Bu Protokol, başlangıçta Linda Buck Laboratuvar Xiaolan Ye ve Michael Petrascheck Seattle&#39;daki Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi&#39;nde geliştirildi. Yukarıda ayrıntılı bir versiyonu, toplumun tüm işlem yapmak için hazırlanmıştır. Carol Taylor, Sarah LeBoeuf ve Andy Tomacelli protokol eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu el yazması # 2866 Scripps Araştırma Enstitüsü. Petrascheck Lab Novartis ADI programı tarafından finanse edilmektedir.

Bakış: protokol dört bölümden ayrılmıştır. Bölüm 1 beslenme bakteri nasıl hazırlanacağını açıklar. Bölüm 2, solucan kültürü nasıl hazırlanacağını açıklar. Bölüm 3 ömrü puanı nasıl açıklamaktadır. Bölüm 4, bazı temsilcisi sonuçları gösterir ve Bölüm 5, gerekli çözümler hazırlamak anlatılmaktadır. Ömrü deneyleri tamamlamak için birkaç hafta sürebilir. Protokol haftanın her adım için, gün ve günün zamanı planlama kolaylaştırmak için yer almaktadır. (Gün 0) L4 aşamasında tüm protokol için referans noktası olarak kullanılır. 1. Besleme Bakteriler hazırlanması Bu bölümde, beslenme bakterilerin hazırlık açıklamaktadır. Özel E. coli OP50 denir C.elegans beslemek için kullanılan suşu. Diğer bakterilerin solucan kültürüne çapraz bulaşmasını önlemek için bu protokol, önce, OP50 gerginlik Carbenicillin / ampisilin dirençli 21 yapılmıştır. OP50 4-5 gün önceden hazırlayın. OP50 ile temas eden tüm malzemeler steril olmalıdır. -7 Gün: Perşembe (1. hafta): 5 ml, 37 gece boyunca bir tek OP50 kolonisi ve inkübe ° C bakteriyel bir çalkalayıcı 100 mg / ml ampisilin ve 0,1 mg / ml Amfoterisin B içeren TB İnokülasyon . Gün -6: Cuma (hafta 1). Sabah 08:30. Kültür için yeterli süre doygunluk ulaşmak için izin vermek için erken İnokülasyon <ol><li> 50 mcg / ml ampisilin içeren 300 mL TB OP50 1:2000 gecelik kültür sulandırınız. Doygunluk ulaştı kadar 37 8-12 saat bir bakteri çalkalayıcı ° C kültür inkübe edin. Kültür 14 saatten daha uzun büyümek için izin vermeyin. </li><li> OP50, ön ağırlıklı steril bir santrifüj tüpü içine aktarın. Pelet bir masa üstü santrifüj 3500 rpm (2200 xg) 10 dakika süreyle santrifüj OP50. </li><li> Süpernatantı atın ve steril su içinde yeniden askıya OP50 pelet ve santrifüj yoluyla yeniden pelet. Bu yıkama iki kez tekrarlayın. </li><li> İkinci yıkamadan sonra, kalan suyun dikkatli bir şekilde kaldırın. Tüp su bırakılmalıdır. Pelet içeren santrifüj tüpü tartılır ve pelet ağırlığı belirlemek için, boş santrifüj tüp ağırlığı çıkarma. </li><li> 100 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon iyice S-komple pelet yeniden askıya. Hiçbir kümeleri bırakılmalıdır. </li><li> 100 mg / ml OP50 2 x10 10 bakteri / ml konsantrasyonu uygun olmalıdır. ML başına bakteri optik yoğunluk ve sayı arasındaki ilişki biliniyorsa mL başına bakteri sayısını belirlemek için bir fotoğraf spektrometre kullanın. Gerekirse, OP50 besleme çözüm 2 x10 10 bakteri / ml konsantrasyon ayarlayın. </li><li> 4 OP50solution Mağaza ° C kadar solucan kültürü için kullanılır. </li></ol> 2. Senkron Worm Kültür hazırlanması Bu bölümde, solucan kültürünün hazırlanması açıklamaktadır. Onun hedefi, solucanlar bir yaş eşzamanlı nüfus üretmek için. , Çamaşır suyu tedavisinden sonra 5. adımda C.elegans ile temas eden tüm malzemeler steril olmalıdır . Plakalar 20 ° C sürece aksi belirtilmedikçe tutulur. Gün -6: Cuma (hafta 1), 16:00: yeni bir plaka Transfer hayvanlar <ol><li> Solucan nüfusunun çoğunluğu açlıktan L1 larvaları oluşan bir 5-10 gün eski NGM plaka