Kollajen matriks testi son iki üç yılda pek çok farklı araştırma gruplarının çalışmaları ile geliştirilmiş ve iyileştirilmiştir. Dopaminerjik ve striatal eksplant için buraya açıklanan yaklaşımlar büyük ölçüde bu çalışmalar yarar. Ayrıca, yazarlar striatal eksplant kültürleri kurarken ona yardım için Asheeta Prasad teşekkür etmek istiyorum. Laboratuvarda çalışmalar İnsan sınır Bilim Programı Örgütü (Kariyer Geliştirme Ödülü) tarafından finanse edildi, Sağlık Araştırma ve Geliştirme Hollanda Örgütü (ZonMW-VIDI ve ZonMW-TOP), Europanian Birliği (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 Grant 222.999) (RJP için) ve Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü (TopTalent; ERES için).

1. Fare kuyruk kolajeni hazırlanması <ol><li> 6-10 yetişkin sıçan kuyrukları (kullanıma kadar -20 ° C&#39;de kuyrukları saklamak mümkündür) toplayın. </li><li> Oda sıcaklığında (RT) &#39;de bir gece% 95 etanol içinde kuyrukları emmek. </li></ol> Sıçan kuyrukları Diseksiyonu (doku kültürü kaputu): (Kullanmadığınız zaman% 70 etanol araçları tutmak ve bu işlem boyunca kullanılan tüm çözümler, araçlar ve cam eşyalar steril olduğundan emin olun) <ol start="3"><li> Kuyrukları gelen tendonların toplamak için, kuyruğunun ucunu kesti. Forseps bir çift kuyruk büyük ucunu tutun. , Tutun eğmek ve diğer forseps yakın kuyruk kırmak için forseps başka bir çift kullanın. Dışında çekin ve tendonlar (Şekil 1A, B) geride kalacak. </li><li> Steril H 2 O tendonlar toplayın ve tüm tendonları topladıktan sonra steril H 2 O ile yeni bir petridish taşıyın </li><li> 2-3 tendonlar alın ve 2 çift için kullanarak onları parçalamakSteril H 2 O. sahip yeni bir petridish in CEPS Bu damarlar (; Şekil 1C tendon dokusunun parlak ve yansıtıcı) gibi non-tendon dokusunun çıkarın. Olmayan tüm tendon dokusunun çıkarılmasından sonra, her kuyruk tendonların yaklaşık 100-150 mg verir. </li><li> Steril% 3 asetik asit 300 ml tendonlar aktarılır ve 4 de yavaş yavaş gece boyunca karışmaya ° C. </li><li> Steril% 3 asetik asit ilave bir 200 ml ilave edilir ve 4 de yavaş yavaş gece boyunca karışmaya ° C. </li><li> 4 120 dakika için 2700 x g&#39;de ~ tendonları içeren asetik asit solüsyonu ° C&#39;de santrifüje pelet çözünmemiş tendonları ve non-tendon dokuya. </li><li> Santrifüj sırasında diyaliz boru hazırlamak: <ul><li> 40 cm adet kesilmiş </li><li> 5 dakika boyunca 500 uM EDTA kaynamaya </li><li> Steril H 2 O serin </li></ul></li><li> Diyaliz boru bir ucunda bir düğüm ve bir otomatik pipett kullanılarak doku kültürü davlumbaz içinde buz üzerinde santrifüje tendonu çözeltisi süpernatant ile tüp dolgue ve 25 ml pipetle. Kabarcıkları üreten kaçının. Knot tüp tüm parçaları (Şekil 1D) buz üzerinde steril alüminyum folyo üzerine boru ve mağaza Tüpün diğer ucunu dolana kadar. </li><li> Doku kültürü kaputu steril 0.1x MEM, pH 4.0, 10 l hazırlayın. Hortumun parçalara Şamandıra ekleyin ve bir 10 l beher içinde önceden soğutulmuş 0.1x MEM çözeltisine bu ekleyin. Yavaş yavaş karıştırılarak ° C iken 4 geceleme Dialyze. PH düşük tutarken Bu diyaliz aşırı asit kaldırır. </li><li> Yeni ön soğutmalı 10 l 0.1x MEM ile değiştirin ve 4 gece boyunca karışmaya ° C </li><li> Yeni ön soğutmalı 10 l 0.1x MEM ile değiştirerek önceki adımı yineleyin ve 4 gece boyunca karışmaya ° C </li><li> Steril 50 ml tüpler içine tablet kollajen çözüm. 4 ° C de saklayınız alikotları 6-12 ay tutun, sadece doku kültürü kaputu kollajen stok anlaştım. </li><li> Bu saf kolajen kollajen MATR en iyi sonucu elde etmek için (0.1x MEM&#39;de) seyreltilerek gerekip gerekmediğini test etmek önemlidirix testi. Bu nedenle, bir kollajen inceltilmiş serileri oluşturmak (seyreltilmemiş kolajen, 1:1, 1:2 ve 1:5 seyreltilmiş) ve optimal kollajen seyreltme belirlemek için aşağıda tarif edildiği gibi kollajen matris deneyleri gerçekleştirmek. </li></ol> 2. Dopaminerjik orta beyin 7,8 diseksiyonu <ol><li> Annenin rahim E14.5 fare embriyoları inceleyin ve gerekli kadar buz üzerinde L15 ortamda saklayın. </li></ol> Tüm sonraki diseksiyon adımlar buz üzerinde L15 ortamda yapılmaktadır. <ol start="2"><li> Beynin parçalara ayır. </li><li> Her telencephalic vezikül (striatal eksplantları için telencephalic veziküller kullanın) medial kısmı boyunca keserek telencephalon çıkarın. </li><li> Meningeal kılıf çıkarın. </li><li> Mezensefalik eğme sadece rostral bir dorsoventral kesim olun. </li><li> Mezensefalik eğme sadece kaudal başka dorsoventral kesim olun. </li><li> Bir microdissectio kullanarak dorsal orta hat boyunca bir rostro kesim olunn bıçak yatan ventral orta beyin dokusunun açığa. Bu dopaminerjik nöronların (Şekil 2) içerir ventral orta beyin dokusu vurmak için dikkatli olun. </li><li> İki rostro kesimler lateral ve dorsal orta beyin doku kaldırmak için ventral orta hat paralel olun. </li><li> Bir mikrodiseksiyon bıçak kullanarak eksplantları içine kalan ventral orta beyin dokusu bölün. </li><li> Kullanılana dek buz üzerinde% 5 FBS içeren L15 ortamda eksplantlarının depolamak. </li></ol> 3. Striatum disseksiyonu Bütün Diseksiyon adımları buz üzerinde L15 ortamda gerçekleştirilir. <ol><li> Orta beyin diseksiyonu sırasında disseke telencephalic veziküller kullanın. </li><li> Talamus ve forseps kullanarak striatum arasında keserek talamus çıkarın. </li><li> Bu koku ampul gibi rostral yapıları kaldırmak için striatum bir mediolateral kesim rostral olun. Striatum kaudaline bulunan doku için bu adımı yineleyin. </li><li> Pozisyonstriatum bir koronal görünümü elde etmek için, geri kalan dilimli (Şekil 2). </li><li> Striatum bir doku (daha şeffaf) biraz daha az yoğun bir parçası olarak kabul edilebilir. Bir mikrodiseksiyon bıçak kullanarak eksplantları içine striatum ve kesip parçalara ayır. Lateral ve medial ganglionik eminens göç nöron içeren orta hatta biraz daha koyu doku yakın, kaçının. </li><li> Kullanılana dek buz üzerinde% 5 FBS içeren L15 ortamda eksplantlarının depolamak. </li></ol> 4. Meclis Kollajen Matrix Tahliller