#39;ye zayıflatılmış oldu. Yeşil presinaptik BOUTONS Kalsiyum transientler gözlenen ve gerçek zamanlı olarak kaydedilen ve çevrimdışı ölçülür. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Vibrodissociated Nöronlar spontan ve Akım Enjeksiyon Uyarılmış Ateşleme Tipik bir vibrodissociated hipokampal CA1 piramidal nöron Kayıtlar Şekil 4A gösterilmiştir. Spontan overshooting aksiyon potansiyelleri sıçan bazolateral amigdala, hipokampus ve VTA 1,5 ayrı piramidal nöronlar görülebilir. Yeterli büyüklükte depolarizan akımların güçlü akım enjeksiyon yanıt olarak ılımlı mevcut seviyeleri ve non-konaklayan aksiyon potansiyelleri ile tipik gecikmeli ateşleme paterni ile overshooting aksiyon potansiyelleri ortaya akım enjeksiyon hiperpolarizan CA1 piramidal nöronlar sırasında mevcut klemp kayıtları, (tipik voltaj tepkilere neden Şekil 4B). Vibrodissociated Nöronlar spontan ve Minyatür GABAerjik inhibitör postsinaptik Akımlar CSCL tabanlı bir hücre içi çözümü ile gerilim-klemp kayıtları sırasında, spontan sinaptik akımlar (Şekil 5A) görülmektedir. Bu olaylar, düşük kalsiyum içeren çözeltisi 2,6 elimine ve en nöronal türleri tamamen GABA A reseptör antagonistleri, bicuculline veya gabazine (Şekil 5B, C) ​​olarak, GABA serbest bırakılması ve aktivasyonu aracılı sIPSCs belirten tarafından engellenir bu inotropik reseptör alt tipi. Ancak, bazolateral amigdala 2 ve ventral tegmental alan 5,7, GABA A reseptör blokajı gibi beyin bölgeleri esas nöronlarAMPA-tipi reseptörlerin glutamatergik aktivasyonu aracılığı ile kısa süreli EPSCs ortaya koymaktadır. İlginçtir, en toksin hassas voltaj kapılı sodyum kanallarının blokajı için özel konsantrasyonlarda TTX uygulama, bazı beyin bölgelerinde (Şekil 6A) 2,4,7 vibrodissociated nöronlar gözlenen sIPSCs frekans ve genlik azaltır . Bu nedenle, sodyum kanal aktivitesini sıkışmak-off sinaptik BOUTONS GABA sürümde katılır. Bu terminallerde tam gelişmiş sodyum aksiyon potansiyelleri ortaya çıkarsa henüz belli değil. Bu iyi bir mühürlü 1 mcM çaplı akson terminaline giriş direnci GΩ aralığı içine iyi olması muhtemel olduğunu kaydetti değerdir. Bu nedenle, sodyum kanalları bile az sayıda açılması uyarma salgılanması kaplin arabuluculuk kalsiyum kanalları etkinleştirmek için terminalleri depolarize için yeterli olabilir. Bu kalsiyum kanalları konuda, kanıt, N ve P / Q-tip kanalları hipokampal CA1 ve başka bir yerde 8 vibrodissociated hazırlıklarında GABAerjik terminallerinde serbest katılmak olduğunu göstermektedir . Nörotransmitterler ve reseptörleri sayısına göre modülasyon ve iletim plastisite vibrodissociated nöronlar kullanarak 3,4,9 incelenmiştir. Gibi düzenleyici eylemler olduğu gösterilmiştir nörotransmitterlerin adenozin, GABA, serotonin, endokannabinoidlerin, vb 2,6,10,11,12. Buna ek olarak, endokannabinoid bağımlı inhibisyonu (DSİ) depolarizasyon indüklenen bastırma gibi kısa vadeli sinaptik plastisite, aynı zamanda bu hazırlık 2,11 açıklanan olmuştur . Bu bulgular, endojen nöromodülatör reseptör-aracılı ve trans-sinaptik sinyalizasyon birçok formları vibrodissociated hazırlık bozulmamış olduğunu göstermektedir. Vibrodissociated Hazırlık Kalsiyum Geçici ve Axon Terminalleri veziküler Yayın Yukarıda tarif EMCCD donanımlı inverted mikroskop kullanarak, vibrodissociated nöron bouton hazırlanmasında presinaptik terminaller kalsiyum transientler inceledik. Şekil 2 hipokampal CA1 piramidal nöron AM-esterleşmiş Fluo-4 ve sonraki postsinaptik boya seyreltme hücre yükleme gösterir. Spontan kalsiyum geçişlerini Şekil 6B ilgi alanları (ROI) olarak gösterilen bazı boya dolu BOUTONS görülmektedir. 