PDK CIHR işletim hibe (MOP 86.523) tarafından desteklenen

1. Cerrahi Teknik <ol><li> Aseptik teknik kullanılarak deneyler ve özel kurum hayvan kullanımını protokolleri takip yapılmalıdır. Canlı doku ile temas eden alet ve malzemeler (çözümleri, test maddeler, izleyiciler, iğne, vb), hayvan refahı ve çalışma üzerindeki olası olumsuz etkileri üzerinde enfeksiyon ve olumsuz etkilerini önlemek için steril olmalıdır. </li></ol> 2. Anestezi <ol><li> Sıçanlar bir veteriner izofluran buharlaştırıcı sistemi kullanılarak anestezi olacaktır. Isofluran gaz buharlaştırmak için 0.8 L / dak hızında tıbbi sınıf oksijen kullanın. Ekli anestezi kutusunda hayvan koyun ve nefes yavaşladı ve hayvan oturaklı kadar izofluran konsantrasyonu% 4 çevirmeli. </li><li> Sonra, stereotaksik çerçeve için gaz maskesi ek gaz akışını değiştirmek ve stereotaksik aparat hayvan. Izofluran konsantrasyonu% 2 aşağı çevirin ve anestezi monitör. Büyük hayvanların (&gt; 300g) yüksek konsantrasyonda izofluran bir gerektirebilir. Anestezi, ameliyat sırasında takip ve izofluran dozu buna göre ayarlanması gerekir. Derinlik ve nefes alma oranı sürekli olarak değerlendirilir ve derin bir ağrı olmaması için ayak tutam değerlendirme (her 5 dakikada bir) yapılmalıdır. </li><li> Ameliyat tamamlandıktan sonra, izofluran kapatın ve hayvan stereotaksik cihazdan çıkarılması önce birkaç dakika nefes oksijen izin. Vücut ısısı, cerrahi battaniye ve / hayvan kapsayan ya da operasyon sırasında düzenli bir ısıtma battaniye kullanarak sağlanmalıdır. </li></ol> 3. Cerrahi Yaklaşım <ol><li> Kürk kürk kesmek kolay hale getirmek için% 70 etanol ile baş üstünde ıslak. Clipper ya da keskin bir makas kullanarak gözler arasında kürk çıkarın. Iyot deterjan solüsyonu,% 70 etanol alternatif uygulamaları (Proviodine, Betadine, vb) ile kesi alan üç kez temizleyin. Kornea kornea oftalmik göz merhemi (Tears Naturale PM) uygulanarak ameliyat boyunca nemli koruyun. , Kornea, göz kapaklarında el açılış ve kapanış yüzeyi üzerinde merhem sürün. </li><li> No: 11 bıçak kullanarak, gözlerinin arkasında 1 cm gözleri önünde yaklaşık 0,5 cm baş orta hat boyunca bir kesi yapmak. Cilt kapağı forseps kullanarak göz üzerinden çekin ve yavaşça neşter arkasında yatan bağ dokusu uzak kızdırmak. Daha sonra, yanal ve cilt kapağı aşağıya doğru geri çekin ve stereotaksik enstrümanın temel bantlanmış olabilir cerrahi retraktörü ile yerinde tutun. </li><li> Keskin forseps ile örten fasya çekerken orbital kemik üstün kenarı boyunca bir kesi olun. Bu göz yörünge üzerinde fasya çekilecek. Orbital kemik jant açıkça forseps kullanarak yörünge üzerinde fascia aşağı itmek tarafından sınırları çizilmiş olabilir. Koter cihazı veya bisturi kullanarak, göz yörüngesine arka sınıra geri kesi devam etmektedir. Kesi için bir rehber olarak üstün yörüngesinin kemik kullanın. Sonraki yörüngesinin anterior sınırı kesi ileriye doğru devam edin. En üstün yörüngesinin insizyon venöz sinüsler ile iletişim altta yatan damarlarında kanama önlemek için küçük bir koter cihazı kullanılarak yapılır. </li><li> Kanama olursa birkaç adım alınabilir. Birincisi, steril cerrahi çubuklar veya pamuklu çubuk kullanarak basınç uygulayın. Kanama devam ederse, soğuk, steril fosfat buffer salin (PBS), bir damlalık kullanarak alana uygulamak ve basınç korumak. Bu yordamı kullanarak birkaç saniye sonra ufak bir kanama duracaktır. Kanama devam ederse, kanama kaynağını belirlemek ve hızlı bir şekilde tehlikeye gemi dağlamak için cerrahi bir bez ya da pamuklu dokusu çekiş geçerlidir. Kanama içerdiği sonra, kan cerrahi alanını temizlemek için soğuk steril PBS kullanın. Cerrahi alan, periyodik olarak yapıları göz yörüngede daha iyi görselleştirmek için bu moda temizlenmesi gerekir. </li><li> Kesi temizlendikten sonra, yörünge içeriği üzerine, gözün arka bağ dokuları temizlemek için forseps ve neşter arka kullanın. No: 11 neşter arka ucu ince olduğu gibi iyi çalışır. Bu yörünge boşluğuna yörüngede yapıların güçlendirilmesi için idealdir, eğrilik ve ince ipuçları gibi göz çalışırken kullanın Dumont # 7b keskin kavisli-dişli forseps çalışmak için daha büyük bir cerrahi bir pencere daha derin kısımları açılacaktır. Ayrıca, çentikler sürükleyici yapıları ile yardımcı olur. </li><li> Sonra, orta hatta yakın oturan trigeminal sinirin oftalmik bölümünü