Kollajen hazırlanması (buz üzerinde tüm adımları, pipet uçları soğutmalı kullanın) <ol><li> 10x MEM 100 ul ve 1M sodyum bikarbonat 40 ul (NaHCO 3) ile seyreltilmiş kolajen 860 ul karıştırın ve buz üzerinde tutun. Bu noktada kollajen ısınır Eğer pekiştireceğiz. </li><li> Bir 4-de Nunc çanak iyi bir coverslip üzere hazırlanmış kolajen 20 ul&#39;lik bir damla (çapı yaklaşık olarak 5 mm) ekleyinve bu 37 azından bir CO2 inkübatöründe bekletilir ° C&#39;de ve% 5 dakika 30 (ortam O 2 konsantrasyonunun yeterli olduğu) için CO 2. Bu kuluçka sırasında kollajen jölelemek olacaktır. </li></ol> Kollajen jel Kurulum ko-kültür <ol start="3"><li> Kollajen jelatinize sonra kollajen bir dopaminerjik veya striatal eksplant aktarmak için 200 ul ucu ile bir pipet kullanın. </li><li> Bir iğne ile birbirine yakın eksplantlarının taşıyın. Bir eksplant (~ 200-300 um) (Şekil 2) yaklaşık çapı bir mesafede birbirinden biraz tutmak. </li><li> Aşırı orta çıkarın ve eksplant üstüne hazırlanmış kollajen 20 ul ekleyin. Bu genellikle eksplantlarının etrafında hareket etmesine neden olacaktır. 4.4 &#39;te açıklandığı gibi bir iğne kullanılarak eksplantlarının konumlandırmak. </li><li> Kollajen 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 azından 30 dakika takiben oda sıcaklığında 15 dakika boyunca katılaşmaya edelim. </li><li> Kollajen kurdu sonra, e 400 ul ekleyinxplant orta ve 37 bir CO2 inkübatöründe 2-3 gün büyümeye ° C&#39;de ve% 5 CO2. </li></ol> 5.. İmmünohistokimya ve Niceleme tarafından Analizi İmmünohistokimya <ol><li> Eksplantları düzeltmek için, yavaşça orta 400 ul (böylece% 4 PFA sulandırarak) ile PBS içinde% 8 paraformaldehit 400 ul (PFA) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat bekletin. </li><li> RT de PBS 3x 15 dakika yıkayın. </li><li> Tampon engelleme inkübe (BB; PBS +% 1 FBS +% 0.1 Triton X-100) 2 saat boyunca. </li><li> 4 ° C&#39;de BB primer antikor ile bir gece boyunca inkübe Dopaminerjik aksonlar striatal akson anti-DARPP32 antikorlar (1:500) 9 ve tüm aksonlar anti-βIII tubulin (1:3000) 7 görselleştirmek için anti-tirozin hidroksilaz antikor (1:1000) 7, kullanın. </li><li> RT de PBS ile 5x 1 saat yıkayın. </li><li> 4 &#39;de bir gece BB uygun fluorofor (1:500) ile konjuge sekonder antikor ile birlikte inkübe° C. Bu adımdan eksplantlarının maruziyeti en aza indirmek için ışık (örneğin, alüminyum folyo ile bunları kapatın). </li><li> 4 de, PBS içerisinde gece boyunca yıkanır ° C sonraki gün içinde birkaç yıkama izledi. </li><li> Mikroskopta eksplantlarında Dağına Antifade reaktif orta montaj Prolong kullanarak kayar. Cam bir mikroskop lamı üzerine ~ 10 ul bir damla ekleyin. Coverslip alın ve yavaşça aşağı bakacak eksplant tarafı montaj orta damla üzerine yerleştirin. Çok nazik montaj orta damla üzerine düşürerek de coverslip altında herhangi bir hava yakalama kaçının. </li></ol> P / D oranı hesaplanarak Sayısallaştırma <ol start="9"><li> Bir Epifloresans mikroskobu (Şekil 3) kullanarak eksplantlarının dijital görüntüler elde edin. </li><li> Bu görüntüleri kullanarak, proksimal kadran (bitişik eksplant en yakın eksplant yani parçası) ve distal kadran (bitişik expla en uzak eksplant parçası üretmek için parçaya bölünür, her eksplant bölmeknt) (Şekil 2, 4). </li><li> Proksimal ve distal kadranda hem eksplant çıkan 20 uzun neurites uzunluğunu ölçün. </li><li> Her eksplant için P / D oranı hesaplamak için 20 en uzun neurites ortalama uzunluğu kullanın. Bir oran &lt;1 akson itme gösterir iken AP / D oranı&gt; 1, akson cazibe gösterir. </li><li> Bazı durumlarda, neurites ile yoğun bir büyüme bireysel nörit uzunluğunun değerlendirmesi önler. Bu durumlarda, nicel eksplant kenarı ve proksimal ve distal kadranlardaki akson büyüme öncü ön arasındaki mesafenin ölçülmesi ile gerçekleştirilebilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Görüntüler Dopaminerjik ve striatal eksplantlarının başarılı bir kültürden sonra akson çok sayıda (gösterilmemiştir) parlak saha mikroskobu kullanılarak görünür ya da anti-βIII tübülin immünsitokimya tarafından olarak görüntülenmiştir vardır. Bu aksonlar bir alt dopaminerjik veya s olacak<html> görüntülenmiştir kullanarak immünsitokimya olarak triatal aksonlar (Şekil 3). Açıklandığı gibi parçaya bölünür eksplantlarının bölünmesi ve P / D oranları belirlenerek, varsayılan bir akson çekici veya itici etkisi (Şekil 3E) ölçülebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" /> Şekil 1. Sıçan kuyruk tendon gelen kollajen hazırlanması gösteren Foto. Sıçan kuyruğu dışında Çekme A) tendonları ortaya koyar. B) Tendonlar halat benzeri paketler olarak görülebilir. C) tendonları kendi parlak beyaz görünüme damarları ayırt etmek kolaydır. D) asetik asit içinde çözülmesi tendonlar sonra, çözelti diyaliz boru transfer edilir. Çözünmüş kollajen soğuk tutmak için, tüpler buz üzerine steril alüminyum folyo yerleştirilir. e 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Prosedürünün farklı adımları gösteren şematik. Uygun beyin bölgelerinde disseke ve eksplant oluşturmak için kesilir. A tek bir orta beyin ve striatal eksplant kollajen bir matris olarak yakın bir şekilde konumlandırılır ve 37 ° C&#39;de 48-72 saat boyunca büyümeye bırakılmıştır Aksonlar floresans immünohistokimyasal canlandırırlar ve bir P / D oranı chemotropic tepkileri ölçmek için hesaplanır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" /> Şekil 3. Bir kollajen matriks kültür akson büyüme gösteren Temsilcisi sonuçları. A) orta beyin eksplant anti-tirozin hidroksilaz antikor akson akıbet ifşa ile boyandı. Noktalı çizgi bitişik eksplant gösterir. A gösteren bireysel neurites ve büyüme konileri (oklar) B) Büyütme. C) striatal eksplant anti-DARPP32 ile boyandı. D) C Büyütme bireysel neurites gösteriyor. D) ÖrnekP / D oranı ölçümü. Eksplantlarından eşit parçaya bölünür ayrılır. Distal kadranda ondan karşı karşıya iken proksimal kadranda bitişik eksplant ile karşı karşıyadır. Ölçek çubukları 100 mikron göstermektedir.

