Bu çalışma EY Sağırlık Araştırma Vakfı Araştırma Fonu tarafından desteklenen ve NIDCD DC005211 İşitme ve Denge Merkezi, Johns Hopkins Üniversitesi EG ve DC006476 NIDCD oldu. Artwork telif hakkı Tim Phelps, Johns Hopkins Üniversitesi. LG, ilk el yazması yazdı, EY ve LG diseksiyonu ve kayıt çekildi. Tüm yazarlar timsalimiz rakamlar ve yazının yazma katkıda bulunmuştur.

1. Çözümler <ol><li> Çözümler önceden hazırlanmış olabilir. Ekstrasellüler çözümleri, bir ay kadar 4 ° C&#39;de saklanabilir. Iç çözüm alikotları (-20 ° C) dondurularak saklanabilir. Çözümleri, deney başlamadan önce oda sıcaklığında olduğundan emin olun. </li><li> Diseksiyon çözüm ve ekstrasellüler kayıt çözeltisi (mM): 5.8 KCl, NaCl 144; 0.9 MgCl 2; 1.3 CaCl 2; 0.7 NaH 2 PO 4, 5.6 glukoz, 10 Hepes; 1 Na piruvat, pH 7.4 (NaOH), 300 mOsm . İHK Ca 2 + mevcut izolasyon ekstraselüler çözüm gösterildiği gibi değiştirilebilir: 5.8 KCl, NaCl 114; 0.9 MgCl 2; 1.3 CaCl 2; 0.7 NaH 2 PO 4, 5.6 glikoz; 10 Hepes; 30 ÇAY Cl; pH 7.4 ( NaOH ); 300 mOsm. </li><li> 1-2 mcM tetrodotoxin (TTX) voltaj kapılı sodyum kanalları, eksitatör postsinaptik akımları veya potansiyelleri (EPSCs veya EPSPS) blok ve izole etmek için ekstrasellüler çözüm eklenebilir. </li><li> Hücre içi kayıt çözümü (mM): 20 KCl; 110 K-methanesulfonate 5 MgCl 2, 0.1 CaCl 2, 5 EGTA; 5 Hepes; 5 Na 2 ATP 0,3 Na 2 GTP; 5 Na 2 phoshocreatine; pH 7,2 (KOH), 290 mOsm; veya 135 KCl, 3.5 MgCl 2; 0,1 CaCl 2; 5 EGTA; 5 Hepes; 4 Na 2 ATP 0,2 Na 2 GTP; pH 7,2 (KOH), 290 mOsm. Hücre içi bir çözüm için İHK Ca 2 + mevcut izolasyon: 135 CsMeSO3; 13 ÇAY Cl 3.5 MgCl 2; 2.5 Na 2 ATP, 1 EGTA; pH 7,2 (CsOH); 290 mOsm. Bu çözüm, çok daha büyük bir K + conductances Ca 2 bırakarak + güncel kalan önemli bir miktar engeller . </li></ol> 2. Dissected Doku Tutucular <ol><li> Modifiye lamelleri kayıtları hazırlanması sırasında yerinde tutmak için kullanılır, ayrıca önceden hazırlanmış olabilir. </li><li> Sylgard (Dow Corning, Midland, MI), dairesel bir cam lamel (8-12 mm) kenarına doğru bir damla uygulayın. Lamel ince bir böcek pin (FST, öğe 26.002-10) kalın ucunu yerleştirin. Böcek pin bardak forseps ile sıkıca tutun ve sylgard ayarlamak için ısıtmalı bobin yakın tutun. </li></ol> 3. Elektrotlar yapma <ol><li> Deneysel her gün taze elektrotlar ve hava geçirmez bir kutuya saklayın hazırlayın. Her hazırlanması için on ile yirmi elektrotlar üretmektedirler. </li><li> Elektrot cam seçin; 1 mm borosilikat cam kapilerleri (TEFE, Sarasota, FL 1B100F-4). </li><li> Bir ucu çapı yaklaşık 2-3 mikron (M ~ 6 Yukarıda açıklanan çözümler) elektrotlar çekmek için bir çok adım çektirmenin bir program tasarlayın. Biz bir Sutter P-87 multi-step yatay çektirmenin veya Narishige dikey PC-10 çektirmesi kullanın. </li><li> Dikkatle kat olarak Sylgard elektrot şaft ucu mümkün olduğu kadar yakın. Bu pipet kapasitans ve en aza indirir kayıt gürültü azalır. </li><li> Yangın lehçe TEFE o mevcut olarak ısıtılmış bir filament microforge kullanarak elektrotlar. Yangın cilalı elektrotlar, bir dış ucu çapı yaklaşık 1 mikron (yukarıda açıklanan çözümler M 10-15) olmalıdır. Pipet duvar kalınlığı yaklaşık 1 / 3 mm. Dış çapı yamalı afferent bouton boyutu hakkında sahiptir. </li><li> Eşzamanlı kayıtlar uygulanması halinde: IHC pipet yangın parlatma ~ 3 mikron (6 - 8 M) daha büyük bir ucu çapı terk etmesi gerektiğini ayrım ile, aynı şekilde (aynı cam, aynı çekme programı) inşa edilmelidir. </li></ol> 4. Deney Kurma <ol><li> Ekstraselüler çözüm ve ilaç ya da ilgi toksinler içeren test çözümleri ile yerçekimi beslenen perfüzyon sistemine bağlı odaları doldurun. </li><li> O banyo hacmi yaklaşık 2 ml böylece perfüzyon ayarlayın, sürekli sipariş üzerine 1.5 mL dk-1 hızında serpmek. </li><li> Farklı çözümler yerel bir perfüzyon sistemi ile deney sırasında uygulanacak ise, çözüm rezervuarlarının doldurun. Sistem üzerinden çözümler çalıştırın ve hiç hava kabarcığı olmadığından emin olmak. </li></ol> 5. Diseksiyon ve Numune Hazırlama <ol><li> İlişikteki film, üç hafta önceki doğum sonrası aşamalarında daha zor yaşlı sıçanlar (Sprague Dawley, Charles Nehri), Corti organı diseksiyonu göstermektedir. Tartışmaya farklı yaşlarda sıçanlardan alınan kayıt avantajları ve dezavantajları gözden geçirildi. </li><li> Derinden izofluran inhalasyonu ile sıçan uyuşturan. Çekilme refleksleri ve kornea refleksleri ciddi Depresyonda olduğunuz zaman, başını kesmek. Bu prosedürler, Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. </li><li> Dekapite baş burnu ve cilt çıkarın. Baş Çentikli