çevreleyen bağ dokusu kaldırmak ve forseps kullanarak sinir kaldırmak. Bu adım gerekli değildir, ancak sinir kaldırarak acces daha büyük bir pencere sağlayacakDaha sonra optik sinir s. </li><li> Sinir çıkarıldıktan sonra, aşağıda kan damarı geri çekmek için forseps kullanabilir ve gemi tamamen dağlamak. Bu adım da gerekli değildir, ancak geminin koter ve böylece daha büyük bir pencere oluşturarak optik sinir ulaşıldığında, öne taşınmasına neden olur. </li><li> Ipuçları, ekstraoküler kasların ve gözyaşı bezi üzerinde dikkatle bağ dokusunun ince bir tabaka almak ve kaldırmak için içe eğilmişti keskin forseps çifti, ya da forseps kullanın. Yörüngesinin posterior anterior ekstra oküler kasların geri çekin. Forseps bir çift kas proksimalinde Grip ve kas dışa çekiş uygulamak için ikinci bir çifti, eğimli dişli göz soyunma forseps kullanabilir. Yırtılmasını önlemek amacıyla çekerken göz soyunma forseps kas aynı yönde odaklı olduğunu emin olun. Bu şekilde yörüngede (Superior Eğik) en anterior kas çıkarın. Kas yörünge içinde derin kurtarılmış olacak ve kalan uzunluğu gözün dışa döndürmek için geri çekilebilir. </li><li> Göz dorsal yüzeyinin orta hat yakınında lakrimal bez ve Harderian Bezi loblar arasında yer alan bir sonraki kas (medial Rektus) Adım 3.8 tekrarlayın. Teyp retraktörü aşağı çekiş kaslar üzerine korumak için. </li><li> Lakrimal bez yüzeyi üzerinde kalan herhangi bir bağ dokusu yavaşça kaldırın ve forseps kullanarak bezi yukarı kaldırın. Bezinin sıkıştırmak veya sıkmak etmeyin. Bezi geri çekmek için sadece tek bir gemi, arka kutupta koterize gerekir. Yukarı bezinin arka ucunu kaldırın ve ardından geminin dağlamak. </li><li> Sonra, yörüngesinin arka kısmı açık ve optik sinir örten kaslar için engelsiz erişime izin vermek için ileri lakrimal bez, flap. Sürekli nemli steril PBS ve cerrahi çubuklar veya pamuklu kurutma tutun. </li><li> Keskin forseps kullanarak arka yörüngede (levator Palpebrae Superioris ve Superior Rektus) kasları çevreleyen ince bir bağ dokusu bir kez daha kaldırmak ve altta yatan kas demetleri ayrı. Kavisli tırtıklı göz soyunma forseps kullanarak, bağımsız olarak veya ağızdan kasları geri çekin, bir kez daha, kas lifleri ile çizgi çekerek. Retraktörü aşağı Adımlar 3.8 ve 3.9 ve teyp çekiş uygulamak için geri çekilir kasları ile birlikte kalan kas uzunlukları retraktörü takın. Toplam 4 kasların retraktörü eklenecektir. Bu optik siniri çevreleyen yağ içeren kılıf ortaya çıkarmak için ileri ve gözün dışa doğru dönecektir. </li></ol> 4. Optik Sinir erişme <ol><li> Yağ optik sinir kılıfı çevreleyen bağ dokusu yukarı çekmek için keskin forseps (Güzel ucu Dumont) kullanın. Uzunlamasına kesilmiş küçük Vannas yaylı makas kullanılarak olun. Gerektiği gibi kesme genişletin. Kesim yapıldıktan sonra kılıf içerdiği yağ çıkıntı dışarı başlayacak. Sonra kenarından dikkatlice yukarı çekerek ve hilal şekilli flep dokusu kesilerek bağ doku kapakları kaldırmak. </li><li> Vannas yaylı makas ile kesim yaparken, yağ çekmek için forseps kullanarak yağ örten optik sinir çıkarın. Alan dokusunun çıkarılması kaynaklanan küçük miktarlarda kan temizlemek için steril PBS ve cerrahi swablar kullanarak temiz tutun. </li><li> Optik sinir görülebilir. Sinir erişmek için, sinir çevreleyen meningeal kılıf, iç retinanın besleyen oftalmik arter zarar vermeden çıkarılması gerekir. Yavaşça kılıf döndürmek için forseps kullanarak meningeal kılıf vasküler desenini inceleyin. Bak, kan damarlarının yoksun bir alan ve uzunlamasına kesilmiş izin meningeal kılıf içinde yapılacak. </li><li> Ince uçlu Dumont forseps kullanarak, dura çimdik ve yukarı doğru çekin. Dura oluşturulan üçgen şeklindeki kama üssü yakınlarında, kılıf küçük bir kesi yapmak için Vannas yaylı makas kullanın. Alt bıçak, makas kesi içine yerleştirin ve kılıf, optik sinir, yan keser, damar zarar vermemek için dikkatli yönüne paralel kesmek. Dura optik sinir her iki tarafında asmak için forseps ve makas kullanın. </li><li> Sinir tek kalan kapsayan araknoid membran. Bu çok ince ve şeffaf. Membran hala mevcut olup olmadığını belirlemek amacıyla, sinir yüzeyinde çimdik keskin forseps kullanabilir. Araknoid mevcut membran çimdik ve üçgen kama bir doku oluşturmak için yukarı doğru çekin. 