BFBS bir Iowa Değerler Büyüme Fonu ödülü tarafından bu iş için finansman sağlanmıştır.

1. Steril Yapıştırıcı Bant Yüzey Örnekleme <ol><li> Örnekleme için kullanmak üzere bir bant seçin. Piyasada bulunan Mantarlar-teyp veya Con-Tact örnekleme bantları kullanım kolaylığı için steril ve özel paketlenmiş. Ancak, şeffaf (optik açık) genel ofis bant da kullanılabilir olması bulduk. </li><li> , Yapışkan bant, 10 cm parça (bir kağıt şablonu kullanılabilir) yapışkan olmayan bir tarafında 1 cm 2 kare çizmek için kalıcı bir kalem kullanın. Bu bant kısmı gıda veya çevresel bir yüzeye örnek edildiği kaydetti için görsel bir kılavuz olarak görev yapacak. </li><li> Numune alınacak yüzeyine bakacak şekilde yapışkan tarafı ile &quot;C&quot; şeklindeki bant döngü oluşturur. Bunu yapmak için, arka (yapışkan olmayan tarafı) bant (Şekil 1) çizilmiş kare karşı başparmak, orta parmak ve pozisyon işaret parmağı ile yapışkan uçları tutun. </li><li> Numune alınacak yüzeyinde bant yerleştirin ve yavaşça yüzeye karşı işaretli alana basın. Bant kenarları bırakmadan, yapışkan bant yan kabarcıkları kaçınarak, numune yüzeyine tam olarak temas gelir sağlamak için parmağı kullanın. </li><li> Hatta bir hareket kullanarak, yavaş yavaş, fiziksel olarak yüzey bağlı mikropların açılan örnek uzak bant çekin. Cam bir mikroskop lamı üzerine, genel şeffaf ofis bant kullanarak, hücre ücret bant, yapışkan tarafı sabitleyin. Düz olmayan wrinkly bir yüzey oluşturulur, böylece bant düzgün gerginlik / germe olun. Bu bant hibridizasyon sırasında sonraki ısıtma sırasında deformasyon / kıvrık ile ilgili sorunları en aza indirmeye yardımcı olacaktır. </li></ol> 2. Katı-faz Zenginleştirme ve Sıvı Yüzey Miniculture <ol><li> Katı-faz zenginleştirme örneklenen hücrelerin agar yüzeyi ile doğrudan temas halinde yerleştirilir böylece Xylose Tergitol-lizin-4 (XLT-4) agar plaklarına yüzü aşağı bant yerleştirerek yapılır. Bant şablonu / örnek temas kısmı ile aynı hizada agar yüzeyi ve bandın bir ucunu gevşek zenginleştirme aşağıdaki agar yüzeyine bandı kolay çıkarılmasını kolaylaştırmak için Petri kabı yan duvarına yapıştırılır yerleştirilir. </li><li> Tabaklar ters (yoğunlaşma önlemek için) ve 35 inkübe - 37 ° C Salmonella spp yeterli büyüme izin verecek. Hücreleri tespit edilebilir bir seviyeye zenginleştirmek için gereken kuluçka süresinin uzunluğu ilk Salmonella kirlilik düzeylerine bağlıdır. Biz, 8 saat zenginleştirme sonra, düşük başlangıç ​​inocula mükemmel microcolony oluşumu gözlenen var. </li><li> İstenen zenginleştirme döneminden sonra, agar plaka açın. İnkübasyon sırasında bant yapışkanlık koruyacaktır. Agar-agar bant arayüzü oluşan mikrokoloniler maksimum iyileşme sağlamak için işaret parmağını kullanarak karşı bant hafifçe basın. Petri kabı duvara bağlı kenar bandı tutun ve yavaş bir hareket bile, onu kaldırmak. Yukarıdaki bölüm 1.5 &#39;de açıklandığı gibi hücre ücret bant, yapışkan tarafı, bir mikroskop lamı üzerine monte edin. Aşağıda yer alan &quot;Fiksasyon ve Dehidratasyon&quot; adımı geçin. </li><li> Sıvı yüzey miniculture için, yukarıdaki bölüm 1.5 &#39;te açıklandığı gibi, bir mikroskop lamı üzerine numune almak için kullanılan bant bağlayarak başlar. Sonra, oluşturan alt yukarı bakacak şekilde, hücre ücret bant oluşur yalıtılmış bir bölmede steril olmayan bir silikon perfüzyon odası (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.) Bant şablonu / numune temas kısmı, kapsar. Sıkıca, ama nazikçe yerleştirin, su geçirmez bir mühür sağlamak için odasına basın. </li><li> Pipet, transferi ≤ 500 mcL Triptikaz Soya Broth ya da odasının küçük giriş limanlarından biri aracılığıyla diğer uygun zenginleştirme orta yükleme esnek bir jel kullanılması. 