atın. </li><li> Bunsen beki üzerinden kısa bir süre ısıtılması ile metal bir spatula sterilize edin. Soğumasını bekleyin. Hasret solucanları içeren plaka agar parçaları kesip soğutmalı spatula kullanın. OP50 ile taze bir 10 cm NGM plaka numaralı seribaşı üzerine bu parçaları birkaç aktarın. Yaklaşık inkübe edin. 65 saat 20 ° C kadar solucan nüfusunun çoğunluğu gravid yetişkin oluşur. Gravid yetişkin içine büyümeye hasret L1 hayvanlar için gereken zaman zorlanma zorlanma değişebilir. </li></ol> Gün -3: Pazartesi (2. hafta) saat 10:00: senkron bir nüfusun oluşturulması <ol start="3"><li> 5-10 ml steril su ile plaka yıkayarak 10 cm plaka solucanları toplayın. Solucan / su solüsyonu 15 ml konik bir tüp içine aktarın. </li><li> 1200 rpm (280 xg) bir masaüstü santrifüj 2 dakika santrifüj solucanlar yıkayın. Süpernatant atın ve 10 ml su ekleyin. Tekrarlayın. </li><li> Süpernatantı ve taze hazırlanan çamaşır suyu / NaOH çözeltisi (2.5 ml çamaşır suyu, 1 ml 10N NaOH, 6.5 ml H 2 O) 5 ml ekleyin. Solucanların açık ara kadar oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Her dakika hafifçe vorteks için emin olun. Diseksiyon mikroskobu altında reaksiyon ilerleme izleyin. </li><li> En kısa sürede çözülür tüm yetişkinler gibi tepki nötralize etmek için M9 tampon 5 ml ekleyin. </li><li> (2500 rpm&#39;de 2 dakika santrifüj yumurta 10 ml M9 tamponu ile üç kere yıkayın1100 xg). </li><li> Aynı yumurta yıkayın 10 ml G-tam 2500 rpm (1100 xg) 2 dk santrifüj. </li><li> Süpernatantı, 10 ml S-tam ve taze bir 50 ml konik tüp çözüm transfer. S-tam 30 ml, 40 ml nihai hacmi ekleyin. Nutator veya benzeri bir cihaz, oda sıcaklığında yavaşça gecede tüp sallamak. </li></ol> -2 Gün: Salı (2. hafta), 12:00: Tohum tabak içine hayvanlar <ol start="10"><li> Diseksiyon kapsamında, solucanlar, gece boyunca yumurtadan olmadığını kontrol edin. Diseksiyon kapsamı kullanarak 10 mcL damla solucanlar sayısı sayarak S-komple bir çözüm solucanlar konsantrasyonu belirleyin. Her bir numune için en az 10 damla güvenin. </li><li> 80-100 solucanlar / mL S-tam bir konsantrasyon solucanlar yeniden askıya aldı. Carbenicillin (stok 100 mg / ml) 0.1 mg / ml bir final konsantrasyon son konsantrasyonu 50 mcg / mL ve Amfoterisin B (stok 250 mcg / mL) ekleyin. Bir nutator çalkalayınız. Solucanlar büyük miktarlarda hazırlanması, filtre kapağı ile 600 mL nunclon şişesi kullanın. </li><li> 02:30 nihai konsantrasyonu 6 mg / ml (= 1.2 x10 9 bakteri / ml) Bölüm 1 hazırlanan OP50 ekleyin. Geri dön OP50 4 ° C </li><li> 96 plaka her kuyuya 120 mcL worm/OP50 çözüm aktarın. Şeffaf bir alt 96 kuyucuğu kullanın. Pipetleme süre askıya solucanlar tutmak için emin olun. </li><li> Kontaminasyon ve buharlaşmasını önlemek için bir bant macunu kullanarak plaka Seal. 2 dakika süreyle mikrotiter plate çırpıcısı plaka Shake ve hayvanlar L4 sahne ulaşana kadar 2 gün 20 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Gün 0: Perşembe (2. hafta) öğleden önce: Fluorodeoxyuridine ekleyerek hayvanlar sterilize (FUDR) <ol start="15"><li> Hayvanların her kuyuya 0.6 mM FUDR stok solüsyonu 30 mcL sterilize etmek. Bu adım, her bir kuyunun 150 mcL son hacmi getiriyor ve 5 mg / ml (1x10 9 bakteri / ml) 6 mg / ml OP50 nihai konsantrasyonu azaltır . Mühür ve plaka bant Avcılar kullanarak bir mikrotiter plate çırpıcısı 2-3 dakika sallayın. OP50 -2 gün 2:30 &#39;da eklendi, FUDR, öğleden önce eklendi olması önemlidir. 