<ol>
	<li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+connected+in+the+dopamine+system.">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li><li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past,+present,+and+future.">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li><li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li><li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation,+channeling,+rostral+growth,+and+intracortical+targeting.">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li><li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/planar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem.">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li><li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum.">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li><li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Kollajen matriks testi burada açıklanan (örneğin referanslar 5-8 bakınız) akson rehberliği moleküller ve nöronal sistemler çeşitli araştırmak için geçmiş yıllarda pek çok farklı laboratuvarlar tarafından kullanılmış ve geliştirilmiştir. Bu çalışmalar bu testte etkileri ve farklı (orta) hedef dokular tarafından salgılanan akson rehberliği moleküllerin düzenlenmesi çalışmaları için güçlü bir araç olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, kolajen mat...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Fötal Buzağı Serumu </td><td> Biowhittaker </td><td> 14-801F </td><td></td></tr><tr><td> Glutamin (200mm) </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR International </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Merck </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Medya (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 Orta </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Altın Antifade Reaktif Prolong </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> Diyaliz boru </td><td> Spektrum Labs </td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan anti-Tirozin hidroksilaz </td><td> Pel-Freez </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan anti-Darpp32 (H-62) </td><td> Santa-Cruz </td><td> Sc-11.365 </td><td></td></tr><tr><td> Fare anti-βIII tübülin </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor sekonder antikorlar etiketli </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and culture of mouse dopaminergic and striatal explants in three-dimensional collagen matrix assays