4.4 Adım benzer makas ucu ile küçük bir kesi olun. Sonra alt bıçak, makas yerleştirin ve araknoid uzunlamasına kesin. Sonra, iki tarafında optik sinirin araknoid asmak için makas ve forseps kullanın. </li><li> Bir mikro-surjik kanca, meningeal kılıf optik sinir yükseltirler. Sinirin dış kenarı etrafında Pass ucu kanca ve kanca kanca ile meningeal membranlar yakalamak ve yanlışlıkla transect böylece sinir ile temas halinde kalmasını emin olun. Meningeal kılıf optik sinir yavaşça kaldırın ve kanca tarafından desteklenen noktası arkasında tamamen sinir transeksiyonu. Transeksiyon optik sinir güdük kanca çıkarılması için izin, ücretsiz bir sonu olacaktır. </li><li> RGCs retrograd hayatta kalma ölçmek için etiketlenmesine gidiyoruz, gelfoam transeksiyon optik sinir (bkz. güdük üzerinde (veya başka bir retrograd tracer)% 3 Fluorogold batırılmış küçük bir parça yerleştirmek <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2261">vallahi protokolü 2261</a> ). </li></ol> 5. Kapanış ve Kurtarma <ol><li> Ekstra oküler kasların çekiş tahliye ve tarafsız bir konumda göz dönmek. Bunu yaparken, geri yerine göz döndürülür gelfoam, optik sinir güdük çevresinde kalmasını sağlamak için göz yörüngesine gelfoam aşağı itmek için emin olun. Lakrimal bez ve ekstra oküler kasların doğal konumlarına geri dön. </li><li> Orta hat cilt kapağı dönün ve yara sütür. Her iki gözü oftalmik göz merhemi sürün. Sonra, izofluran kaynağını kapatın ve birkaç dakika nefes oksijen hayvan izin. Hayvan kurtarmak için bir ısı lambası altında ısıtılmış bir kafes ya da bir kafes yerleştirin. Kurtarma kafes, kurtarma sırasında yataklar aspire şansını ortadan kaldırmak için herhangi bir yataklar koymayın. </li><li> Hayvanlar ameliyattan sonra bağımsız ev sahipliği olmalıdır. Cerrahi sonrası analjezikler, hayvan bakımı makamlarının kurallarına göre uygulanan ve hayvanların ameliyattan sonra dikkatlice izlenmelidir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: 14 gün içinde% 90 yaralı RGCs postaxotomy 9-11 kaybı, optik sinir kesisi. RGC ölüm ana mekanizması apoptozis 9, 12. RGCs normal yoğunluğu yaklaşık 2500 hücre / mm 2. Epifloresans veya konfokal görüntüleme axotomy sonra retrograd etiketli RGCs görselleştirmek için kullanılabilir. RGC apoptozis deneysel manipülasyonlar için bir zaman penceresi bırakarak, axotomy sonra yaklaşık 4 gün gecikti. 1 gün sonra axotomy ve Fluorogold ile retrograd etiketleme, RGC hücre gövdeleri, retina ve retina sinir lifi tabakası akson fasiküller ganglion hücre tabakası açıkça görülebilir görüntüleme flatmounted hazırlama (Şekil 1a). Axotomy 14 gün sonra, RGCs çoğunluğu ölmüş ve kalan birkaç RGCs retina mikroglia (Şekil 1b) arasında serpiştirilmiş. RGCs apoptozis, mikroglia fagosite ölü hücreler ve bir sonucu olarak 13, 14 RGCs etiketlemek için kullanılan floresan izleyici ile etiketlenmiş transcellularly haline geçer. Mikroglia phagosomes tracer görünüm hayatta RGCs farklı. Mikroglia, nispeten büyük ve sitoplazmaya (Şekil 1c) dağılmış son derece konsantre ve son derece parlak phagosomes tracer içerir. RGCs retrograd hücre sitoplazma dosyalama aksonlar taşınmıştır küçük noktalı veziküller ile boyanarak daha yaygın bir deseni (Şekil 1c). Bu veziküller daha küçük ve daha az yoğun floresan bir mikroglia hayatta RGCs ayırt etmek için izin var. Ayrıca, mikroglia, çok daha küçük bir hücre gövdeleri ve nispeten büyük ve yuvarlak hücre gövdeleri RGCs karşı bir stellat veya amoeboid morfolojisi sahip olma eğilimindedir. RGCs dendritik ağaçları da hücre sağkalım nicel, mikroglia kısa parlak süreçlerinden onları ayırt yardımcı olabilir. Hücre sağkalım retinanın farklı bölgelerinde sayısal ve RGCs ganglion hücre tabakası içinde bir tek tabaka bulunur yoğunluğu (hücre / mm 2), ilgili mikrograflar alan ekstrapole olabilir. <img src="/files/ftp_upload/2241/2241fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1, optik sinir güdük tracer axotomy ve uygulama sonrası Fluorogold etiketli RGCs Epifloresans mikrograflar . (A) axotomy RGCs ve akson fasiküller 1 gün sonra, ince bir noktalı şekilde izleyici ile etiketlenir. (B) axotomy sonra 14 gün olarak, ölü hücreleri de izleyici ile etiketlenmiş fagosite mikroglia% 90 RGCs öldü ve parlak etiketli. (C) Yüksek büyütme 14 gün postaxotomy RGCs ve mikroglia (kırmızı ok uçları) arasındaki farkı gösteren. Ölçeği A bar ve B 50 mm. C Ölçek çubuğu 25 mm.