35 -37 buharlaşma ve inkübe slaytlar önlemek için, şeffaf ofis bant ile iki port Seal ° C yeterli zenginleştirme için gerekli gibi. Iyi bir numune alma ve işleme uygulamalarına göre tüm işlemler yapılmalıdır rağmen, port sızdırmazlık bandı veya perfüzyon odaları sterilite sıvı yüzey miniculture sırasında gerekli değildir. FISH ve flow sitometri kombinasyonu Salmonella spp açık bir ayrımcılık sağlayacaktır. hedef dışı bakterilerden örnek kendisinden gelmesi bekleniyor hedef olmayan flora en büyük katkı, mevcut olabilir. Aşağıda yer alan &quot;Fiksasyon ve Dehidratasyon&quot; adımı geçin. </li></ol> 3. Fiksasyon ve Dehidrasyon <ol><li> , Doğrudan yüzey örnekleme için veya katı faz zenginleşmesi için Salmonella spp . XLT-4 agar-teyp hücre fiksasyonu gerçekleştirmek az 30 dakika süreyle 25 ° C 500 mcL% 10 nötr ile örnek bir iletişim alanı kapsayan formalin solüsyonu. </li><li> Fiksatif yapışmalı, bir konteyner (toksik / tahriş edici buhar maruz kalma en aza indirmek için bir kimyasal kaputu altında) içine atın. </li><li> Etanol serisi (300 mcL / 3 dak Her konsantrasyon% 50,% 80 ve% 95) dehydrate. Aşağıda yer alan &quot;hibridizasyon&quot; adım devam edin. </li><li> 500 mcL sıvı yüzey miniculture örnek tespit içinlar, kaplanmadan perfüzyon odaları, ve esnek bir jel yükleme pipet enrichate ayıklamak için kullanılır. Aşağı yukarı hızlı ve pipetleme kalan herhangi bir bant bağlı hücreleri etkili bir şekilde çıkarılması sağlamak amacıyla kullanılacaktır. </li><li> Sonra, tüm 500 mcL miniculture hacmi mikrosantrifüj tüpüne transfer ve 2.000 xg (5 dk) aşağı döndü. Süpernatant atılır, pelet sonra% 10 eşit hacmi yeniden süspanse, 30-60 s için şiddetle vortekslenmiş olan nötr tamponlu formalin. Hücreler 30 dakika 25 ° C sabit </li><li> Sonra, fiksatif kaldırılır ve örnek hücre saklama tampon yeniden süspanse aşağıdaki gibidir. 60 s,% 50 denatüre etanol-% 50 eşit hacmi yeniden süspanse fosfat-numune 2.000 xg (5 dk, 25 ° C) süpernatantı atılır, pelet 30 şiddetle vortekslenmiş. Eğirilir tamponlu salin. Sabit hücreler, -20 ° C&#39;de (yıl) süresiz olarak saklanabilir Not: sıvılar (örneğin, fiksatif veya farklı tampon tanıtan) değiştirilir zaman, iyice (vorteks) en az bir kısmında hücre pelet (~ 10 - 20 mcL) tekrar süspansiyon için önemlidir &quot;giden&quot; sıvı sistemi . Bu topaklanma önlemek ve tek tek hücreler bile süspansiyonları elde edilir olmasını sağlamak yardımcı olacaktır. Aşağıda yer alan &quot;hibridizasyon&quot; adım devam edin. </li></ol> 4. Melezleme <ol><li> Hibridizasyon / yıkama tampon ticari moleküler biyoloji dereceli çözümler Malzeme Tablo kaydetti kullanarak hazırlayın. Final tampon bileşeni konsantrasyonları 0,7 M NaCl, 0.1 M TRIS [pH 8.0, 10 mM EDTA,% 0.1 sodyum dodesil sülfat, 0.22 mikron bir şırınga ya da fincan filtre kullanarak molekül sınıfı su ve süzülür son İstenen hacme kadar yapılan. Sondalar (aşağıya bakın) ilavesi olmadan aynı tampon, bir çamaşır tampon olarak kullanılır. Onceden hibridizasyon ve tamponlar yıkama ile 55 ° C </li><li> Floresan etiketli ekle Sal3 (Nordentoft ve ark, 1997; 5&#39;-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 &#39;) ve Salm-63 (Kutter ve ark, 2006; 5&#39;-TCG ACT GAC TTC AGC TTK-3&#39; Önceden ısıtılmış hibridizasyon tamponu) oligonükleotid problar (Malzeme Tablo). Toplam prob konsantrasyonu 5 ng mcL -1 (Bisha ve Brehm-Stecher, 2009a 2.5 ng mcL -1 her sonda) kullanılır. </li><li> Doğrudan-kaset ve katı faz zenginleştirme örnekleri için, prob kokteyl içeren hibridizasyon tamponu 300 mcL bant şablonu örnek temas alanı kaplaması ve 55 ° C&#39;ye kadar nemli, kapalı kuluçka odasında bant bağlı hücrelerin melezleşme Slayt Moat aleti (Malzeme Tablosu) gibi bir doğrudan temas inkübatör kullanılması durumunda, örnekler 15 dakika süreyle melezleşmiştir ve&gt; 20 slayt aynı anda işlenebilir. Bambino aleti (Malzeme Tablosu) gibi, bir döner tarzı hibridizasyon fırın kullanılması durumunda, slaytlar hibridizasyon için 50 ml polipropilen santrifüj tüpleri, tüp başına bir slayt yerleştirilir. Isı transferi doğrudan olduğundan, bu örnekleri daha uzun süre (30 dakika kadar) için melezleşmiştir. </li><li> Hibridizasyon, slaytlar kaldırılır ve prob içeren hibridizasyon tampon kaplaması atılır. Slaytlar sonra önceden ısıtılmış yıkama tampon kaplaması ya (30 dakika kadar) ya da kısa ve hafifçe eğik bir slayt (300 mcL her 3 durular) üzerinde küçük bir tampon hacmi pipetleme tarafından önceden ısıtılmış yıkama tamponu ile durulanır, ya da resmi yıkanır Önceden ısıtılmış yıkama tamponu içeren 50 ml polipropilen santrifüj tüpüne daldırma. Deneyimlerimize göre, resmi bir yıkama gelişmiş sonuçları (bağlanmamış prob daha az bulanıklık) sağlayacak olsa da, basit bir