ve beynin temporal kemikleri açığa çıkarmak. </li><li> Temporal kemik ve yerde her iki standart ekstrasellüler çözüm içeren temiz diseksiyon yemekler çıkarın. </li><li> Kaldırmakkoklea maruz şekilde kemik temporal kemik encapsulating. Temporal kemik üssünde bir çift forseps ile güvenli bir şekilde tutun. Yuvarlak ve oval pencere tanımlayın. Oval pencere ve koklea yüz yukarı spirallenen tarafında ve koklea çevresinde aşırı kemik kaldırmak böylece koklea yolunuzu. </li><li> Apikal bobin, deney için kullanılan korumak için özen koklea duyu epitel maruz encapsulating kemik çıkarın. Kemik geri kalanından daha şeffaf alan ile başlayan, doğrudan koklea kapalı kemik parçasından ince forseps ikinci bir çifti kullanın. Burada kemik ince ve kaldırmak kolay. Apikal bobin etrafında kemik kaldırmaya devam edin. </li><li> Apikal dönüş altında modiolus kesti mikro diseksiyon makas kullanın. Sonra kokleanın düşük döner apikal dönüş bağlantısını kesin. </li><li> Apikal da tamamen kesilmiş olduğundan emin olmak için, gerekirse, yine mikro diseksiyon makas kullanın. Apikal bobin korumak için dikkat edin; çekti ya da gergin olmamalıdır. Koklea geri kalanından apikal dönüş koaksiyel ince pens kullanın. </li><li> Apikal dönüş her iki tarafın kemik kalan çıkarın. </li><li> Stria vascularis doku, saç hücresi bölgedeki (Şematik 1) dışında yer alan parlak bir şerit dikkatlice çıkarın. Kolayca stria vascularis ile birlikte müstakil hale gelebilir duyusal saç hücreleri, kaldırma önlemek için emin olun. </li><li> Ince forseps örtü membran, duyusal saç hücreleri üzerinde oturur, parlak, yarı saydam bir zar ayırmak için kullanın. </li><li> Şimdi aşırı doku ve kemik düzeltme ve forseps ile hazırlık düzleştirmek. Bu doku, bir iğne altında eşit yerleştirilir, böylece gerekli. </li><li> Pin altında lamel (önceden hazırlanmış) bağlı bakımı, saç hücreleri uzak pin konumuna hazırlık yerleştirin. </li><li> Forseps kayıt odasına lamel aktarmak için kullanın. Koklear doku tamamen lamel transfer ederken ekstrasellüler çözüm bir damla ile kaplı olduğundan emin olun. Kayıt sırasında hareket etmez emin odasının cam alt lamel üzerine sıkıca bastırın. </li><li> Hemen hazırlanması daha iyi bir yaşam sağlamak için, ekstrasellüler solüsyonu ile perfüzyon başlar. </li></ol> 6. Kayıt <ol><li> 10x ve 40x suya daldırma DIC hedefleri kullanarak mikroskop göz mercekleri ile hazırlık bulun. Kayıt elektrotları IHC lateral duvara dikey olarak IHCs yaklaşım böylece hazırlık yolunuzu. </li><li> Hazırlık IHCs bazal bölgedeki görünürlüğü sınırlayan kıvrılmışsa, IHCs kendileri basarak özen, cam lamel karşı hazırlık dış kenarı aşağı itmek için bir kayıt elektrodu kullanmak. </li><li> * Bu aşamada, genç sıçan kullanarak, saç hücreleri üzerinde hücre destekleyen kalın bir tabaka duyu hücreleri 1, 12 erişmek için bir temizlik pipet (~ 10-20 mm bir ucu çapı) ile temizlenebilir olabilir . </li><li> Dokusunun sağlıklı olup olmadığını değerlendirmek için monitörün kullanın. Mikroskop ve NC70 Newvicon kamera arasında bir 4X büyütme lens ile görüntü ve projeler mikron 2 monitör 4800 hakkında bir alanı daha da büyütür . Saç hücreleri sağlam saç demetleri ile uzun olmalıdır. Doku bozulduğunda, saç hücrelerinin şişmesine ve daha şeffaf ve grenli. </li><li> IHCs tabanı etrafında afferent BOUTONS Localize. BOUTONS, yaklaşık 1 mikron çapında yuvarlak veya elips ve renkli parlak bir görünüm ışık vardır. BOUTONS çoğunluğu çekirdeğin seviyesinin altında lokalizedir. Doku sağlıksız BOUTONS oldukça parlak değil, normal boyutunun yaklaşık 4 kez şişer ve şeffaf olmak. </li><li> Hücre içi bir çözüm ile kayıt elektrodu doldurun, pozitif basınç uygulayın ve mikromanipülatör hazırlanması manevra elektrot kullanmak. </li><li> Elektrot ile İHK tabanı düzeyinde hazırlanması bir kesi olun. IHCs baz alan bir erişim yolu sahte pozitif basınç kullanarak, hücreler ve IHCs destekleyen ince bir tabaka arasındaki elektrot itin. Bu adım, afferent bouton ulaşan ve afferent sonlar sıkıca ensheath hücreleri destekleyici kayıt için değil &quot;anahtar&quot;. </li><li> Elektrot dikkatlice çıkarın ve taze dolu bir elektrot ile değiştirin. </li><li> İHK membran temiz bir erişim delikten elektrot ucu, manevra elektrot korumak için pozitif basınç kullanma. Pozitif basınç IHCs saran destekleyici hücrelerin etrafındaki hareketli yardımcı olmalıdır. </li><li> Eşlik eden filmde gösterildiği gibi afferent bouton (doğru bitişik destekleyici hücrelerin etrafındaki elektrot taşıyın. Alternatif bir yaklaşım, hareket eden bir