1 mcM tetrodotoxin (TTX) Uygulama sonraki kalsiyum yükselir, kendiliğinden BOUTONS aktive voltaj kapılı sodyum akımlarının aktivasyonu ile aracılı olduğunu belirterek, bu kendiliğinden transientler ortadan kaldırır. Presinaptik terminalleri (Şekil 7A) karşılık ROI&#39;ler ölçülen hızlı çözüm değişimi ile 40 mM, 10 mM ekstrasellüler KCl artırılması floresan artan üretir. Postsinaptik nöron aynı anda kayıt sIPSCs izlemek ve olay sıklığı yüksek-K + depolarizasyon (Şekil 7B) artış olup olmadığını belirlemek için kullanılır . SynaptopHlourin Thy1 organizatörü (spH21 fareler etiketli) kontrolü altında inşa ifade fareleri kullanılmıştır presinaptik BOUTONS vezikül füzyon görselleştirmek için. SynaptopHluorin bir moleküler yapı pHlourin (GFP gelişmiş pH duyarlılığı ile bir mutant) 12 Ekliptik vezikül ilişkili membran proteini (VAMP2) 13 ile bağlantılıdır. Bu düzenleme, nispeten daha asitli bir ortama floresan doyurur vezikül lümen pHlourin motifi situates. Vezikül füzyon üzerine, bu motifin veziküller / presinaptik terminaller uygun puncta floresan çıkan bir artış ile daha nötr ekstrasellüler ortama maruz kalmaktadır. SpH21 farelerden alınan hipokampal nöronların Vibrodissociation GABAerjik terminalleri (Şekil 8A) için beklenen boyutu ve konumu floresan puncta görünüm için izin verir. Uygulama yüksek K + - harici bir çözüm içeren bu terminallere floresan artar ve ekstrasellüler kalsiyum, 0.2 mM (Şekil 8B) azalır harici bir çözüm bulunması bu etkiyi bloke edilir . Böylece, floresan depolarizasyon kaynaklı artış, nöron bouton hazırlanmasında GABAerjik sinaps uyarma-sekresyon kaplin yansıtacak şekilde görünür. Presinaptik kalsiyum transientler ve nöron bouton hazırlık akson terminallerinde vezikül füzyon ölçmek için yetenek bize nöromodülatör istismar ve sinaptik plastisite uyarma-sekresyon kaplin ve ekzositoz / endositoz yer presinaptik mekanizmaları, ilaçların etkilerini incelemek için olanak sağlar. Bu teknikler aynı zamanda presinaptik işlevi ve modülasyon / plastisite, özellikle proteinlerin rolleri incelemek için, diğer moleküler araçlar ve genetik olarak fareler ile kombine edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 hipokampal CA1 bölgeden Vibrodissociated nöronlar DIC (A) Birleştirilmiş görüntüGAD65 fare nd yeşil floresan görüntüler. DIC görüntü (B) Floresan görüntü açıkça synaptophluorin (spH21) fare yeşil terminalleri yerleri göstermek için birleştirilir. Ölçeği bar = 10 mikron <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Kalsiyum göstergesi yükleme prosedürü: (A) tam hücre AM-esterleşmiş boya ile yüklü; (B) tam hücreli kayıt boya sulandırır; (C) terminalleri ilgi alanları (ok başları) olarak görünür. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 vibrodissociated nöronların presinaptik terminaller aynı anda tüm hücre kayıt ve kalsiyum görüntüleme için deney düzeneği şematik. EMCCD = elektron çarparak şarj cihazı birleştiğinde. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 Temsilcisi dalga şekilleri gösteren (A) spontan eylem vibrodissociated CA1 nöron potansiyelleri ve (B) membran gerilimi yanıtları hiperpolarizan ve bir CA1 nöron akım kelepçe kayıtları güncel enjeksiyonları depolarizan. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 (A) CA1 piramidal nöron kendiliğinden IPSCs Temsilcisi dalga şekilleri. Bicuculline (20 mcM C) (BC) IPSCs gabazine (B 10 mcM) ya da bloke edildi. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6 TTX spontan GABAerjik sinaptik iletim engeller ve vibrodissociated hipokampal hazırlık presinaptik kalsiyum geçişlerini ortadan kaldırır. (A) önce bir vibrodissociated nöron ve TTX uygulama sırasında Kayıt. Sıklığında azalma ve sIPSCs genlik unutmayın. (B) Kalsiyum transientler önce bir vibrodissociated nöron bir Fluo-4-yüklü presinaptik terminal ve TTX uygulama sırasında gözlenmektedir. Transientlerin tam kaybı unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7 Eşzamanlı kalsiyum gösterge görüntüleme ve yüksek K + stimülasyon etkilerini gösteren sIPSC tam hücreli kayıt. (A) Floresans Fluo 04:00 boya ile yüklü bir presinaptik bouton zamanla ölçülür. (B), sIPSC frekans ve genlik yüksek K + uygulama sırasında aynı anda artar. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig8.jpg" alt="Şekil 8" /> Şekil 8 Ca 2 +-bağımlı yüksek K + yanıt hipokampal CA1 bölgeden spH21 piramidal nöron presinaptik BOUTONS. (A) vibrodissociated bir nöronun Floresan görüntü. (B) High-K + uygulama (siyah çubuk ile gösterilir) normal ekstrasellüler Ca 2 + içeren bir çözüm (2 mM Ca2 +) varlığı floresan sürekli bir artış ile sonuçlanmıştır . Düşük ekstrasellüler Ca 2 + (0.2 mM Ca 2 +) floresan artış gözlenmiştir. Grafik veri ön-yüksek-K + floresan seviyeleri normalize ve 3 BOUTONS ortalama tepki göstermek.

