Bu protokol, beyindeki çeşitli devrelerin yetişkin nörogenezini nasıl düzenlediğini ve özellikle sinir seli uyarıcı veya inhibe edici sinir sellerinin yetişkin nöral kök hücrelerinin çoğalmasını nasıl etkilediğini cevaplayabilir. Bu tekniğin avantajı, özellikle istenilen sinir devrelerini hedef leyabildiği gibi hayvanlara getirilen stres miktarını da azaltabilmesidir. Bu yöntem, farklı beyin devrelerinin yetişkin nörogenezini nasıl düzenlediğine dair içgörü sağlayabilir, özellikle de bazı nörotransmitterleri serbest eden belirli hücre tiplerinin yetişkin nöral kök hücre proliferasyonlarını nasıl düzenlediğini.
Bu yordamı başlatmak için, PBS doku bölümleri yerleştirin ve arka için ön seri sırada olumlu yüklü slayt üzerine beş ila sekiz bölüm monte. Doku bölümleri oda sıcaklığında 2-5 dakika kurumaya bırakın ve tamamen slaytlar yapışır. Ardından, bir kapta sitrat arabelleği hazırlayın.
Sitrat tamponu mikrodalga fırında çözelti kaynayana kadar beş dakika ısıtın. Bu arada, monte edilmiş bölümleri cam bir kaydırak tutucuya yerleştirin. Beş dakika sonra, dikkatlice bir pipet kutusuna bölümleri ile slayt tutucu yerleştirin.
Mikrodalga fırın gücünü %50'ye, pişirme süresini ise 7 dakikaya ayarlayın. Yedi dakika için bir zamanlayıcı başlatın ve çözümü izleyin. Çözelti kaynamaya başladığında mikrodalga fırını durdurun ve kaynama durduktan sonra mikrodalgaya devam edin.
Mikrodalgadaki pişirme süresi bitmemiş olsa bile zamanlayıcı bittikten sonra durun. Bu adımın amacı, suyun aşırı kaynamasına izin vermeden suyu kaynama sıcaklığının hemen altında tutmaktır. Çok fazla kaynama slayt doku bölümleri kaldıracaktır.
Sonra, sitrat tampon ve doku slaytlar ile sıcak kutu transfer soğutma için bir buz kovası. Kutunun üzerini kapatın ve timinin analog boyama işlemine geçmeden önce yaklaşık 30 dakika veya çözelti soğuyana kadar bekleyin. Timidin analog ile doku bölümleri leke için, sitrat tampon doku bölümleri kaldırın.
Bir hidrofobik kalem ile bir sınır çizmeden önce doku bölümleri kuru ve tamamen slaytlar yapışır. Daha sonra, permeabilization tampon ile bölümleri 20 ila 30 dakika geçirin. TBS-triton kullanarak bölümleri her seferinde beş dakika yıkayın.
Sonra, bir Edu reaksiyon çözümü hazırlayın. Edu reaksiyon çözeltisindeki bölümleri 30 dakika ile bir saat arasında kuluçkaya yatırın. Daha sonra, beş dakika her zaman TBS-triton üç kez yıkayın.
Bu adımdan sonra slaytları alüminyum folyoyla kaplayın veya ışıktan korumak için ışıkla korunan bir odaya yerleştirin. Bu aşamada, Edu reaksiyonu floresan mikroskop kullanarak çalışıp çalışmaz kontrol edin. Reaksiyon işe yarıyorsa edu etiketli hücreler eve gitmeli.
Şimdi, ikincil antikor la aynı hayvanda yükseltilen tamponu 30 dakika ile bir saat arasında bloke ederek monte edilmiş doku bölümlerini kapatın. Daha sonra, her seferinde beş dakika tbs-triton iki kez yıkayın. Engelleme adımı sırasında, tampon engelleme birincil antikor karıştırarak birincil antikor çözeltisi hazırlamak.
Daha sonra, doku bölümleri tamamen batık olduğundan emin olmak için slayt başına primer antikor çözeltisi 250 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında bir gecede onları kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, aşırı primer antikor kaldırmak için beş dakika her tbs-triton doku bölümleri üç kez yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında iki saat boyunca tampon çözeltisi engelleme hazırlanan florofor konjuge ikincil antikor doku bölümleri kuluçka.