afferent bouton yaklaşımuzun IHC membran elektrot ucu kadar) bouton dokunur. Elektrot ucu (hala bouton ve pipet pozitif basınç nedeniyle elektrot arasında küçük bir boşluk var) afferent bouton önünde olduğundan emin olun. BOUTONS pipet hareketine destek hücreleri ve İHK membran daha fazla direnç sunar; deneyci tarafından &quot;hissedilir&quot; olabilir. </li><li> Pipet ve aşağı yukarı hareket ettirin ve emin olun ki bouton hamle itin. Bu pipet ve bouton aynı Z-düzleminde olduğunu gösterir. </li><li> Afferent bouton karşı bastırdı elektrot ile aynı anda bırakın ve pozitif basınç emme GΩ bir mühür formu için geçerli. Afferent bouton bir GΩ mühür oluşumu bir saç hücresi üzerine benzer. Seal oluşumu hızlı ya da yavaş yavaş ortaya çıkabilir. </li><li> Membran rüptürü emme elektrot içinde nazik patlamaları uygulayın ve tüm hücre kayıt yapılandırma girmek. </li><li> Yamalı bir afferent bouton hücre ise, küçük kapasitif transientler (bkz. Şekil 1), sızdırmazlık oluşumu sırasında izlenen test kare dalga görünecektir. 1.8 pF (3, 4) - Biz, 0.4 olarak afferent biten kapasitans tahmin etmektedir . Yamalı hücre IHC ise, geçici sipariş üzerine erişim direnç bağlı olarak 3-5 kat daha büyük olacaktır. </li><li> Hücrenin bir afferent bouton olduğunu onaylamak için, gerilim adımları hiperpolarizan ve depolarizan ile bir protokol çalıştırın. Afferent lifleri ve IHCs (afferent bouton için amaçlayan çoğu zaman yanlışlıkla yamalı) için geçerli gerilim ilişkileri (IVs) bireysel hücre türleri için karakteristik ve Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. </li><li> Membran potansiyeli Monitör; bir afferent lif, -60 ile -65 mV civarında normalde. </li><li> Taze dolu bir elektrot ile 13 - hücre afferent bouton değilse, elektrot ve adımları tekrarlayın 8 kaldırmak. Her girişimi için yeni bir elektrot kullanın. </li><li> Monitör seri direnç mühür kadar kapanış olmadığı sağlamak için gerilim adımları uygulayarak kayıt boyunca. Seri direnç artarsa, emme hafif darbeler uygulamak ya da geriye doğru hafifçe elektrot hareket etmek yararlı olabilir. Serisi dirençleri M tipik olarak 30 civarında. Sinaptik aktivite analiz ederken, biz daha büyük M 50 serisi dirençler ile kayıtlar atın. </li><li> Artık (bkz. Şekil 3), sinaptik aktivite kaydedebilirsiniz. Ya afferent lif spontan aktivite gösterir, ya da saç hücresi verici sürümü etkinleştirmek için depolarize olması gerekir. Yüksek potasyum konsantrasyonu (örneğin 40 mM) ile ekstrasellüler bir çözümü uygulayarak saç hücre depolarize ve verici sürümü oranı genellikle etkinleştirmek veya artırmak. </li><li> IHCs ve afferent BOUTONS 2 eş zamanlı kayıtları için, prosedür şu şekilde değiştirilmelidir: 1 - 5 için adımlar ile devam edin . Karşılık gelen hücre içi Ca 2 çözüm + mevcut izolasyon IHC pipet doldurun ve 6 da gösterildiği gibi uygulayın. Kaydedilmelidir IHC yakın &quot;bekleme pozisyonu&quot; IHC kayıt için pipet bırakın. 14 afferent kayıt için adım 6 ile devam edin. Afferent pipet tüm hücre yapılandırması olduğunda IHC pipet ile devam ediyor. Ilgili IHC lateral duvara doğru manevra ikinci pipet, her zaman pozitif basınç sağlamak. İHK, basınç yoluyla lateral duvara bir girinti ve destekleyici hücrelerin ayrılmış olduğunu sağlanmalıdır. Adımlar 12 - 13 sıra IHC için uygulanabilir. Afferent lif göre, 14 belirtilen, büyük kapasitif transientler karakteristik IV ilişkiye ek olarak, bir IHC kayıt bir işaretidir. İHK yıkamak için hücre içi çözümler için bir kez eş zamanlı kayıtları, bir süre (5 dk, 3) seri direnç bağlı olarak izin verilmelidir kurulur. Bu büyük Ca 2 +, çok büyük bir K + conductances artan blok nedeniyle akımlar neden olacaktır. </li><li> GΩ mühür yerine gerçekleştirmek için adım 12, ekstraselüler kayıtları gevşek mühür, afferent bouton üzerine M 30 ila 50 gevşek bir mühür. Bu pozitif basınç serbest iken daha az emme uygulayarak elde edilebilir. P21 sıçan afferent bouton ekstraselüler kayıt bir örnek için Şekil 5&#39;e bakınız. </li></ol> 7. Sorun Giderme <ol><li> Mühürler oluşmuş olabilir, ancak tüm hücre hücre bağlı kayıt geçişi elde edilemez, pipet iç çapı çok dar olabilir. </li><li> Sızdırmaz oluşan mümkün değilse, pipet iç çapı çok büyük olabilir ve tüm bouton elektrot içine kadar emdi olabilir. </li><li> Sinaptik tüm olaylar, küçük ve düzgün ise, kayıt afferent ekstrasellüler olabilir. Testi pozitif membran potansiyelleri olayların iptali için intraselüler kaydedildiEPSCs olumlu potansiyelleri tersine dönecektir. </li><li> Eğer seri dirençler sürekli yüksek yama