durulama Salmonella spp net tespiti için yeterli olmaktadır. Sonra, slaytlar, aşağıdaki &quot;Algılama&quot; adıma geçmeden önce hava kuru. </li><li> Sıvı yüzey miniculture örnekleri Hibritleşme pelet vorteks ve dinç içeren 100 mcL önceden ısıtılmış hibridizasyon tamponu tabanda takip 2.000 xg&#39;de 5 dakika (taze -20 ° C&#39;de sabit veya depolama tamponda tutulan) numuneler iplik tarafından yapılır prob kokteyl. Örnekler 55 melezleşmiştir ° C 500 mcL önceden ısıtılmış yıkama tampon ilave edilerek takip eden bir ısı blok veya diğer uygun inkübasyon istasyonu (Malzeme Masa), 30 dk. Bant bağlı örnekler olduğu gibi, bu örnekler resmen için yıkanmış olabilir daha fazla inkübasyon 30 dakika 55 ° C yıkama tamponu, aralıklı vorteks bu. Alternatif olarak, numunelerin iyice analiz için hemen hasat (aşağıda) takiben, 500 mcL önceden ısıtılmış yıkama tampon eklenmesinden sonra vortekslenmiş olabilir. </li><li> Salmonella tespiti için hazırlık. flow sitometri ile, sıvı yüzey miniculture örnekleri 5 dakika boyunca 2.000 xg aşağı bükülmüş, süpernatantı atılır ve numuneler 300 mcL oda sıcaklığında yeniden süspanse (~ 25 ° C) PBS. Hibridizasyon ve analiz arasında bir gecikme beklenen ise, örnekleri uzak bir tesis taşıma ihtiyacınız varsa ya da numuneler önce ana buzdolabında veya buz üzerinde yapılan olabilirlizis. Alternatif olarak, numuneler hücre saklama tamponu (PBS ve mutlak etanol karışımı 50:50) transfer edilir ve kayda değer kayıpları olmadan bir hafta kadar -20 ° C&#39;de tutulan olabilir prob-haiz floresan (Bisha ve Brehm-Stecher, 2009b) . </li></ol> 5. Bulma <ol><li> Salmonella spp-teyp tespiti için. floresan mikroskobu ile doğrudan-kaset ya da katı faz zenginleştirme örnekleri nükleer counterstain içeren 4 ~ 10 mcL Vectashield H-1200 montaj orta &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), bir kapak kayma ile monte, yerleştirilmiştir. sonra 10 dakika süreyle karanlıkta inkübe edildi. </li><li> Daldırma yağ kapağı astar üzerine yerleştirilir, ve örnekleri, yüksek büyütmeli yağ objektif (63x veya 100x) kullanılarak incelenir. DAPI filtre örnek odak noktası haline getirmek için kullanılır, mikroskop, daha sonra uygun filtre (yeşil ya da kırmızı, son-etiket probları için kullanılan boya bağlı olarak) ve Salmonella hücreleri açıldığında (floresans göre görsel gol Rakamlar 2 ve 3). </li><li> Sıvı yüzey miniculture örnekleri sitometrik tespiti için yerel olanaklara bağlı olarak, çeşitli aletler kullanılır. PBS-askıya örnekleri laboratuvarda, 5 ml yuvarlak alt örnekleme tüpleri (BD Falcon) aktarılır ve 647 nm (Malzeme Tablo) uyarma ile bir FACSCanto akış sitometresi kullanılarak incelenir. Yüksek sayılarda toplam bakteri içeren zenginleştirilmiş örnekleri için, &quot;düşük akış hızı&quot; ayarı (10 mcL min -1) kullanılır ve 5,000-50,000 olaylar toplanır. Veri FlowJo yazılımı (sürüm 8.8.6, Tree Star, Inc, Ashland, OR) veya başka uygun bir analiz yazılımı (Şekil 4, A ve B panelleri) kullanılarak analiz edilmektedir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Salmonella spp örnekleme için yapışkan bant kullanın. yapay olarak kontamine domates yüzeyinden. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Tipik bir domates (100 X yağ objektif) yüzeyinden doğrudan-kaset örnekleme ve Salmonella Typhimurium ATCC 14028 BALIK algılama sonuçlar Texas iki prob kokteyl Kırmızı etiketli sondalar (Sal3/Salm-63) kullanılır. bu hücrelerin etiket. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Salmonella Typhimurium ATCC 14028 mikrokoloniler 37 8 saat on-bant zenginleştirme ° C sonra ilk inokulum yapay olarak kontamine domates yüzeyinden örnekleri alındı ​​ksiloz Lizin Tergitol-4 (XLT-4) agar yüzeyinde oluşmuş. Katı-faz zenginleştirme tespiti için kullanılabilir hücre sayısını artırır ve aynı zamanda hücresel rRNA içeriğini arttırır. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. S. örnekleme için yapışkan bant kullanın enterica serovar Typhimurium FISH ve akım sitometri (panel A) aracılığıyla veya doğrudan analizi ile 500 mcL Triptikaz Soy Broth (panel B ile dolu bir perfüzyon odasında 5 saat non-selektif sıvı yüzey miniculture zenginleştirme sonra yapay olarak kontamine domates, yüzeyden .)