Aşırı sekonder antikor kaldırmak için beş dakika her biri için TBS-triton doku bölümleri üç kez yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında 15 dakika pbs 1 ila 100 300 mikromolar DAPI çözeltisi uygulayın. Daha sonra, fazla DAPI kaldırmak için beş dakika pbs doku bölümleri üç kez yıkayın ve bir pamuklu bez kullanarak doku etrafında PAP kalem daire kaldırın.
Montaj ortamını uygulamadan ve kapaklarla örtmeden önce bölümleri kurutun. Görüntüleme yazılımını kullanarak, her dentate girus bölümünün görüntüsünü, ayrı renklerde birleştirilmiş kanallarla bileşik bir görüntü olarak açarak kolokalizasyonu kolayca görselleştirin. Ardından, çokgen seçim aracını kullanarak her bölümdeki dentate girus alanını ölçün ve her farenin tüm bölümlerini kaydedin.
Bu yoğunluk hesaplamak için kullanılan dentate girus alanı olacaktır. Eklentiler altında bulunan yazılım eklentisi hücre sayacı nı kullanarak, Analiz, Hücre Sayacı, Hücre Sayacı, kompozit görüntüden birincil antikor ve timidin analog Edu'yu kolokalize eden dentat girustaki hücre sayısını kaydedin. Ayrıca, radyal bir süreç ile Edu-pozitif ve nestin-pozitif hücrelerin toplam sayısını kaydedin.
Nestin durumunda, hücrelerin morfolojisine dikkat etmek çok önemlidir. Nöral kök hücreleri ölçüyorsanız, yalnızca radyal işlem gösteren hücrelerin sayısallaştırDığından emin olun. Daha sonra analiz için tüm verileri derlemek için bir elektronik tablo yazılımıhücre sayımları girin.
Örneğin, kök hücre yoğunluğunu elde etmek için nestin-pozitif ve Edu-pozitif hücrelerin toplamını her hayvandaki dentat girus hacminin toplamına bölün. Her adımın bir mikrometre olduğunu varsayarak, alanı toplam Z adımı artışlarıyla çarparak her bölümün hacmini hesaplayın. Bu protokolde doku 40 mikrometrede kesitli olduğundan toplam adım 40'a yakın olmalıdır.
Daha sonra, çoğalan hücrelerin toplam sayısını hesaplamak, nöral kök hücrelerin çoğalan yüzdesi, ve kontralateral yosunlu hücreleri uyardıktan sonra toplam çoğalan hücreler. Nestin boyama için timidin analog Edu ve antijen alma kullanılarak çoğalan nöral kök hücreler başarıyla etiketlendi. Ayrıca, antijen alma adımı atlayarak, Tbr2-pozitif nöral progenitör ve nöroblast ve DCX-pozitif nöroblast ve olgunlaşmamış nöronlar etiketlendi.
Burada ölçülen ve hücre yoğunluğunu hesaplamak için kullanılan alan bir örnektir, ve burada bir slayt üzerine monte doku bir örnektir. Hem başarılı hem de alt-par deneylerkarşılaştırma için gösterilir. Son olarak, başarılı bir deney elde edilebilir birkaç farklı nicelik vardır.
Nicelikler arasında çoğalan nöral kök hücrelerin yoğunluğu, çoğalan nöral kök hücrelerin yüzdesi, toplam çoğalan hücreler ve toplam kök hücre havuzu yer alıyor. Yosunlu hücrelerin kontralateral uyarılması üzerine nöral kök hücre proliferasyonunda azalma gözlendi. Bu işlemin en önemli adımı mikrodalga fırında kaynayan doku kontrolüdür.
Çok uzun süre kaynayan doku bölümleri zarar göreceksiniz. Bu işlemi takiben, aynı devreyi hedeflemek için farklı viral vektörler enjekte edilebilir. Örneğin, bir sinir devresi uyarıcı olsaydı, bir inhibitör DREADD virüs kullanarak inhibe olabilir.
Bu protokolde sunulan teknikler yeni değildir. Ancak, bu protokolün gücü kapsamlı devre yetişkin nörogenezi nasıl etkilediği hakkında soruları cevaplamak için gerekli tüm adımları kapsamaktadır.