20 ° C inkübatör plakaları dön </li></ol> 1. Gün: Cuma (hafta 2): kültürüne ilaç <ol start="16"><li> By 9:00 am hayvanların en gravid ve birkaç yumurta her içermelidir. Olan etkisi ömrü istenilen konsantrasyonda test edilmesi ilaçlar ekleyin. DMSO uyuşturucu çözme Eğer DMSO son konsantrasyonları,% 0.6 C.elegans ömrünü kısaltır DMSO konsantrasyonlarda daha yüksek olarak,% 0.6 &#39;dan fazla olmamalıdır. Ilacın eklenmesinden sonra, bant macun plakaları ve mikrotiter plate çırpıcısı 2-3 dakika sallayın. 20 ° C inkübatör plakaları dön </li><li> Ilaçların eklenmesi, özellikle su dışında diğer bir çözücü kullanarak, zaman zaman, plaka başına birkaç hayvanları öldürebilir. Inverted mikroskop, ölü hayvanları kontrol etmek için kullanın. Genel olarak, 96 plaka başına en az 10 ölü hayvanlar olması gerekir. 20 ° C inkübatör plakaları geri dön. </li></ol> 4. Gün: Pazartesi (hafta 3): Değişim Avcılar <ol start="18"><li> Taze oksijen mühürleyen kaldırmak kültür girmek için izin vermek için, 1 dakika bekleyin ve plaka yeniden mühürlemek. Mikrotiter plate çırpıcısı 2-3 dakika plaka çalkalayınız. Haftada bir kez tekrarlayın. </li></ol> 5. Gün: Salı (3 hafta): açlık önlemek için yeni OP50 ekle <ol start="19"><li> 96 kuyu açlık önlemek için her bölüm 1 hazırlanan 100 mg / ml OP50 çözüm 5 mcL ekleyin. </li></ol> 3. Ömrü, Puanlama. Bu bölümde, Bölüm 2 senkronize solucan nüfusun yaşam hayvanlar ölene kadar nasıl izlenir açıklamaktadır. 96 kuyucuğu hayvanları gözlemlemek için, 2x veya 2.5x objektif bir inverted mikroskop kullanın. Kayıt sağkalım verileri haftada üç kez, Pazartesi, Çarşamba ve Cuma günleri. Hareket hayvanların canlı ya da ölü olup olmadığını belirlemek için kullanın. Güçlü ışık, özellikle de mavi ışık taşımak için hayvanların neden olur. Testte ölü hayvanlar çıkarmayın. Bazen, hayvanların hareket etmedi ve bir önceki sayısında ölü tespit edildi, daha sonra üzerinde hareket edebilir. <ol><li> 0 gün, deney başında solucanlar her kuyuda toplam sayısını. Bu kuyulardan hayvan olarak analiz fazla 18 hayvan içeren kuyu sansür yeterli OP50 olmaz ve diyet kısıtlaması etkilerini gösterecektir. </li><li> Hayvanların hareket ettiğini, 2 dakika süreyle mikrotiter plate çalkalayıcı 96 plaka sallamak şansını artırmak için. önce sayma. </li><li> Her sayma oturumda, kayıt tarih ve hayvanların sayısı.canlı hayvan olarak hareket ettirin. Sıvı hareket katı ortam üzerinde çok daha kolay ve güçlü ışıkları ile uyarılabilir. Daha yüksek bir büyütme yutak ucu gibi çok ince hareketler nokta yardımcı olabilir. Bu ince hareketler, sık sık çok yaşlı hayvanlarda görülen tek hareket. </li><li> 20 ° C inkübatör plakaları dön </li><li> Tüm hayvanların ölü kadar 2-3 günde bir 2-4 adım tekrarlayın. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar. Bu bölüm, bu testte ve bazı temsilcisi sonuçları tarafından oluşturulan ömrünü veri kayıtlarını tutmak nasıl bir örnek gösterir. Şekil 1A Bu testte sırasında ömrü veri kaydetmek için nasıl bir örnek gösterir. Bir excel sayfasına her kuyuda nüfusun hayatta kalma izlemek için kullanılır. Her iyi plakasını koordine, gerilme, ilaç, ilaç konsantrasyonu ve 0 gün canlı hayvanların toplam sayısı (X0) Deneyin başında. Kayıt tarihi yanı sıra, her bir kuyu içinde çeşitli toplumlarda hayatta takip edebilmek için bir hafta, canlı ve ölü hayvan sayısının üç katı. Sonuçları grafik için, her gün için canlı hayvanların kısmını hesaplamak ve gün içinde zamanın bir fonksiyonu olarak arsa. P-değerleri STATA ya da benzer bir yazılım gibi istatistiksel paketleri kullanılarak hesaplanmalıdır. C.elegans, orta