<ol>
	<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+potentiates+gabaergic+synaptic+transmission+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala.">Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).</li><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+endocannabinoid+signaling+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala.">Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).</li><li>Akaike, N., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques:+Applications+of+the+nerve-bouton+preparation+in+neuropharmacology.">Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology.</a> Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).</li><li>Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+stimulation+of+single+gabaergic+presynaptic+boutons+on+the+rat+hippocampal+neuron.">Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron.</a> Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).</li><li>Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+glycine+receptors+on+gabaergic+terminals+facilitate+discharge+of+dopaminergic+neurons+in+ventral+tegmental+area.">Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area.</a> J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).</li><li>Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+5-ht3+receptor-mediated+modulation+of+synaptic+gaba+release+in+the+mechanically+dissociated+rat+amygdala+neurons.">Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons.</a> J Physiol. 529, 373-383 (2000).</li><li>Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+enhances+glutamate+transmission+by+retrograde+dopamine+signaling+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+the+ventral+tegmental+area.">Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).</li><li>Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+subtypes+on+single+gabaergic+presynaptic+terminal+projecting+to+rat+hippocampal+neurons.">Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons.</a> Brain Res. 951, 121-129 (2002).</li><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+synaptic+activity+produces+long-lasting+enhancement+of+endocannabinoid+modulation+and+alters+long-term+synaptic+plasticity.">Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity.</a> J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).</li><li>Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+contribute+to+metabotropic+glutamate+receptor-mediated+inhibition+of+gaba+release+onto+hippocampal+ca3+pyramidal+neurons+in+an+isolated+neuron/bouton+preparation.">Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation.</a> Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptophluorin.">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).</li></ol>