<ol>
	<li>Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+method+using+a+peptide+nucleic+acid+probe+for+the+identification+of+Salmonella+spp.+in+a+broad+spectrum+of+samples.">Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).</li><li>Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+sampling+for+Candida+with+adhesive+tape.">Skin sampling for Candida with adhesive tape.</a> Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+adhesive-tape-based+sampling+of+tomato+surfaces+combined+with+rapid+fluorescence+in+situ+hybridization+for+Salmonella+detection.">Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 .</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-through+imaging+cytometry+for+characterization+of+Salmonella+subpopulations+in+alfalfa+sprouts,+a+microbiologically+complex+food+system.">Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system.</a> Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).</li><li>Edwards, R. W., Hartman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+collecting+fungus+specimens+from+infected+surfaces.">A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces.</a> Lloydia. 15, 39-39 (1952).</li><li>Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F., Pouch Downes, F., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+monitoring+of+the+food+processing+environment.">Microbiological monitoring of the food processing environment.</a> Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. , (2001).</li><li>Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+tape+method+for+estimating+microbial+load+on+meat+surfaces.">Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces.</a> J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).</li><li>Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+barley+(Hordeum+vulgare)+with+Salmonella+enterica+and+Listeria+spp.">Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).</li><li>La Cono, V., Urz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+applied+on+samples+taken+with+adhesive+tape+strips.">Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips.</a> J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).</li><li>Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+controlling+microbiological+contamination+of+beverage+dispensers+in+university+foodservice+operations.">Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations.</a> Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).</li><li>Langvad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+qualitative+and+quantitative+study+of+the+fungal+flora+of+leaves.">A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves.</a> Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).</li><li>Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+fluorescence-labelled+oligonucleotide+probe+targeting+23S+rRNA+for+in+situ+detection+of+Salmonella+serovars+in+paraffin-embedded+tissue+sections+and+their+rapid+identification+in+bacterial+smears.">Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).</li></ol>