afferent terminallerde, tüm hücre yapılandırması içine kırmaya çalışmadan önce geriye pipet hareket çalıştığınızda. Bu pipet tıkanma ve yüksek erişim direnci önlemeye yardımcı olur. </li><li> Korkusuzca pipet pozisyonu düzeltilmelidir. Afferent mühür &quot;kaybetme&quot; olmadan, yüksek direnci veya pipet tıkanma azaltmak için elektrot taşımak mümkündür. İHK, eş zamanlı kayıt kuruluşu sırasında, genellikle bouton doğru itti &#39;. Afferent pipet konumu buna göre düzeltilir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2442/2442fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. AB. Tipik transientler bir 10 mV -94 mV bir holding gerilim gerilim komut hiperpolarizan yanıt afferent lif (A) ve İHK (B) kaydetti. , Dar pipet çaplı ve yüksek erişim direnci, İHK kayıt nedeniyle tüm hücre IHC kayıt için suboptimal (B). Kayıt sadece IHCs ve afferent lifleri kapasitif transientler arasındaki farkı göstermek için burada gösterilir. Bu tam hücreli yapılandırma oluşturan hücre tipleri ayırt etmek için yardımcı olabilir. IHCs tam hücreli kapasitif transientler afferent liflerin daha genlik 5 kat daha büyük sipariş üzerine CD. A &amp; B Geçici genişletilmiş bir zaman çizelgesi üzerinde gösterilir. C. afferent yanıt çürüme iki üstel uygun olabilir. Afferent bitiş kapasitans hızlı bileşeni tahmin edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2442/2442fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 IV afferent bouton (A) ve (B) bir IHC ilişkiler. IV ilişkiler bir holding potansiyeli -84 mV ile -124 mV 10 mV aralıklarla (nominal gerilimleri) + 36 mV gerilim adımları kayıt altına alınır. Gerilimleri bazı izleri sağ gösterilmiştir. Bu kayıtlar, 5.8 mM ekstrasellüler KCl ile oda sıcaklığında yapılmıştır. Her ikisi için de Ölçek: 500 pA, 200 ms. 19 postnatal günde bir afferent lif IV ilişkiler. EPSCs gerilim adımları çoğunluğu sırasında; EPSCs 6 mV pozitif ters. Bu kayıt, voltaj kapılı Na + akımları engellemek için TTX huzurunda gerçekleştirildi . Hiperpolarizan gerilimleri (I h) yavaş aktive içe akım unutmayın. Bu akım IHCs veya destekleyici hücrelerin mevcut değildir ve kaydedilen hücre afferent lif (3) B iyi bir gösterge sağlar. P19 IHC IV ilişkiler. Dar pipet çapı ve yüksek erişim direnci nedeniyle, kayıt IHC akımlar ve akımlar beklenenden daha küçük karakterize için suboptimal. Kayıt sadece bir afferent lif kayıt çalışıldığında açıkça ayırt edilebilecek IHCs ve afferent lifleri IV ilişkileri göstermek için burada gösterilir. Not gecikmiş düzeltici K + akımları 13 olumlu potansiyeller (ok) hızlı aktive dışa K + akımları. <img src="/files/ftp_upload/2442/2442fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 IHC serbest bırakma oranını artırmak için 40 mM ekstrasellüler K + varlığında doğum sonrası 21. günde bir afferent lif kaydedilen timsalimiz sinaptik akımlar. TTX oda sıcaklığı, voltaj kapılı Na + akımları engellemek için uygulanan bir. Ölçek 200 pA, 5 ms, EPSCs değişken boyutu ve şekli dikkat edin. EPSC özellikleri ayrıntılı bir açıklama için: 4 B. A (: multifazik, o: # monofazik) işaretli iki EPSCs genişletilmiş bir ölçekte gösterilir: Ölçek 100 pA, 1 ms. <img src="/files/ftp_upload/2442/2442fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 Eşzamanlı bir IHC Corti, doğum sonrası 10. günde (2) eksize sıçan organ afferent bouton başvurarak kayıt ve İHK depolarizan gerilim adım nörotransmitter salınımı kışkırtır ve afferent bouton EPSCs aktive Üst izleme: IHC depolarizasyon için gerilim protokol. Holding potansiyeli -79 mV, 50 ms adım -29 mV Orta iz: L-tipi Ca 2 + IHC kaydedilen akımları genellikle küçük inaktivasyon göstermek ve negatif potansiyeller etkinleştirmek Alt iz: yanıt olarak afferent lif Synaptic akımları İHK depolarizasyon. 50 ms IHC depolarizasyon sırasında sinaptik depresyon unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2442/2442fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5. A doğum sonrası 21. günde bir afferent bouton timsalimiz ekstraselüler bir kayıt. Bu oda sıcaklığında kaydedildi5.8 mM ekstrasellüler K + ile Ture. Bu kayıt, üç haftalık sıçan bir hazırlık içinde kayıt için gürültü oranı tipik bir sinyal B . P20 afferent bouton kaydedilen ekstraselüler olaylar için ortalama dalga şekli. 10272 olaylardan ortalama dalga. <img src="/files/ftp_upload/2442/2442sche.jpg" alt="Şematik 1" /> Şematik 1, iç ve dış saç hücreleri, spiral ganglionlar, stria vascularis ve örtü zarı arasındaki anatomik ilişkiyi gösteren bir sıçan koklea bir dönüş yoluyla Cross kesit .