Başarılı vibrodissociation dilim sağlıklı nöron içeren ve interstisyel alanlarda nöronlar dilim toksik zarar vermeden çıkmak için izin verecek kadar esnek olduğunu gerektirir. , Sağlıklı bir dilim yetişkin beyin dilimleri daha az glial / interstiatial malzeme ile yapılabilir Böylece, tekniği, erken postnatal yaşları (P1-21) en iyi çalışır. Ancak, deneyimlerimiz nöronal hayatta kalmak için, kendisi vibrodissociation tekniği için ters olabilir dilim dilim hazırlık optimize. Biz rutin sakaroz çok ekstrasellüler Na + ve Ca 2 +, vibrodissociation için hazırlanan dilim normal kayıt aCSF hazırlanabilir (örneğin kesme) ikame edildiği soğuk değiştirilmiş aCSF kullanarak yerinde kayıt dilim hazırlamak Oysa. , Dilim kendilerini kayıt için bireysel nöronlar dilim hazırlanırken biz de 35 ° C sadece kesit sonra, normal aCSF dilimleri yerleştirin ve oda sıcaklığında onları dönmeden önce bu sıcaklıkta 30-60 dakika bırakın. Ancak, vibrodissociation için hazırlanan dilim sadece dilimleme sonra oda sıcaklığında hemen taşınır. Bu prosedürler, belki de nöronlar dilim kendisinden daha kolay gevşek çalkalanmalıdır sağlayan firma interstisyel doku eksikliği nedeniyle, vibrodissociation sonra sağlıklı nöronlar, bir daha yüksek verim sağlar. Biz rutin olarak, belirli bir günde kayıt ve görüntüleme deneyleri için yeterli nöronlar elde ince ayrıntısına kadar, dilim hazırlama koşulları incelenmiş değil. Kesit kalınlığı değişiklikleri veya preincubaton prosedürleri gibi ek değişiklikler, sağlıklı nöronların verimi artırmak için yapılmış olabilir mümkündür. Çok hafif proteaz tedaviler, hücre verimi artırmak ve yaşlı hayvanlarda çalışma tekniği almak için bir çaba içinde denenmiştir. Ancak, kaçınılmaz hatta hafif proteaz tedavi sinaps işlevini bozabilir görünüyor. Böylece, ise proteaz ve mekanik disosiasyon hala bugüne kadar ön beyin nöronları güvenilir kanıtlanmış değil çalışmak için bulunabilir kombinasyonu. Vibrodissociation teknik ağırlıklı çalışmak için bol miktarda nöron alt tipleri, özellikle projeksiyon nöronları yararlı olduğu anlamına gelir sonra sağlıklı nöronların nispeten düşük verim de dikkat edilmelidir. Kullanılabilirliği GFP ifade küçük nöronal alt popülasyonlar kolayca tespit edilebilir olan fareler bu nadir nöronlar eğitim şansını arttırır. Ancak, nöronal verim artırılabilir sürece bu nöronların veri birikimi önemli ölçüde göreceli olarak yavaş olması muhtemeldir. Birkaç adım kalsiyum algılama boyalar ile nöronların başarılı bir yükleme için çok önemli olduğu kanıtlanmıştır. AM-esterleşmiş boya maruz kalma, 37 ° C&#39;de yapılır ve daha düşük sıcaklıklarda boya-yük çalışırken başarısız olmuştur. Boyaların konsantrasyonu boya yükleme daha yüksek konsantrasyonda presinaptik BOUTONS kalsiyum konsantrasyonunu düşürür görünür beri yükleme süresi ve sıcaklığı göz önüne alınarak optimize edilmelidir. Biz yüksek konsantrasyonlarda yükleme sIPSCs frekans ve genliği azaldığını gözlemledik. Yüklerken kalsiyum algılama vibrodissociated nöronların presinaptik terminalleri içine boyalar, bakım, küçük bir presinaptik BOUTONS tampon kapasitesi soma daha farklı olabilir, çünkü alınan ve BOUTONS boyutları tutarlı değildir olmalıdır. Nöron içeren yemekler boya yükleme aşağıdaki Hepes tamponlu harici çözüm ile yıkanır ve yıkama sonrası iyileşme süresi çok önemlidir. Buna ek olarak, tüm hücre kayıt için iyi bir mühür yapmak, hücreler, dış hücre membranı olmayan içselleştirilmiş boya moleküllerinin kurtulmak için iyice yıkanır olması gerekir. Elektrofizyoloji ve canlı hücre görüntüleme için vibrodissociated nöronlar kullanmanın yanı sıra, bu hücrelerin 11,12 immünositokimyasal teknikleri de uygulanabilir. Hücreler kolayca sabit ve çeşitli antikor ve diğer hücre belirteçleri ile boyandı. Bu hücrelerin protein ekspresyonu GABAerjik presinaptik terminaller görünüm için temiz bir hazırlık sağlar. GABAerjik nöronlar özel yararlanıcı kontrol altında floresan proteinleri ifade fareler kullanma araştırmacı vibrodissociated hazırlık bireysel sinaptik terminalleri (Şekil 1) tanımlamanıza olanak sağlar. Bu tip Görüntüleme floresan işaretleri terminalleri lazer tabanlı mikroskopi ve STED gibi yeni teknikleri (Uyarım Emisyon tükenmesi Mikroskobu) ile morfolojik ölçümleri için izin verebilir. Sinaptik vezikül bisiklet rapor boya ile Görselleştirme hazırlanması da mümkündür. Akaike ve arkadaşları canlı hücreler 4 terminaller görselleştirmek için styryl boya, FM1-43 ile GABAerjik terminalleri etiketli. Ayrıca profil RNA ifade vibrodissociated içinde tek hücreli ters transkriptaz PCR gerçekleştirmek mümkün olmalıdırnöronlar. Bu teknik rutin hücre kültüründe yetişen enzimatik ayrışmış nöronlar ve nöronlar uygulanır.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog#</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vibrating Tissue Slicer</td>
 <td>Leica Microsystems Inc.</td>
 <td>VT1200S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell Culture Dish (35 mm)</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>353001</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Bottom Dishes</td>
 <td>Willco-dish</td>
 <td>GWSB-5040 Or GWSB-3522</td>
 <td>0.16-0.19 mm glass thickness for imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Piezoelectric Manipulator</td>
 <td>Exfo-Burleigh</td>
 <td>LSS-3000</td>
 <td>Could also use relay, etc.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SD9 Square Pulse Stimulator</td>
 <td>Grass Technologies</td>
 <td>SD9K</td>
 <td>For triggering piezoelectric manipulator</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting Stereoscope</td>
 <td>Wild Heerbrugg</td>
 <td>TYP 374590</td>
 <td>Could also use any stereoscope</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td>P-97</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW-150F-4</td>
 <td>For flame-sealed glass micropipette and patch micropipette</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Six Channel Perfusion Valve Control Systems</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>VC-6 or VC-6M</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion Fast-Step</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>SF-77B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope with 20-63x objectives</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>TS200 Diaphot</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EMCCD Camera</td>
 <td>ANDOR Technology</td>
 <td>iXonEM+ DU-888</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Excite Fluorescence Illumination Light Source </td>
 <td>EXFO Photonics Solutions Inc.</td>
 <td>X-Cite 120PC</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4, AM calcium indicator</td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>F14201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

