Yazarlar Dr James Bamburg ve bu çalışmalarda işbirliği için onun laboratuvar üyelerine teşekkür ediyorum. Bu çalışma NIH hibe HD19950, EY07133 ve Minnesota Tıp Vakfı&#39;nın bağışları ile finanse edilmiştir.

Rodamin aktin etiketleme için, nöron, ya da &quot;video&quot; yemekler içine yapıştırılmış lamelleri 35 mm plastik tabaklar altına yerleştirilen cam lamelleri kültür. 1. Lameller hazırlanması ya da &quot;Video&quot; Yemekleri <ol><li> Birçok nöron tipleri, in vitro yüzeylerde kötü yapıştırıcı. Bu prosedür için gerekli olan Cam lamelleri, yeterli nöron-substrat yapışma yeterince temizlenmeli ve hazır olmadıkça izin vermeyebilir. Banker ve Goslin tarafından düzenlenen kitap Kültürleme Sinir Hücreleri, asit, cam lamelleri yıkama ve temizlik için detaylı bir prosedür açıklanmıştır. Alternatif olarak, heyecanla substrat moleküllerine bağlanır lamelleri, nitroselüloz kaplama aşağıdaki adımları 1.7 ve 1.8 olarak açıklanmıştır. </li><li> Cam lamelleri (örneğin 18 mm kare veya 24 mm daire) dH 2 O durulanır ve organik izlerini silmek için pişmiş kuru ısı mümkün olduğunca (≥ 225 ° C) ve uzun (birkaç gün en az üç ay veya daha uzun). bileşikler. 1.6 veya 1.3 &#39;e devam video yemekler için adıma gidin. </li><li> Yüksek çözünürlük videomicroscopy için ince bir açık cam yüzey oluşturmak için, uygun çaplı bir elektrik mantar matkap kullanarak (ya da benzeri bir aletle) 35 veya 50 mm plastik Petri veya doku kültürü yemekleri dipleri yuvarlak delikler delinir. Sondaj plastik çatlamasını önlemek için hafif bir baskı ile yavaş yavaş yapılır. Her iki tarafta da düzgün bir yüzey oluşturmak için açılan deliğin kenarları makas ile kazınır. </li><li> Cam lamelleri, 1.1 veya 1.2 &#39;de açıklandığı gibi doku kültürü kullanmak için temizlenir. Lameller, toksik olmayan silikon akvaryum çimento (18x18mm lamelleri, 12mm çap biti kullanılır) kullanarak, deliklerinin üzerine yapıştırılır. Çimento, 24 saat boyunca tedavi. </li><li> (Steril koşullar aşağıdaki adımları kullanılarak yapılır) video yemekler steril dH 2 O 3 kez yıkanır ve kurumaya izin. </li><li> Lameller nöron kültürü için substrat molekülleri ile kaplanmıştır. İlk olarak, lamel yüzey (18x18 lamel için 250 mcL) ile 100 mikrogram / mL PBS nemlendirilmiş bir 38 ° C inkübatör 4-8 saat (veya gece) poli-D-lisin bir çözüm kaplanmıştır. Lameller sonra steril dH 2 O ile poli-D-lizin bağlanmamış kaldırmak için 3 kez yıkanır ve kuru hava izin. Birçok nöron tipleri, kültür ortamında serum proteinlerine dahil edildikleri takdirde, poli-D-lizin yalnız ile kaplı lamelleri kültüre. Ancak, in vivo koşullarda daha alakalı sonuçlar doğal substrat molekülleri kullanılarak elde edilir. Laminin, fibronektin veya L1 CAM (1-20 mcg / ml PBS içinde) olarak bu moleküller Çözümleri, 4-8 saat veya gece için poli-D-lizin kaplı lamelleri doğrudan uygulanabilir ama bizim laboratuvarda rutin olabilir kat, hücre adezyon moleküllerinin protein substrat bağlama artırmak için uygulamadan önce nitroselüloz ince bir film tabakası ile hazırlanan lamelleri. </li><li> % 1, 5 ml% 100 amil asetat 5 g nitroselüloz eriterek nitroselüloz çözüm olun. 10 mcL lamel bu çözümü uygulayın ve hafifçe üzerine yayıldı. Hava kuruması 10 dakika. </li><li> 25 mcg / ml laminin veya 4 mg / ml PBS içinde L1 CAM ve nitroselüloz yüzeyine yayılmış bir çözüm 250 mcL uygulayın. Nemlendirilmiş bir 38 ° C inkübatör, aspirat substrat (veya gece) 4 saat inkübe ve kültür ortamı hemen eklemek Yüzey kuru değildir. </li></ol> 2. Nöronal Kültürler hazırlanması <ol><li> Embriyonik gün 7 civciv embriyosunda yumurtadan kaldırılır ve kültür ortamı içeren bir stereomikroskopta kullanarak, toraks ve karın iç organları kaldırmak için diseksiyon için% 10 serum ile 100 mm petri kaplarına yerleştirilir. </li><li> Embriyolar daha sonra orta ile durulanır ve sıvı besiyerinde 60 mm çanak taşındı ve daha dorsal kök gangliyon (DRG) veya nöral retina dokuları eksplantlar kaldırmak ve hazırlamak için disseke edilir. Hollenbeck ve Bamburg tarafından düzenlenen Hücre Biyolog, Yöntem ve Uygulamalar: Hücre Biyolojisi, hacim 71, Nöronlar ayrıntılı bir diseksiyon açıklamasına Yöntemleri olabilir. DRG eksplantlar 1/2-whole ganglionlar ve retina eksplantlar sinir çapı 1 mm veya daha az. </li><li> Eksplantlar gereksiz dokular temizlendikten sonra, bireysel eksplantlar kültür ortamı ile kültür yemekler zaten lamelleri, forseps saatçiler, taşınır. Diseksiyon mikroskobu altında, eksplant inkübatör taşıma sırasında hareket etmesini önlemek için forseps ile lamel merkezinde hafifçe bastırılır. Eksplantlarındaki B27 katkı maddeleri, 10 mM HEPES pH 7.4 ile tampon ve nemlendirilmiş bir 38 ° C inkübatör gecede yerleştirilen F12 orta kültür. Büyüme faktörleri gerektiği gibi kültür ortamı, katma olabilir. E7 DRG eklendi nörotrofinler olmadan eksplantlar nöronların aksonları uzatacaktır rağmen nörotrofinler genellikle, eski embriyolardan kültürlerin DRG eklenir. Nöral retinanın eksplantlarındaki olmadan bu kültür ortamında aksonlar uzatmakbüyüme faktörleri dding. </li><li> Kültürler yeterli aksonal akıbet aşağıdaki prosedürü başlamadan önce izin vermek için en az 18 saat süreyle inkübe edilir. </li></ol> 3. Rodamin aktin Permeabilization Tampon Hazırlanması <ol><li> 138 mM KCl, 10 mM BORU, 3 mM EGTA, 4mm MgCl 2 ve% 1 BSA (pH = 6.9) içeren permeabilization tampon stok çözelti 4 ° C11 2 hafta kadar saklanabilir. Kullanmadan önce son bir konsantrasyon için aşağıdaki bileşenleri eklenir:% 0.025 &#39;saponin, 0.1 mM ATP ve 100 nM Alexa-Florlu 350 Phalloidin. </li><li> Ayrı bir çözüm de bu aynı bileşenleri kullanmak artı 0.45μM rodamin olmayan kas aktin çözüm dönüşümlü vortekslenmiş rodamin-aktin kümeleri çözmek için 5 dakika için tritrated hemen önce taze olarak hazırlanır ve ilk permeabilization adımı sırasında 1 dakika için vortekslenmiş tüp içinde polimerizasyonu önlemek için. Buna rağmen, tüp filament montaj Sorun devam ederse, çözüm kullanmadan önce santrifüj olabilir. </li></ol> 4. F-aktin Dikenli Ends üzerine rodamin-aktin Nöronal Kültürleri ve Ortaklığın Permeabilization <ol><li> DRG veya retina eksplantlar ile bir kültür çanak dikkatle inkübatör kaldırılır ve aşağıdaki adımları oda sıcaklığında yapılır. </li><li> Çözümleri tüm değişiklikler dikkatle yapılmalıdır. Pipet lamel kenarında yer olmalıdır ve çözümler kaldırılır ve yavaş yavaş ve az güç ile eklenmelidir. </li><li> Kültür ortamı dikkatle pipet tarafından kaldırılır, fakat istikrarlı ve hücreleri karşılamak için yeterli permeabilization tampon 1 dakika (18mm x 18mm lamel ~ 60 mcL) eklenir. Kültür permeabilization tampon eklemeden önce başka herhangi bir çözümleri ile durulanır ve lamel permeabilization tampon eklemeden önce kurumasına izin değildir. </li><li> Permeabilization tampon yavaşça pipet tarafından kaldırılmış ve 4 dakika süreyle 0.45 mcM rodamin olmayan kas aktin içeren permeabilization tamponu ile değiştirilir. </li><li> % 4 paraformaldehid (laboratuvar notu, fosfat tamponu, pH 7.3 ile yapılan),% 0.05 glutaraldehid ve% 10 sukroz bir çözüm ekleyerek rodamin-aktin içeren tampon hafifçe pipet tarafından kaldırılır ve nöronlar sabit. 5 dakika fiksasyon sonra lamelleri hafifçe PBS ile durulanır, ve 3-inç cam slaytlar Slowfade monte. </li><li> Değişen çözümlere alternatif bir yaklaşım, bir akış hücresi kullanmaktır. Bu piyasada bulunan akış hücresi olabilir, ya da basit bir akış hücresi ayırıcılar olarak lamel köşelerinde küçük plastik parçaları (≤ 1 mm kalınlığında) koyarak ve daha sonra üst eşit büyüklükte bir lamel montaj olabilir lamel. Çözümler akışını hücrenin bir tarafında pipet yerleştirerek ve diğer tarafında bir fitil (pamuk veya Kimwipe) ile çözümler çekilerek değiştirilebilir. </li><li> Üzerine rodamin-aktin, F-aktin dikenli sona erer ve