ömrü sıcaklığa bağlıdır. Şekil 1B ömrü sıcaklık bağımlı değişiklikler doğru ömrü testi 22 mikrotiter çoğaltılamaz olduğunu gösterir. Benzer şekilde, mikrotiter plate assay vahşi tip N2 hayvanlar 23-24 25 (Şekil 1C) farklı yaşam süresini bildirildi mutantlar ömrü değişiklikler üretir. Tahlil daha nicel ifadeler yapmak için kullanılabilir. Fig1D ortalama ömrü 7 Mirtazepine konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Her veri noktası 7-12 nüfusun ortalama ömrü, her zamanda farklı yaşam temsil eder. De başına hayvan sayısı (5-15 hayvanlar) nispeten düşük olsa da hata çubukları görüleceği gibi, iyi-iyi varyasyon nispeten küçük. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 tabanlı ömrü testi mikrotiter plate literatürde bildirilen ömrü değişiklikleri doğru üretir. (A) Örnek verileri bir Excel hesap toplanmıştır. Her sayma oturum tarih boyunca, iyi koordine etmek ve canlı ve ölü hayvan sayısı kaydedildi. Deneyin başında, her bir kuyunun hayvanların toplam sayısı tespit edildi. (B) vahşi tip sağkalım eğrisi (N2) hayvanlar 20 büyüdü ° C ve 25 ° C (C) ömrü etkileyecek mutasyonları taşıyan suşlarının sağkalım eğrileri. Her dört suşları 20 ° C&#39;de paralel olarak ölçüldü (D) Mirtazepine tedavi N2 hayvanlar doz yanıt eğrisi. Ortalama ömrü Mirtazepine konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Hata çubukları başına 8 kuyu durum SEM göstermektedir. 5. Malzemeler. M9 tampon, 1000 mL <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g KH 2 PO 4 </li><li> 5 g NaCl </li><li> 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 1000 mL deiyonize su ekleyin </li><li> Otoklav </li></ul> Potassiumphosphate tampon pH 6.0, 1000 mL <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> 900 mL deiyonize su ekleyin </li><li> 5M KOH ile pH 6,0 &#39;a ayarlayın. </li><li> 1000 mL deiyonize su ekleyin </li><li> Otoklav </li></ul> Trace metal çözümü <ul><li> 1,86 g Na 2 EDTA </li><li> 0.69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0.29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0.016 g CuSO 4 </li><li> 1000 ml su deiyonize </li><li> Otoklav ve karanlıkta saklayın. </li></ul> S-bazal orta, 1000 mL <ul><li> 5.9 g NaCl </li><li> 50 ml 1M potasyum fosfat, pH 6.0 </li><li> 1000 ml su deiyonize </li><li> Otoklav </li><li> Sonra, 5 mg / ml &#39;kolesterol (Et-OH çözünmüş) 1 ml eklemek çözüm soğumasını bekleyin. </li></ul> Potasyum sitrat 1M, 1000 mL <ul><li> 268,8 g tripotasyum sitrat </li><li> 26.3 sitrik asit monohidrat </li><li> 900 mL deiyonize su ekleyin </li><li> 5M KOH ile pH 6,0 &#39;a ayarlayın. </li><li> 1000 mL deiyonize su ekleyin </li><li> Otoklav </li></ul> S-tam orta, 1000 mL <ul><li> 977 ml S-bazal </li><li> 10 ml 1M potasyum sitrat pH 6 (steril) </li><li> 10 ml Trace metaller çözüm (steril) </li><li> 3 ml 1M CaCl 2 (steril) </li><li> 3 mL 1M MgSO 4 (steril) </li></ul> NGM agar <ul><li> 3.0g NaCl </li><li> 2.5g pepton(Kazein gelen, pankreas sindirimi) </li><li> 17g Agar </li><li> 975 mL deiyonize su ve karıştırma çubuğu ekle </li><li> Otoklav </li><li> - - 55 soğumasını otoklav sonrası ° C ve aşağıdaki bileşenleri ekleyin: <ul><li> 0.5 mL 1M CaCl 2 (steril) </li><li> 1 mL etanol içinde 5 mg / ml Kolesterol </li><li> 1 ml 1M MgSO 4 (steril) </li><li> 25 ml Potassiumphosphate tamponu, pH 6.0 (steril) </li></ul></li></ul> TB, 1000 mL <ul><li> 12g Bacto Tripton </li><li> 24 gr Maya Özü </li><li> 4 mL gliserol </li><li> 900 mL deiyonize su ekleyin </li><li> Otoklav </li><li> - - 55 soğumasını otoklav sonrası ° C ve aşağıdaki bileşen eklemek: <ul><li> 100 mL 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0.6 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma kedi # F0503), 1000 mL <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Çözülür S-tam steril 670 ml, 10 ml veya 45 ml alikotları olun. </li><li> -20 ° C&#39;de muhafaza </li></ul> 100 mg / ml Carbenicillin, 10 ml <ul><li> 1 g Carbenicillin </li><li> 10 ml steril deiyonize su </li><li> Steril süzüntü ve kısım </li><li> -20 ° C&#39;de muhafaza </li><li> Son bir 50 mg / ml konsantrasyonda </li></ul> 250ug / ml Amfoterisin B, 4 mL <ul><li> 1mg Amfoterisin B </li><li> 4 mL Et-OH </li><li> -20 ° C&#39;de muhafaza </li><li> Son bir 0.1 mg / ml konsantrasyonda </li></ul>

<ol>
	<li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+life-span+of+age-1+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+and+lower+Gompertz+rate+of+aging.">Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging.</a> Science. 249, 908-912 (1990).</li><li>Kenyon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+ageing.">The genetics of ageing.</a> Nature. 464, 504-512 (2010).</li><li>Finch, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+aging.">The genetics of aging.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).</li><li>Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blueberry+polyphenols+increase+lifespan+and+thermotolerance+in+Caenorhabditis+elegans.">Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 5, 59-68 (2006).</li><li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span.">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307, 258-262 (2005).</li><li>McColl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacogenetic+analysis+of+lithium-induced+delayed+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).</li><li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antidepressant+that+extends+lifespan+in+adult+Caenorhabditis+elegans.">An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 553-556 (2007).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reserpine+can+confer+stress+tolerance+and+lifespan+extension+in+the+nematode+C.+elegans.">Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans.</a> Biogerontology. 9, 309-316 (2008).</li><li>Wood, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirtuin+activators+mimic+caloric+restriction+and+delay+ageing+in+metazoans.">Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.</a> Nature. 430, 686-689 (2004).</li><li>Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valproic+acid+extends+Caenorhabditis+elegans+lifespan.">Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 7, 305-317 (2008).</li><li>Onken, B., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+induces+a+dietary+restriction-like+state+and+the+oxidative+stress+response+to+extend+C.+elegans+Healthspan+via+AMPK,+LKB1,+and+SKN-1.">Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1.</a> PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+increases+stress+resistance+and+extends+life+span+of+Caenorhabditis+elegans.">Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).</li><li>Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+extension+in+Drosophila+by+feeding+a+drug.">Life extension in Drosophila by feeding a drug.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).