Basit ve hızlı yöntemler üretmek yüzeylerin patojenlerin saptanması için zamanında ve aksiyona yönelik veri sağlayan gıda kaynaklı hastalık azaltılmasına yardımcı olabilir. 1950&#39;lerden beri, çevre klinik ve gıda mikrobiyolojisi Yapıştırıcı bant tabanlı örnekleme yöntemleri kullanılabilir ve direkt mikroskobik inceleme ya da için sağlam bir medya yapışık mikroorganizmalar transferi, mikroorganizmaların giderilmesi için yüzeylere &quot;Scotch&quot; tarzı kaset basarak dahil edilmi?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fungi-Tape sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL</td>
<td>745</td>
<td>http://www.scientificdevice.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Con-Tact-It sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Birko Corporation, Denver, CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.birkocorp.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Clear office tape, generic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence</td>
</tr>
<tr>
<td>Food surface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Local grocery</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypticase Soy Broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>211768</td>
<td>For non-selective liquid surface miniculture enrichment</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>223420</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>235310</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Formalin solution </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>HT5011</td>
<td>10% solution, neutral, buffered (cell fixative)</td>
</tr>
<tr>
<td>Absolute ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>E7023</td>
<td>Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RNase- and DNase-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slides and cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>S5150</td>
<td>Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>T9285</td>
<td>1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>L4522</td>
<td>10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Integrated DNA Technologies, Coralville, IA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5&#x2019;-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified</td>
</tr>
<tr>
<td>Variable speed microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>CoverWell perfusion chamber </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR</td>
<td>PC1R-2.0</td>
<td>Non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>05-408-151</td>
<td>Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum heat block or precision-controlled heating station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Bambino mini hybridization oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 230300</td>
<td>Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct</td>
</tr>
<tr>
<td>Slide Moat slide hybridizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 240000</td>
<td>Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield H-1200 mounting medium with 4&#x2019;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td>
<td>H-1200</td>
<td>Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leitz Laborlux S used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canon PowerShot A640 camera used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used</td>
</tr>
<tr>
<td>Adobe Photoshop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Adobe Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometry analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