büyüme konileri F-aktin floresan-Phalloidin etiketleme dahil, 60X immersiyon yağı hedefi ile epi-floresans optik ile görüntülendi ve görüntüleri soğutmalı bir CCD kamera kullanılarak toplanır. Konfokal mikroskop gelişmiş görüntüleme sağlayabilir. </li><li> Rodamin-aktin dahil en iyi ölçümü için her görüntü için dijital kamera hassasiyeti aynı kazanç ve pozlama ayarlarını kullanarak tüm görüntüleri tek bir oturumda toplanan olmalıdır. Her görüntünün eşdeğer bölgelerden gelen etiketleme analizi yapılmalıdır; Metamorph, Resim J veya benzer bilgisayarlı görüntü analizi için araçlar kullanılabilir. </li></ol> BU İŞLEMİ VE DEĞİŞİMLER 5. Bir Varyasyon: Canlı Hücre Görüntüler rodamin-aktin Etiketleme önce toplayın <ol><li> Video yemekler ısıtılmış bir mikroskop sahneye yerleştirilir, ve canlı büyüme konisinin görüntüleri toplanır. Izgara lamelleri kullanılabilir, ya da gravür ve / veya kalem işaretleri lamel etiketleme sonra belirli hücreleri bulmak için daha kolay yapılabilir, veya video çanak prosedürün süresi için mikroskop sahnede yerinde sabit olabilir. </li><li> Rodamin-aktin Permeabilization, birleşme ve hücre sabitleme ya da mikroskop sahneden ya video çanak yapılır. Düzeltmeden sonra, PBS, hemen görüntüleme için video yemekleri eklenir. Daha sonra görüntüleme için örnek korumak için, slowfade montaj orta lamel eklenir ve eşit büyüklükte bir lamel yavaşça (baloncuklar kaçınarak) üstüne yerleştirilir ve kenarları, sonra da açık bir oje ile mühürlenir. </li></ol> 6. Varyasyon İki: Co-etiket Ek Proteinler İmmünokimya <ol><li> (4.2-4.4) Yukarıda açıklandığı gibi rodamin-aktin birleşme ve fiksasyon, lamelleri veya video yemekler kültüre nöronlar yapılabilir. </li><li> Fiksasyon sonra, PBS içinde durulama, hücreler 15 dakika PBS içinde 0.1 M glisin ile tedavi edilen ve daha sonra çıkarılan% 0.1 Triton X-100, 1 saat süreyle% 2 keçi serum ve% 1 BSA ile PBS (TX-100) Lameller1 saat için% 1 BSA içeren PBS ile sulandırılmış primer antikorlar ile inkübe Lamelleri sonra durulanır ve 1 saat için% 1 BSA ile PBS 1:1000 dilüsyon floresan sekonder antikor uygulamadan önce% 2 keçi serum ve 1 saat süreyle% 1&#39;lik BSA ile PBS TX-100,% 0.1 &#39;inkübe Durulandıktan sonra, lamelleri tekrar 30 dakika süreyle% 2 keçi serum ve% 1 BSA ile% 0.1 TX-100 PBS içinde inkübe durulanır ve anti-solmaya orta monte edilmiş. Bazı proteinlerin lokalizasyonu, ilk permeabilization adım (4.3) tarafından bozulur. Bu proteinlerin antikorlar ile lokalizasyonu,% 0.05 paraformaldehid ve% 0.05 glutaraldehid korumak için dikenli rodamin-aktin sonuna etiketleme etkilemeden (rodamin-aktin eklemeden önce yani) 1 dk permeabilization tampona eklenmiş olabilir. </li><li> Üçlü etiketli büyüme konileri Görüntüler floresan veya konfokal mikroskopi toplanır. </li></ol> 7. Varyasyon Üç: F-aktin Ücretsiz Dikenli Ends Rehberlik Cues Etkilerinin Değerlendirilmesi <ol><li> Bir büyüme faktörü veya rehberlik işaret inkübatör çanak kaldırılması ve permeabilization yordama başlamadan önce, birkaç dakika için birkaç ng / ml (ya da uygun bir tedavi süresi) konsantrasyonları inkübatör kültür yemekleri eklenir. Bu F-aktin ücretsiz dikenli ucunda büyüme faktörleri veya rehberlik ipuçları kısa vadeli etkilerinin değerlendirilmesi sağlar. </li><li> Isınmış bir mikroskop sahnede yer nöronal kültürlerin bir video çanak ve büyüme faktörleri veya rehberlik ipuçları permeabilization ve rodamin aktin dahil başlamadan önce bir büyüme konisi yakınındaki bir degrade bir mikropipet serbest olabilir. Örneğin, NGF nöral retina ganglion hücrelerinin nöron veya Netrin DRG için serbest bırakılabilir. Pipet permeabilization prosedürü başlamadan önce 1-2 dakika gibi kısa bir sokulabilir. Bu büyüme konisi önde gelen marjları (resimler için referans atıf 10) F-aktin ücretsiz dikenli biter oluşumu üzerine bir hidayet işaret degrade yerel etkilerin değerlendirilmesi