vibrodissociation of neurons from rodent brain slices to study synaptic transmission and image presynaptic terminals

Merkezi sinir sistemi nöronları mekanik disosiasyon presinaptik BOUTONS ilgi izole nöron bağlı kalmasını avantaja sahiptir. Bu ekstrasellüler ve postsinaptik hücre içi ortamlarda iyi kontrol edilebilir koşullar altında sinaptik iletim muayene için izin verir. Vibrodissociation olarak bilinen proteazların olmayan bir titreşime dayalı bir tekniktir, mekanik izolasyonu için en popüler tekniktir. Mikropipet, küçük bir topu şeklinde yangın cilalı ucu ile P1-P21 kemirgen yapılan bir beyin dilim yerleştirilir. Mikropipet dilim yüzeyine paralel vibrasyonlu ve izole nöronların kurtuluş dilim kalınlığı boyunca indirilir. Izole nöronların vibrodissociation birkaç dakika içinde çalışmaya hazır. : Bu teknik, primer nöronal kültürlerin de dahil olmak üzere, beyin dilimleri ve enzimatik izole nöronların kullanımı üzerinde avantajları vardır; ekstraselüler ortamda üstün kontrol komşu hücrelerle etkisi; uygunluğu elektrofizyolojik ve görüntüleme çalışmaları için uygun, uygulanabilir, oldukça olgun nöronlar hızlı üretim ve geliştirilmiş dilim veya hücre kültürü hazırlanması nöronların göre tüm hücre kayıtları yer kelepçe; hızlı ilaç uygulaması ve toplam hücre superfusion kullanarak iyi kontrollü farmakolojik deneyler için. Bu preparat, sinaptik fizyoloji, farmakoloji, modülasyon ve plastisite incelemek için kullanılabilir. Gerçek-zamanlı görüntüleme, canlı hücreler ve BOUTONS hem de pre-ve postsinaptik elemanları vibrodissociated nöronlar da mümkündür. Pre-ve postsinaptik elementlerin moleküler bileşenlerin karakterizasyonu da immünolojik ve görüntüleme-temelli yaklaşımlar ile elde edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals at JoVE.com