<ol>
	<li>Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+or+let+die+-+retinal+ganglion+cell+death+and+survival+during+development+and+in+the+lesioned+adult+CNS.">Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS.</a> Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).</li><li>Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+retinal+ganglion+cell+development,+survival,+and+regeneration.">Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration.</a> Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).</li><li>Koeberle, P. D., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+guidance+cues+for+regenerating+axons:+where+have+they+gone.">Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone.</a> J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).</li><li>Weishaupt, J. H., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+as+a+model+for+neuronal+apoptosis+in+the+central+nervous+system+-+molecular+death+and+survival+pathways.">Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system - molecular death and survival pathways.</a> Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).</li><li>Valenzuela, G. a. r. c. i. a., E, S. C. S. h. a. r. m. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+retinal+ganglion+cells+from+axotomy-induced+apoptosis+through+TRK+oncogene+transfer.">Rescue of retinal ganglion cells from axotomy-induced apoptosis through TRK oncogene transfer.</a> Neuroreport. 9, 3165-3170 (1998).</li><li>Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+by+adenoviral+vector+administration+at+the+optic+nerve+stump:+an+in+vivo+model+system+for+the+inhibition+of+neuronal+apoptotic+cell+death.">Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death.</a> Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).</li><li>Lingor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+apoptosis+mediators+by+RNAi+inhibits+axotomy-induced+retinal+ganglion+cell+death+in+vivo.">Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo.</a> Brain. 128, 550-558 (2005).</li><li>Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+adenoviral-mediated+gene+transfer+of+interleukin-10,+interleukin-4,+and+transforming+growth+factor-beta+on+the+survival+of+axotomized+retinal+ganglion+cells.">Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells.</a> Neuroscience. 125, 903-920 (2004).</li><li>Berkelaar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy+results+in+delayed+death+and+apoptosis+of+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats.">Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 14, 4368-4374 (1994).</li><li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+peripheral+nerve+grafts+on+the+survival+and+regrowth+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats.">Influences of peripheral nerve grafts on the survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 8, 265-280 (1988).</li><li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+protracted+phases+of+retinal+ganglion+cell+loss+follow+axotomy+in+the+optic+nerve+of+adult+rats.">Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats.</a> J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).</li><li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+death+in+experimental+glaucoma+and+after+axotomy+occurs+by+apoptosis.">Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, 774-786 (1995).</li><li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+transcellular+carbocyanine-labelling+of+rat+retinal+microglia+during+injury-induced+neuronal+degeneration.">Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration.</a> Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).</li><li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+transcellular+staining+of+microglia+in+the+adult+rat+after+traumatic+degeneration+of+carbocyanine-filled+retinal+ganglion+cells.">Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells.</a> Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).</li></ol>