sağlar. </li><li> Bu varyasyonlar, yukarıda 6.2 &#39;de açıklandığı gibi, diğer nöronal bileşenleri antikor-aracılı etiketleme ile kombine edilebilir. </li></ol> 8. Varyasyon Dört: transfekte Nöronlar F-aktin Ücretsiz Dikenli Sona Etiketleme <ol><li> RNAi (floresan tanımlayıcı işaretleyici) ile yapısal olarak aktif ya da dominant-negatif yapıları veya protein demonte kullanımı F-aktin ücretsiz dikenli biter düzenleyen bir protein katılımı değerlendirmek için kullanılabilir. Protein, büyüme konisi içinde bulunduğu lokalizasyona bağlı olarak, floresan etiketi erimiş ise, transfekte hücreler, floresan ifade protein permeabilization üzerine kaybolmuş olabilir. Bu durumda, video yemekleri transfekte hücreli mikroskobik permeabilization önce bir tanımlamak için kullanılan olabilir ve permeabilization transfekte hücrelerinin konumları işaretleme sonra mikroskop sahnede yapılabilir. Alternatif olarak, GFP-aktin inşa ilgi GFP-inşa co-transfekte olabilir. Bu durumda, GFP-aktin F-aktin içine dahil olacak ve permeabilization sonra transfekte hücrelerinin kimlik sağlayan, permeabilization kayıp olmayacak. </li><li> Bu değişim, yukarıda 7,1-7,3 açıklandığı gibi, rehberlik ipuçlarının ilavesi ile kombine edilebilir. </li></ol> 9 - Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. NGF, Küresel ek DRG bir büyüme konisinin 5 dakika boyunca sinir büyüme faktörü (NGF) ile uyarılır, aktin polimerizasyonu önde gelen marjı uyarılır. Toplam F-aktin ve büyüme konisinin önde gelen marjı F-aktin dikenli biter artar ve rodamin-aktin etiketleme parlak bir grup, büyüme konisi çevre etrafında görülür. Şekil 1 unstimulated DRG büyüme konisi ve NGF-uyarılmış DRG büyüme konisinin içine rodamin-aktin dahil karşılaştırır. Birleştirilen görüntülerin yeşil floresan Phalloidin büyüme konisinin etiketleme ve F-aktin kırmızı rodamin-aktin etiketleme. Dikenli sonuna etiketlenmesi için iyi bir kontrol, 4.2 ve 4.3 adımları permeabilization tampon 10-6 M veya daha yüksek cytochalasin B veya D eklemek için. Cytochalasins kap F-aktin dikenli biter ve dikenli biter rodamin-aktin bağlayıcı inhibe ederler. Bu ciddi rodamin-aktin hücre içine dahil azaltmak veya ortadan kaldırmak gerekir. Ölçek barlar, 10 mm. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. NGF degrade yerel F-aktin dikenli biter artar. Bültenleri NGF DRG büyüme konisi, F-aktin ücretsiz dikenli biter etiketleme 2 dakika boyunca bir tarafında getirilen olduğunu mikropipet. Aşağıdaki resimler NGF bir degrade yerel pipet yakın büyüme konisi bölgenin F-aktin ücretsiz dikenli biter artışa yol açar maruz kalmanın göstermektedir. Birleştirilen görüntünün yeşil Phalloidin gösterirve kırmızı rodamin-aktin. Ölçeği bar, 10 mm. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Aktif ERM proteinler büyüme konisinin önde gelen marjı birikir. Phospho-Ezrin/Radixin/Moesin İmmünositokimyasal etiketleme (Perm), F-aktin ücretsiz dikenli biter . ERM yerelleştirme korumak için bir dakika süreyle ilk permeabilization tampon gluteraldehid (% 0.05) ve paraformaldehid (% 0.05) eklendi. Rodamin-aktin, kırmızı; PERM, yeşil; Phalloidin, mavi. Ölçeği bar, 10 mm. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Aktin polimerizasyonu uyarılması aktif ERM proteinleri gerektirir. Grubuyla DRG&#39;ler GFP-aktin ve GFP kontrolü plazmid ya da dominant-negatif Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM) inşa birlikte transfekte edildi. GFP-aktin permeabilization sonra transfekte hücrelerinin belirlenmesini sağlar. Burada, NGF F-aktin dikenli biter etiketleme önce 5 dakika eklendi. DN ERM ile transfekte büyüme konisi, yakındaki bir untransfected büyüme konisi (alt paneller) ile tezat büyüme konisinin önde gelen marjı (alt-orta panel), ya da dikenli sonuna GFP kontrolü (üst orta panelde) seviyeleri azalttı. Rodamin-aktin, kırmızı, GFP-aktin, yeşil. Ölçek barlar, 10 mm.