<ol>
	<li>Glowatzki, E., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmitter+release+at+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Transmitter release at the hair cell ribbon synapse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 147-154 (2002).</li><li>Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+calcium+dependence+of+transmitter+release+at+a+single+ribbon+synapse.">Time course and calcium dependence of transmitter release at a single ribbon synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16341-16346 (2007).</li><li>Yi, E., Roux, I., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+HCN+channels+shape+excitatory+postsynaptic+potentials+at+the+inner+hair+cell+afferent+synapse+in+the+mammalian+cochlea.">Dendritic HCN channels shape excitatory postsynaptic potentials at the inner hair cell afferent synapse in the mammalian cochlea.</a> J Neurophysiol. 103 (5), 2532-2543 (2010).</li><li>Grant, L., Yi, E., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+release+shape+the+postsynaptic+response+at+the+inner+hair+cell+ribbon+synapse.">Two modes of release shape the postsynaptic response at the inner hair cell ribbon synapse.</a> J Neurosci. 30 (12), 4210-4220 (2010).</li><li>LoGiudice, L., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ribbons+at+sensory+synapses.">The role of ribbons at sensory synapses.</a> Neuroscientist. 15 (4), 380-391 (2009).</li><li>Singer, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse.">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nat Neurosci. 7 (8), 826-833 (2004).</li><li>Keen, E. C., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+characteristics+of+the+hair+cell's+afferent+synapse.">Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5537-5542 (2006).</li><li>Li, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell's+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse.</a> J Neurosci. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Singer, J. H., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+depletion+and+synaptic+depression+at+a+mammalian+ribbon+synapse.">Vesicle depletion and synaptic depression at a mammalian ribbon synapse.</a> J Neurophysiol. 95 (5), 3191-3198 (2006).</li><li>Suryanarayanan, A., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+internal+calcium+stores+in+rod+photoreceptors.">Synaptic transmission mediated by internal calcium stores in rod photoreceptors.</a> J Neurosci. 26 (6), 1759-1766 (2006).</li><li>Neef, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanism+of+exocytosis+at+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Probing the mechanism of exocytosis at the hair cell ribbon synapse.</a> J Neurosci. 27 (47), 12933-12944 (2007).</li><li>Tritsch, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+spontaneous+activity+in+the+developing+auditory+system.">The origin of spontaneous activity in the developing auditory system.</a> Nature. 450 (7166), 50-55 (2007).</li><li>Kros, C. J., Ruppersberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+potassium+current+in+inner+hair+cells+during+development+of+hearing+in+mice.">Expression of a potassium current in inner hair cells during development of hearing in mice.</a> Nature. 394 (6690), 281-284 (1998).</li><li>Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+of+frequency+representation+in+the+rat+cochlea.">Developmental changes of frequency representation in the rat cochlea.</a> Hear Res. 56 (1-2), 1-7 (1991).</li><li>Seal, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3.">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li></ol>