</li><li>Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamotrigine+extends+lifespan+but+compromises+health+span+in+Drosophila+melanogaster.">Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster.</a> Biogerontology. 11, 45-52 (2010).</li><li>Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase/catalase+mimetics.">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289, 1567-1569 (2000).</li><li>Benedetti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan.">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).</li><li>Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+MPP++model+of+Parkinson's+disease+for+high-throughput+drug+screenings.">Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings.</a> Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).</li><li>Kwok, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist.">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li><li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model.">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).</li><li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+function+in+novel+targets:+C.+elegans+as+a+model+organism.">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution.">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li><li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes.">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li></ol>

Sunulan protokol 96 microtiter plakalar C.elegans ömrü ölçümü sağlar. Temsilcisi sonuçlarında görüldüğü gibi bölümünde güvenilir bir önceki bulgularla çoğaltır ve kantitatif bilgi sağlar. Bu testte başarılı C.elegans ömrü üzerindeki etkileri için 89.000 moleküller üzerinde gösterildi. Ilaç-tarama amacı için, ömrü 96 mikrotiter plate formatında ölçüm klasik katı ortam tahlil üzerinde birçok avantajı vardır. Bu medya hazırlık, kuluçka alanı miktarı ve gerekli ilaç miktarı için gerekli emek azaltır. 96-iyi bir format ve yüksek kapasiteli gösterimleri için tüm testinin mikroskopi kurulum otomasyonu izin verir. Testin geliştirilmesi sırasında her değişken ve kombinasyonları için birden çok değer bunların C.elegans ömrü üzerindeki etkileri için test edildi. Bu testler için 3 ila 10 arasında değişen farklı OP50 konsantrasyon mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / ml), solucanlar de ortalama 7 ila 45 (7, 10, 15, 22, 45 arasında değişen farklı sayıda solucanlar / iyi), 40 de ortalama 150 mcL (40, 60, 80, 100, 120, 150 mcL) ve tampon kompozisyonunda değişiklikler arasında değişen farklı bir kültürü hacimleri. Girersek Carbenicillin dirençli OP50 konsantrasyonlarda Carbenicillin ne Amfoterisin B ne belirtilen C.elegans ömrü etkileyecek bulundu. Plakaları sürekli nazik sallayarak C.elegans sıvı kültüründe genellikle tavsiye edilir, bu testte kullanılan küçük miktarlar için vazgeçilebilir bulundu. Büyük kuyu microtiter plakalar kullanılacak, Nazik sallayarak ancak gereklidir. Değerler Bu protokol, farklı koşullarda test edilen istatistiksel karşılaştırma dayalı olarak dikkatli bir şekilde seçilmiştir. Bu testin en şaşırtıcı özelliği muhtemelen C.elegans bandı ile mühürlenir 96 kuyucuğu tutulabilir bir gerçektir. Yan yana karşılaştırmalar, plastik mühürleyen ile mühürlü plakalar, ya da hava değişimi izin Avcılar ile mühürlü plakalar, kaplanmadan plakalar kültür hayvanların ömrü içinde herhangi bir fark ortaya koymamıştır. Her üç koşul, L1, 65 saat içinde gravid yetişkin hayvanların çok homojen geliştirilen ve çok karşılaştırılabilir ömürlü gösterdi. NGM paralel olarak yetiştirilen hayvanlar