<ol>
	<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+Understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li><li>Letourneau, P., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Pathfinding:+Extracellular+Matrix+Role.">Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 1139-1145 (2008).</li><li>Kalil, K., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Touch+and+go:+Guidance+cues+signal+to+the+growth+cone+cytoskeleton.">Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton.</a> Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).</li><li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance.">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40, 209-227 (2003).</li><li>Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins+take+the+reins+in+growth+cones.">Actin-binding proteins take the reins in growth cones.</a> Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).</li><li>Guan, K. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues.">Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).</li><li>Gallo, G., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+growth+cone+actin+filaments+by+guidance+cues.">Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues.</a> J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).</li><li>Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulating+filopodial+dynamics+through+actin-depolymerizing+factor/cofilin.">Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin.</a> Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).</li><li>Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/cofilin:+A+functional+node+in+cell+biology.">ADF/cofilin: A functional node in cell biology.</a> Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).</li><li>Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ADF/cofilin+mediates+attractive+growth+cone+turning+toward+nerve+growth+factor+and+netrin-1.">Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1.</a> Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).</li><li>Symons, M. H., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+polymerization+in+live+and+permeabilized+fibroblasts.">Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts.</a> J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).</li><li>Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+stimulates+an+increase+in+actin+nucleation+and+filament+number+at+the+leading+edge+of+the+lamellipod+in+mammary+adenocarcinoma+cells.">EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells.</a> J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).</li></ol>