Bu yordamın kritik adım diseksiyonu. Doku diseksiyonu sırasında uzatılmış veya bozuksa, afferent liflerin hayatta olmaz. Genç sıçanların Doku daha esnek ve bağışlayıcı. Biz doğum sonrası 10 ila 11 gün incelemek için kolay ve deneyler daha yüksek başarı oranlarına sahip olduğunu bulabilirsiniz. Önemli bir derecede koklear olgunlaşma 12 14 postnatal günde dört bir yanından gelen duymak başlayan sıçanlarda, postnatal dönemde oluşur. Bu nedenle, yaş diseksiyonu kolay olduğu, sinaps 4 tam olgun olmayabilir. Sıçanlar için burada açıklanan diseksiyonu aslında fare, fare koklea daha küçük boyutta olan temel fark için aynıdır. Bu teknik transgenically değiştirilmiş fareler 15 incelenmek üzere şerit sinapsların özellikleri sağlar. Bu tekniğin daha fazla değişiklikler şunlardır: floresan boya etiket lifleri 3 hücre içi bir çözüm ekleyerek; presinaptik iç saç hücresi ve postsinaptik afferent bouton ile eşleştirilmiş kayıtları, pre ve post sinaptik hücreleri arasındaki transfer fonksiyonu 2 belirlenecek sağlayan ve gevşek afferent BOUTONS ekstrasellüler kayıtları hücresel bütünlük kaybını önlemek için mühür. Ekstraselüler kayıt yapılandırma ulaşmak için bütün hücre yapılandırması daha kolaydır ve deneyler genellikle daha uzun ömürlü.