Bu cerrahi prosedürün çok varyasyon vardır ve bu protokol adımları birkaç gerekli değildir. Sadece sinir erişmek için optik sinir örten kasları geri çekmek için gerekli. Ancak, sinir çevresinde çok sınırlı bir çalışma alanı bu sonuçları kesisi kritik son aşamaya daha zor hale. Bazı durumlarda, optik sinir güdük hücreleri ve tüm ekstraoküler kasları ve lakrimal bezi bu durumda faydalıdır geri çekilmeden sağladığı artan erişim alanı transfect arzu edilir. <p class="jove_conten...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Gas Mask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anesthesia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VetEquip</td>
<td>901806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (PrAErrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter Corp</td>
<td>DIN 02225875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI, Zeiss, Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>39286</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gelfoam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacia &amp; Upjohn</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tears Naturale P.M.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proviodine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Medline</td>
<td>MDS093945H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine tip Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro surgical hook</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10062-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eye dressing serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #7b sharp curved serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11270-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cauterizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18010-00</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optic nerve transection: a model of adult neuron apoptosis in the central nervous system

Retina ganglion hücrelerinin (RGCs) MSS nöronlar olduğunu retina optik sinir yoluyla beyne görsel bilgi çıktı. Optik sinir göz yörüngesinin içinde erişilebilir ve tüm RGC nüfus aksonlar tamamen kesme, (axotomized) transeksiyon olabilir. Optik sinir transeksiyonu yetişkin MSS 1-4 apoptotik nöron hücre ölümü tekrarlanabilir bir model. Bu model özellikle çekici, göz vitreus kamara göz içi enjeksiyonları ile deneysel manipülasyonlar izin retina ilaç dağıtım için bir kapsül gibi davranır çünkü. Vitreus sıvı ile kimyasal difüzyon tüm RGC nüfus üzerine hareket etmelerini sağlar. Ayrıca, RGCs seçici hedef, üstün colliculus 8 içine optik sinir 5-7 veya enjekte vektörler kesme sonuna kadar kısa müdahale RNA&#39;lar (siRNA), plazmid ya da viral vektörlerin uygulayarak transfekte olabilir. Bu araştırmacılar, diğer seyirci nöron veya glia çevreleyen karıştırıcı etkisi olmadan istenilen nöronal nüfus apoptotik mekanizmalar çalışma sağlar. Ek bir avantaj, kolaylık ve doğruluk hücre sağkalım yaralanma sonrası sayısal olabilir. Retinanın düz, katmanlı bir dokudur ve RGCs en içteki tabaka, ganglion hücre tabakası lokalize. RGCs, hayatta kalma, bir floresan tracer (% 3 Fluorogold), axotomy zaman optik sinir kesme sonuna kadar uygulayarak, ya da İzleyicinin üstün colliculus (RGC hedef) bir hafta önce içine enjekte edilerek zaman içinde takip edilebilir axotomy. Tracer retrograd tüm RGC nüfus etiketleme, taşınır. Ganglion hücre tabakası bir tek tabaka (kalın bir hücre) olduğundan, RGC yoğunlukları stereology için gerek kalmadan düz monte edilmiş doku nicel olabilir. Optik sinir transeksiyonu 14 postaxotomy 9-11 gün içinde% 90 yaralı RGCs apoptotik ölüme yol açar. RGC apoptozis, hücre ölümü hücrelerin hızla dejenere sonra 3-4 gün postaxotomy, gecikmiş sayede ders karakteristik bir zaman vardır. Bu deneysel manipülasyonlar apoptozis dahil yollar yöneltilen bir zaman penceresi sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System at JoVE.com