combination of adhesive-tape-based sampling and fluorescence in situ hybridization for rapid detection of salmonella on fresh produce

Bu protokol, domates ve diğer taze ürün yüzeyleri yapışkan bant tabanlı örnekleme bant floresan in situ hibridizasyon (FISH) Salmonella spp hızlı kültür-bağımsız tespiti için takip için basit bir yaklaşım açıklanmıştır . Hücre ücret bantları da algılama önce katı faz zenginleştirme için seçici agar yüzü aşağı yerleştirilmiş olabilir. Alternatif olarak, düşük hacimli sıvı zenginleşmesi (sıvı yüzey miniculture), akım sitometri analizi ile FISH ve non-selektif suyu bant yüzeyi, yapılabilir. Başlamak için, steril yapışkan bant, taze ürün ile temas getirilen hafif basınç uygulanır ve bant fiziksel olarak bu yüzeyler üzerinde bulunan mikropların açılan kaldırılır. Bantlar cam mikroskop lamı üzerine yapışkan yüzü yukarı monte edilip edilmediğini ve örneklenen hücrelerin% 10 formalin (30 dk) ve kurutulmuş kademeli etanol serisi (50, 80, ve% 95; 3 dakika Her konsantrasyon) ile sabittir. Sonra, hücre ücret bantları Salmonella hedefli DNA prob kokteyl içeren tampon ile tespit ve 15 melezleşmiştir - 55 30 dk ° C, kısa bir bağlanmamış prob kaldırmak için bir çamaşır tamponunda durulama takip. BALIK-etiketli hücreleri, yapışkan sonra floresan mikroskopi kullanılarak izlenebilir boya 4 DNA &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve sonuçları ile zıt olan. Katı faz zenginleşmesi için uygun bir seçici agar yüzeyinde, hücre ücret bantlar yüzü aşağı yerleştirilir ve yukarıda açıklandığı gibi, FISH ve mikroskopi takip Salmonella mikrokoloniler yerinde büyüme izin inkübe . Sıvı yüzey miniculture için, hücre ücret bantlar yapışkan tarafına yerleştirilir ve silikon perfüzyon odasının uygulanır, böylece bant ve mikroskop lamı formu, su geçirmez bir odasına alt Triptikaz Soya küçük bir hacmi (≤ 500 mcL) Broth (TSB) tanıtıldı. Giriş çıkış portları kapalı ve odaların 35 inkübe - 37 ° C, teyp çıkarılan mikropların büyüme tabanlı amplifikasyon sağlar. Inkübasyon sonrasında, giriş portları kaplanmadan, hücreler müstakil ve karışık kuvvetli geri ve ileri pipetleme, santrifüj yoluyla hasat ve% 10 oranında sabit nötr tamponlu formalin. Son olarak, örnekler melezleşmiştir ve Salmonella spp varlığını ortaya çıkarmak için akım sitometri yöntemiyle incelenir . Burada açıklandığı gibi, &quot;tape-FISH&quot; yaklaşımı domates yüzeylerde, basit ve hızlı bir örnekleme ve Salmonella algılama sağlayabilir. Ayrıca, ıspanak ve jalapeño biber taze ürünler de dahil olmak üzere diğer türleri, örnekleme için bu yaklaşım kullandık.

Watch this Scientific Journal Video about Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce at JoVE.com

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Bu protokol, ardından hızlı bir şekilde tüm hücre algılama, domates ve diğer taze ürün yüzeyler örnekleme için basit bir yapışkan bant tabanlı yaklaşım, açıklar<em&gt; Salmonella</em&gt; Floresan kullanarak<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH).

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

combination-adhesive-tape-based-sampling-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

12.9K Görüntüleme.  Colorado State University. Bu protokol, ardından hızlı bir şekilde tüm hücre algılama, domates ve diğer taze ürün yüzeyler örnekleme için basit bir yapışkan bant tabanlı yaklaşım, açıklar Salmonella Floresan kullanarak In situ Hibridizasyon (FISH).

Video: Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Kilitli Nükleik Asit Sitometrisi-floresan Yerinde Hibridizasyon (LNA akış FISH): Bakteriyel Küçük RNA Algılama Yöntemi

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Melezleme<em&gt; In situ</em&gt; Bezler, Yumurtalık ve Vektör Sivrisinek ve Embriyoların

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Floresan<em&gt; In situ</emVirüsler ve Bitki ve Böcek Dokularda Endosimbiyotik Bakterilerin lokalizasyonu&gt; Hibritlemeler (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Mukozal astar sıvı noninvaziv örnekleme için In Vivo üst solunum yolu bağışıklık arabulucu düzeyleri miktar

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

KSHV Enfekte Hücrelerde Spesifik Gen Ürünlerinin Situ Hibridizasyonunda (FISH) ve İmmünfloresansında (IF) Kantitatif Floresan

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ Hibridizasyon Salmonella Taze üretin