Yukarıda afferent terminalleri kayıt için kullanılan elektrofizyolojik kurulumları ekipman.

postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: monitoring multivesicular release at a ribbon synapse

Iç saç hücresi (İHK) ve işitsel sinir lifi arasındaki afferent sinaps tek bir şerit sinaps 1-4 postsinaptik aktivite kayıt için elektrofizyolojik erişilebilir bir site sağlar. Şerit duyu hücreleri sinaps sürekli nörotransmitter serbest IHC membran potansiyeli 5 kademeli değişikliklere yanıt olarak modüle oranı. Şerit sinaps genlikleri 1, 4, 6-11 değişen eksitatör postsinaptik akımlar (EPSCs) uyandırmak için aynı anda birden fazla veziküller serbest olabilir multivesicular açıklaması, faaliyet gösterilmiştir . Presinaptik şerit, ne multivesicular serbest altında yatan mekanizma rol şu anda iyi anlaşılır ne. IHC 10-20 işitsel sinir lifleri, tek bir şerit sinaps oluşturmak için biten bir miyelinsiz tek ve her fiber iletişim IHC tarafından innerve. Afferent BOUTONS iletişime IHCs (çapı yaklaşık 1 mikron) küçük boyutlu, kayıtları yapılacak olağanüstü temporal çözünürlük sağlar. Ayrıca, teknik sinaps transfer fonksiyonu doğrudan 2 incelenecektir sağlayan, hem de pre-ve postsinaptik hücreler aynı anda kayıt için adapte edilebilir . Bu yöntem, bu nedenle multivesicular serbest bırakma, duyu hücreleri şerit zor fonksiyonu, sinir iletiminin temel yönlerini ele olabilir hangi bir araç sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse at JoVE.com

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Memeli koklea iç saç hücresi şerit sinaps işitsel sinir lifi dendritler Tüm hücre yama klemp kayıtları.

Koklear İç Saç Hücreleri Ulaşın Afferent Dendritler postsinaptik Kayıtlar: Şerit Synapse Multivesicular Yayın İzleme

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

postsynaptic-recordings-at-afferent-dendrites-contacting-cochlear

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.4K Görüntüleme.  The Johns Hopkins School of Medicine. Memeli koklea iç saç hücresi şerit sinaps işitsel sinir lifi dendritler Tüm hücre yama klemp kayıtları.

Video: Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Nörobilim

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent and divergent anatomical connections including feed forward and feedback wiring. Furthermore, information of the same origin is partially sent via parallel pathways to different and sometimes into the same brain areas. To understand the evolutionary benefits as well as the computational advantages of these wiring strategies and especially their temporal dependencies on each other, it is necessary to have simultaneous access to single neurons of different tracts or neuropiles in the same preparation at high temporal resolution. Here we concentrate on honeybees by demonstrating a unique extracellular long term access to record multi unit activity at two subsequent neuropiles1, the antennal lobe (AL), the first olfactory processing stage and the mushroom body (MB), a higher order integration center involved in learning and memory formation, or two parallel neuronal tracts2 connecting the AL with the MB.&#160;The latter was chosen as an example and will be described in full. In the supporting video the construction and permanent insertion of flexible multi&#160;channel wire electrodes is demonstrated. Pairwise differential amplification of the micro&#160;wire electrode channels drastically reduces the noise and verifies that the source of the signal is closely related to the position of the electrode tip. The mechanical flexibility of the used wire electrodes allows stable invasive long&#160;term recordings over many hours up to days, which is a clear advantage compared to conventional extra&#160;and intracellular in vivo recording techniques.

Simultaneous extracellular long term recordings from two different brain neuropiles or two different anatomical tracts were established in honeybees. These recordings allow the investigation of temporal aspects of neuronal processing across different brain areas at the single neuron as well as at the ensemble level in a behaving animal.

Davranan Bal arısı iki nöronal İşleme Dönemlerinde Eşzamanlı Uzun vadeli Kayıtlar

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Lamprey Reticulospinal Aksonlar Akut Ayrılma Bireysel Fonksiyonel Presinaptik Terminalleri Yayın Yüz Membranından Kayıt Enable

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS induces generalized tonic-clonic seizures with low mortality and neuronal death and is a widely-used model to screen anti-epileptic drugs. Here, we describe an ECS induction method in which a brief 55-mA current is delivered for 0.5 s to male rats 200 - 250 g in weight via ear-clip electrodes. Such bilateral stimulation produced stage 4 - 5 clonic seizures that lasted about 10 s. After the cessation of acute or chronic ECS, most rats recovered to be behaviorally indistinguishable from sham &#34;no seizure&#34; rats. Because ECS globally elevates brain activity, it has also been used to examine activity-dependent alterations of synaptic proteins and their effects on synaptic strength using multiple methods. In particular, subcellular fractionation of the postsynaptic density (PSD) in combination with Western blotting allows for the quantitative determination of the abundance of synaptic proteins at this specialized synaptic structure. In contrast to a previous fractionation method that requires large amount of rodent brains, we describe here a small-scale fractionation method to isolate the PSD from the hippocampi of a single rat, without sucrose gradient centrifugation. Using this method, we show that the isolated PSD fraction contains postsynaptic membrane proteins, including PSD95, GluN2B, and GluA2. Presynaptic marker synaptophysin and soluble cytoplasmic protein &#945;-tubulin were excluded from the PSD fraction, demonstrating successful PSD isolation. Furthermore, chronic ECS decreased GluN2B expression in the PSD, indicating that our small-scale PSD fractionation method can be applied to detect the changes in hippocampal PSD proteins from a single rat after genetic, pharmacological, or mechanical treatments.