Striatum 1 dahil telencephalon çeşitli alanlarda, doğru medial ön beyin demeti ile orta beynin dopamin (mdDA) nöronlar projesi. Karşılıklı olarak, striatonigral (direkt) yol yol striatumda orta dikenli nöron substantia nigra 2 innerve. Bu akson yollarının geliştirilmesi akson büyüme ve neurites veya (orta) hedef bölgelerde 3,4 ile yayımlanan moleküllerini içeren rehberlik ipuçları bir bolluk kombinatoryal eylemleri bağlıdır. Bu faktörler çözünebilir ekstraselüler ortamı taklit aksonlardan için bir üç-boyutlu yüzey sağlar kollajen bir matris içinde kültürlenmesi mdDA ve / veya striatal eksplantları tarafından in vitro olarak ele alınabilir. Buna ek olarak, kolajen matris civarı (örn. referanslar 5 ve 6&#39;ya bakınız) yerleştirilir, diğer aşılar veya hücreler tarafından yayımlanan proteinlerin nispeten kararlı gradyanlar oluşumu için olanak sağlar. Burada pur için yöntemler tarifkollajen jeller ve sonraki immünohistokimyasal ve kantitatif analiz, fare kuyruk kolajeni, dopaminerjik ve striatal eksplantlarının mikrodiseksiyon, kendi kültür ification. Birincisi, E14.5 fare embriyolarının beyin izole ve dopaminerjik ve striatal eksplant microdissected edilir. Bunlar daha sonra eksplantları (CO), in vitro 48-72 saat boyunca lamelleri üzerine kollajen jeller kültürlenmiştir. Daha sonra, aksonal projeksiyonlar nöronal belirleyicileri (örneğin tirozin hidroksilaz, DARPP32 veya βIII tubulin) ve akson büyüme ve çekici veya itici akson yanıtları sayılabilir ve kullanarak canlandırırlar. Bu nöronal hazırlık gelişimi sırasında mesostriatal ve striatonigral akson büyüme ve rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmalar in vitro çalışmalar için yararlı bir araçtır. Bu tahlil kullanarak, dopaminerjik ve akson striatal için diğer (ara) hedefler değerlendirmek için ya da belirli bir moleküler kuyrukları test etmek de mümkündür.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays at JoVE.com