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Bu rapor gösteriyor bağlı presinaptik BOUTONS istinat bireysel canlı nöronların mekanik izolasyon için kullanılan bir tekniktir. Vibrodissociated nöronlar, hızlı üretim, mükemmel farmakolojik kontrolü ve komşu hücrelerden etkisi olmadan gelişmiş uzay-klemp avantajlara sahip. Bu yöntem, sinaptik elemanları ve yama klemp kayıt görüntüleme için kullanılabilir.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

vibrodissociation-neurons-from-rodent-brain-slices-to-study-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.4K Görüntüleme.  National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Bu rapor gösteriyor bağlı presinaptik BOUTONS istinat bireysel canlı nöronların mekanik izolasyon için kullanılan bir tekniktir. Vibrodissociated nöronlar, hızlı üretim, mükemmel farmakolojik kontrolü ve komşu hücrelerden etkisi olmadan gelişmiş uzay-klemp avantajlara sahip. Bu yöntem, sinaptik elemanları ve yama klemp kayıt görüntüleme için kullanılabilir.

Video: Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması 1-42</subHipokampal Dilimleri Sinaptik Plastisite değer düşüklüğü> İndüksiyon

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Nörobilim

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and amphetamine), the role it plays in psychiatric illnesses (e.g. schizophrenia and Attention Deficit Hyperactivity Disorder), and its involvement in degenerative disorders like Parkinson's and Huntington's disease. Under normal physiological conditions, dopamine is known to regulate locomotor activity, cognition, learning, emotional affect, and neuroendocrine hormone secretion. One of the largest densities of dopamine neurons is within the striatum, which can be divided in two distinct neuroanatomical regions known as the nucleus accumbens and the caudate-putamen. The objective is to illustrate a general protocol for slice fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) within the mouse striatum. FSCV is a well-defined electrochemical technique providing the opportunity to measure dopamine release and uptake in real time in discrete brain regions. Carbon fiber microelectrodes (diameter of ~ 7 &mu;m) are used in FSCV to detect dopamine oxidation. The analytical advantage of using FSCV to detect dopamine is its enhanced temporal resolution of 100 milliseconds and spatial resolution of less than ten microns, providing complementary information to in vivo microdialysis.

Using fast-scan cyclic voltammetry to measure electrically evoked presynaptic dopamine dynamics in striatal brain slices.

Hızlı tarama Cyclic Voltametri striatal Beyin Slices presinaptik dopamin Dinamiği

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Lamprey Reticulospinal Aksonlar Akut Ayrılma Bireysel Fonksiyonel Presinaptik Terminalleri Yayın Yüz Membranından Kayıt Enable

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Synaptic Modülasyon Analizi<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...