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy for severe depression. ECS globally stimulates activity in the hippocampus, leading to synaptogenesis and synaptic plasticity. Here, we describe methods for ECS induction in rats and for subcellular fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in synaptic proteins.

Elektrokonvulsif nöbetler fareler ve onların Hippocampi ayırma nöbet kaynaklı değişiklikleri postsinaptik yoğunluğu proteinlerde incelemek için

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them water-soluble with the ability to reversibly enter and exit membrane lipid bilayers. These styryl dyes are relatively non-fluorescent in aqueous medium, but insertion into the outer leaflet of the plasma membrane causes a &#62;40X increase in fluorescence. In neuronal synapses, FM dyes are internalized during SV endocytosis, trafficked both within and between SV pools, and released with SV exocytosis, providing a powerful tool to visualize presynaptic stages of neurotransmission. A primary genetic model of glutamatergic synapse development and function is the Drosophila neuromuscular junction (NMJ), where FM dye imaging has been used extensively to quantify SV dynamics in a wide range of mutant conditions. The NMJ synaptic terminal is easily accessible, with a beautiful array of large synaptic boutons ideal for imaging applications. Here, we compare and contrast the three ways to stimulate the Drosophila NMJ to drive activity-dependent FM1-43 dye uptake/release: 1) bath application of high [K+] to depolarize neuromuscular tissues, 2) suction electrode motor nerve stimulation to depolarize the presynaptic nerve terminal, and 3) targeted transgenic expression of channelrhodopsin variants for light-stimulated, spatial control of depolarization. Each of these methods has benefits and disadvantages for the study of genetic mutation effects on the SV cycle at the Drosophila NMJ. We will discuss these advantages and disadvantages to assist the selection of the stimulation approach, together with the methodologies specific to each strategy. In addition to fluorescent imaging, FM dyes can be photoconverted to electron-dense signals visualized using transmission electron microscopy (TEM) to study SV cycle mechanisms at an ultrastructural level. We provide the comparisons of confocal and electron microscopy imaging from the different methods of Drosophila NMJ stimulation, to help guide the selection of future experimental paradigms.

Synaptic vesicle (SV) cycling is the core mechanism of intercellular communication at neuronal synapses. FM dye uptake and release are the primary means of quantitatively assaying SV endo- and exocytosis. Here, we compare all the stimulation methods to drive FM1-43 cycling at the Drosophila neuromuscular junction (NMJ) model synapse.

FM sinaps Bisiklete binme boya: yüksek potasyum depolarizasyon, elektrik ve Channelrhodopsin stimülasyon karşılaştırma

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

Sıçanlarda Kronik İmplantasyon için Periferik Sinir Stimülasyon Elektrotlarının Hazırlanması

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in monoamine neurotransmitter release and uptake dynamics. Technically complex methods such as electrophysiology, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), imaging, in vivo&#160;microdialysis, optogenetics, or use of radioactivity are required to study monoamine function. The method presented here is an optimized two-step approach for detecting monoamine release in acute brain slices using a 48-well plate containing tissue holders for examining monoamine release, and high-performance liquid chromatography coupled with electrochemical detection (HPLC-ECD) for monoamine release measurement. Briefly, rat brain sections containing regions of interest, including prefrontal cortex, hippocampus, and dorsal striatum were obtained using a tissue slicer or vibratome. These regions of interest were dissected from the whole brain and incubated in an oxygenated physiological buffer. Viability was examined throughout the experimental time course, by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The acutely dissected brain regions were incubated in varying drug conditions that are known to induce monoamine release through the transporter (amphetamine) or through the activation of exocytotic vesicular release (KCl). After incubation, the released products in the supernatant were collected and analyzed through an HPLC-ECD system. Here, basal monoamine release is detected by HPLC from acute brain slices. This data supports previous in vivo and in vitro results showing that AMPH and KCl induce monoamine release. This method is particularly useful for studying mechanisms associated with monoamine transporter-dependent release and provides an opportunity to screen compounds affecting monoamine release in a rapid and low-cost manner.

This method introduces a simple technique for the detection of endogenous monoamine release using acute brain slices. The setup uses a 48-well plate containing a tissue holder for monoamine release. Released monoamine is analyzed by HPLC coupled with electrochemical detection. Additionally, this technique provides a screening method for drug discovery.

Akut Beyin Dilimlerinde Endojen Monoamin Salınımının Ölçümü için Plaka Bazlı Bir Tahlil

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...