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Optik Sinir transeksiyonu yetişkin MSS yaralanma yaygın olarak kullanılan bir model. Retina ganglion hücrelerinin yüzde doksanı (RGCs) olan aksonlar tamamen axotomy sonra 14 gün içinde ölürler (axotomy) transeksiyon. Bu model, deneysel manipülasyonlar kolayca mükellef ve yüksek tekrarlanabilir.

Optik Sinir transeksiyonu: Santral Sinir Sistemi Yetişkin Nöron Apoptoz Bir Model

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

optic-nerve-transection-model-adult-neuron-apoptosis-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.5K Görüntüleme.  University of Toronto. Optik Sinir transeksiyonu yetişkin MSS yaralanma yaygın olarak kullanılan bir model. Retina ganglion hücrelerinin yüzde doksanı (RGCs) olan aksonlar tamamen axotomy sonra 14 gün içinde ölürler (axotomy) transeksiyon. Bu model, deneysel manipülasyonlar kolayca mükellef ve yüksek tekrarlanabilir.

Video: Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Memeli MSS Optik Sinir transeksiyonu sonra Deneysel İşlemler Yöntemleri

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Nörobilim

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

Polyribosome Fraksiyonu tarafından Santral Sinir Sistemi Translatome in vivo sorguluyor

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Deneysel Optik Sinir demyelinizasyon bir Rat Modelinde Görsel Uyarılmış Potansiyel Kayıt

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection is considered a useful and reproducible model. Compared with other optic nerve injury models used commonly for assessing secondary degeneration, e.g. complete optic nerve transection and optic nerve crush models, the partial optic nerve transection model is superior as it distinguishes primary from secondary degeneration in situ. Therefore, it serves as an excellent tool for evaluating secondary degeneration. This study describes a novel operative approach of partial optic nerve transection by directly accessing the area of the retrobulbar optic nerve through the orbital lateral wall of the eyeball. Moreover, we present a newly designed, low cost surgical instrument to assist with transection. As demonstrated by the representative results in distinguishing the boundary of primary and secondary injury areas, the new approach and instrument ensures high efficiency and stability of the model by providing adequate space for surgical operation. This in turn makes it easy to separate the meningeal sheath and ophthalmic vessels from the optic nerve before transection. An additional benefit is that this space-saving operative approach improves the investigators&#39; ability to administer drugs, carriers, or selective RGC tracers to the stump of the partially transected optic nerve, allowing the exploration of mechanisms behind secondary injury in RGCs, in a new way.

Secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. This study describes an innovative operative approach for partial optic nerve transection. The use of this space-saving operative approach extends the model's application range, and allows exploration of secondary injury mechanisms in RGCs in a new way.

Kısmi optik sinir transeksiyon Sıçanlarda: ikincil dejenerasyonu retina Ganglion hücrelerinin değerlendirmek için yeni bir operatif yaklaşım ile kurulan bir Model

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with neurodegenerative diseases or injuries, but also in the normal brain. Here, we describe a newly-established micromechanical system to rapidly, reliably, and reversibly induce axonal varicosities, allowing us to understand the mechanisms governing varicosity formation and heterogeneous protein composition. This system represents a novel means to evaluate the effects of compression and shear stress on different subcellular compartments of neurons, different from other in vitro systems that mainly focus on the effect of stretching. Importantly, owing to the unique features of our system, we recently made a novel discovery showing that the application of pressurized fluid can rapidly and reversibly induce axonal varicosities through the activation of a transient receptor potential channel. Our biomechanical system can be utilized conveniently in combination with drug perfusion, live cell imaging, calcium imaging, and patch clamp recording. Therefore, this method can be adopted for studying mechanosensitive ion channels, axonal transport regulation, axonal cytoskeleton dynamics, calcium signaling, and morphological changes related to traumatic brain injury.

This protocol describes a physiologically relevant, pressurized fluid approach for rapid and reversible induction of varicosities in neurons.

Varisler oluşumu ve kurtarma merkezi nöron aksonlar içinde çalışmak için bir Microbiomechanical sistemi

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...