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Ortabeyin dopamin sistemi ve striatum gelen Eksplantlarından için bir kollajen matris deneyde kullanılır<em&gt; In vitro</emMesostriatal ve striatonigral yolunun gelişimi&gt; analizi. Bu deneyde aksonal üremeyi ve rehberlik manipüle ve ölçülebilir. Aynı zamanda diğer bölgeler veya moleküler ipuçlarını değerlendirmek için modifiye edilebilir.

Fare Dopaminerjik ve Üç Boyutlu Collagen Matrix Tahliller striatal Eksplantlarından diseksiyonu ve Kültür

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

dissection-culture-mouse-dopaminergic-striatal-explants-three

Research

JoVE Journal

Neuroscience

25.6K Görüntüleme.  University Medical Center Utrecht. Ortabeyin dopamin sistemi ve striatum gelen Eksplantlarından için bir kollajen matris deneyde kullanılır In vitro analizi. Bu deneyde aksonal üremeyi ve rehberlik manipüle ve ölçülebilir. Aynı zamanda diğer bölgeler veya moleküler ipuçlarını değerlendirmek için modifiye edilebilir.

Video: Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Diseksiyon ve Chick Statoacoustic Ganglion ve Kollajen Jeller Omurilik eksplantlar Kültür Neurite akıbet Tahliller

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Kültür Bulaşık A Fonksiyonel Motor Birim: Omurilik Eksplantlarından ve Kas Hücrelerinin Co-kültür

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample testing. Rapid BoNT testing of foodstuffs is needed during outbreak forensics, patient diagnosis, and food safety testing while accurate potency testing is required for BoNT-based drug product manufacturing and patient safety. The widely used mouse bioassay for BoNT testing is highly sensitive but lacks the precision and throughput needed for rapid and routine BoNT testing. Furthermore, the bioassay&#39;s use of animals has resulted in calls by drug product regulatory authorities and animal-rights proponents in the US and abroad to replace the mouse bioassay for BoNT testing. Several in vitro replacement assays have been developed that work well with purified BoNT in simple buffers, but most have not been shown to be applicable to testing in highly complex matrices. Here, a protocol for the detection of BoNT in complex matrices using the BoTest Matrix assays is presented. The assay consists of three parts: The first part involves preparation of the samples for testing, the second part is an immunoprecipitation step using anti-BoNT antibody-coated paramagnetic beads to purify BoNT from the matrix, and the third part quantifies the isolated BoNT&#39;s proteolytic activity using a fluorogenic reporter. The protocol is written for high throughput testing in 96-well plates using both liquid and solid matrices and requires about 2 hr of manual preparation with total assay times of 4-26 hr depending on the sample type, toxin load, and desired sensitivity. Data are presented for BoNT/A testing with phosphate-buffered saline, a drug product, culture supernatant, 2% milk, and fresh tomatoes and includes discussion of critical parameters for assay success.

The BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detection assays rapidly purify and quantify BoNT from a range of sample matrices.&#160;Here, we present a protocol for the detection and quantification of BoNT from both solid and liquid matrices and demonstrate the assay with BOTOX, tomatoes, and milk.

BoTest Matrix Tahliller kullanma Kompleksi Matris itibaren İzolasyon ve Botulinum nörotoksin Kantitasyonu

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

Ek Motor Alanında Fiber Bağlantıları Gözden Geçirildi: Fiber Disseksiyonu Metodolojisi, DTI ve Üç Boyutlu Dokümantasyon

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...