Yöntemleri, büyüme konileri geçiş önde gelen marjı aktin hücre iskeletinin dinamik remodeling katılan hücresel bileşenlerinin zamansal ve mekansal çözünürlükte izin sundu. NGF veya Netrin gibi cezbedici molekülleri, hızla aktin filament polimerizasyonu teşvik etmek için Şekil 1 ve 2&#39;de gösterildiği gibi aktin dikenli biter aktif ADF / cofilin 10 aktin filament kesilmesinin tarafından oluşturulan yerel bir artış, eylem olarak ortaya çıkıyor. Bu yöntem radixin, Şekil 3 ve 4 r...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>18x18 mm coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>351008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aquarium cement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAP 100% silicone aquarium sealant</td>
<td>Any hardware store</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine (mw &gt; 300,000)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Natural mouse laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L1 CAM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R &amp; D systems</td>
<td>777-NC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa-fluor 350 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
<td>A22281</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine non-muscle actin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
<td>APHR-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F12 Culture medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>21700-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slowfade </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>536937</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

labeling f-actin barbed ends with rhodamine-actin in permeabilized neuronal growth cones

Büyüyen aksonlar hareketli ipuçları büyüme konileri denir. Büyüme konileri, gelişmekte olan dokularda büyüme konisi reseptörlerine bağlanır ve yerel dinamikleri ve büyüme koni hücre iskeletinin 3-6 organizasyonu düzenleyen ifade edilen moleküler rehberlik ipuçları ile etkileşim yoluyla aksonlar seyreden yol açmaktadır. Bu seyir sinyallerinin ana hedefi, büyüme konisi çevre ve aktin polimerizasyonu sürekli ve dinamik bir yeniden şekillenme 7 ile bu sürücüleri büyüme konisinin motilite doldurur aktin filament ağda . Pozitif ya da çekici rehberlik ipuçları uyarıcı aktin filament (F-aktin) cezbedici işaret kaynağı yakın büyüme konisi çevre bölgede polimerizasyonu dönüm büyüme konisi neden olur. Bu aktin polimerizasyonu sürücüler, önde gelen marjı ve cezbedici doğru aksonal uzama yerel büyüme konisi çıkıntı, yapışma. Aktin filament polimerizasyon yeterli aktin monomer durumu ve ek monomer polimerizasyonu çekirdekleri veya aktin filament dikenli biter bağlıdır. Aktin monomeri civciv retina ve dorsal kök gangliyon (DRG) büyüme konileri bol miktarda mevcuttur. Sonuç olarak, F-aktin dikenli biter monomer eklenmesi için kullanılabilir hale polimerleşme hızla artmaktadır. Bu daha yakın bir cezbedici 8-10 büyüme koni bölgede faktörü (ADF / cofilin) ​​depolymerizing F-aktin kesilmesinin protein aktin yerel aktivasyon ile civciv DRG ve retinal büyüme konileri oluşur . Bu artan ADF / cofilin aktivite, yeni F-aktin polimerizasyonu için dikenli biter oluşturmak için aktin filamentler koparır. Aşağıdaki yöntem bu mekanizma ortaya koymaktadır. F-aktin Toplam içerik floresan Phalloidin ile boyanarak görünür hale getirilir. F-aktin dikenli uçları diğer hareketli hücreler 11, 12, önceki çalışmalarda adapte aşağıdaki açıklanan prosedüre permeabilize büyüme konileri içinde rodamin-aktin kuruluş tarafından görüntülenmiştir. Rodamin-aktin, aktin monomeri dikenli biter eklenmesi için kritik konsantrasyon üstünde bir konsantrasyon eklendiğinde, rodamin-aktin ücretsiz dikenli uçları üzerine toplanır. Çekici ipucu gibi bir büyüme konisinin bir tarafa yerleştirilmiş bir mikropipet serbest bırakılması gibi bir degrade, sunulan ise, F-aktin dikenli uçları üzerine rodamin-aktin katılması doğru mikropipet 10 büyüme konisinin tarafında daha fazla olacaktır . Büyüme konileri küçük ve narin hücre yapıları. Permeabilization, rodamin aktin dahil, fiksasyon ve floresan görselleştirme işlemleri titizlikle yapılmaktadır ve ters bir mikroskop sahnede yapılabilir. Bu göç eden nöronlar, diğer birincil doku hücrelerinin veya hücre hatları yerel aktin polimerizasyonu eğitim yöntemleri uygulanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones at JoVE.com

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Nöronal büyüme konileri dikenli biter görselleştirmek ve F-aktin ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Cam lamelleri kültür nöronlar sonra, hücreler saponin içeren bir çözüm permeabilize. Sonra, rodamin-aktin içeren saponin tamponu ile kısa bir inkübasyon ücretsiz aktin dikenli uçları üzerine floresan aktin içermektedir.

Nöronal Büyüme Konileri permeabilize rodamin-aktin ile F-aktin Dikenli Ends Etiketleme

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

labeling-f-actin-barbed-ends-with-rhodamine-actin-permeabilized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K Görüntüleme.  University of Minnesota. Nöronal büyüme konileri dikenli biter görselleştirmek ve F-aktin ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Cam lamelleri kültür nöronlar sonra, hücreler saponin içeren bir çözüm permeabilize. Sonra, rodamin-aktin içeren saponin tamponu ile kısa bir inkübasyon ücretsiz aktin dikenli uçları üzerine floresan aktin içermektedir.

Video: Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Nörobilim

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Anestezi Rat Silikon Probları Büyük ölçekli Nöronal Toplulukları Kaydı

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Floresan Boyalar Yetişkin Zebra balığı Retina Ganglion Hücreleri retrograd Etiketleme

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

Tek Hücre Hassas Nevronik Co-kültürler hazırlanması

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...