biraz daha hızlı gelişti, ancak bu fark, bir mühürleyen varlığı veya yokluğu bağımsız oldu. Sunulan protokol canlı bakteri dayalı, ancak ölü bakteriler için adapte edilebilir. Ancak, bir sıvı tayininde bir tek hayatta kalan bakteriler hızla çoğalmaya ve kültür yeniden doldurmak. Bizim ellerde, sıvı kültürü için kullanılabilir olması ölçüde bakterileri öldürmek için tek güvenilir yolu, gama radyasyon ile bakteri uzun süreli tedavi. Ömrü deneyi planlama göz önünde bulundurulması gereken önemli bir nokta tespiti güçtür. Etkisinin büyüklüğüne bağlı olarak, faiz ilacın etkisi çok kuyularda test edilmelidir. Tipik bir tahlil 4 ilaç ile tedavi edilen ve 4 kontrol kuyuları, karşılık gelen yaklaşık 40-50 hayvanların her deneylerde% 95 daha fazla bir ömrü içinde% 30 artış tespit etmek için yeterli olacaktır. Olguların sadece% 60% 14 artış tespit edilir ve bu nedenle daha fazla çoğaltmak kuyu gerektirir. Bu testte tarafından oluşturulan ömrü veri zenginlik, deney geliştirmek veya özel parametrik Gompertz modelleri 1 zorlanma olabilir . Bu Gompertz modelleri algılama gücünü belirlemek ve büyük ölçekli ekranlar için yanlış pozitif ve negatiflerin sayısını tahmin etmek için yararlı. Biz kör deneylerde bu modellerin öngörüleri doğrulanmış ve büyük ekranlarda yanlış negatif numaraları (yayınlanmamış) tahmin etmek için onları kullandı. Özetle, biz sunulan tahlil C.elegans, ömrünü uzatmak ve altında yatan mekanizmaları incelemek için küçük moleküller tanımlamak için büyük bir kullanım olacağını tahmin ediyoruz .

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Amphotericin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>cat# 171375</td>
<td>Also called Fungizone</td>
</tr>
<tr>
<td>FUDR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat# F0503</td>
<td>FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water</td>
</tr>
<tr>
<td>Mianserin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>M2525-250MG</td>
<td>Use as positive control at 50&mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyproheptadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat#C6022-MG</td>
<td>Alternative positive control at 10 &mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 236370</td>
<td>Polyester, non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>96 well plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>cat# 351172</td>
<td>Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon flask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 178883</td>
<td>used for large volumes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates

Ömrü birkaç genetik yollar tarafından düzenlenen bir biyolojik süreçtir. Yaşlanma biyolojisi araştırmak için bir strateji hayvanları çalışma olduğunu yaşa düzenleyici yolların bileşenleri liman mutasyonlar. Eğer bu mutasyonlar karıştırmayı yaş düzenleyici yolun fonksiyonu ve bu nedenle tüm organizmanın ömrü değiştirmez, onlar önemli mekanistik anlayışlar 1-3 sağlar. Ömrü düzenlenmesi araştırmak için başka bir strateji karıştırmayı yaşa düzenleyici yollarda küçük moleküller kullanmaktır. Bugüne kadar bir dizi, moleküllerin çeşitli model organizmalarda ömrü uzatmak için bilinen ve yaşlanma 4-16 biyolojisi okumak için bir araç olarak kullanılır. Tespit moleküllerinin sayısı şimdiye kadar yaşlanma biyolojisi okumak için kullanılabilir genetik &quot;araç seti&quot; ile karşılaştırıldığında küçük. Caenorhabditis elegans mükemmel genetik ve üç hafta gibi kısa ömrü nedeniyle yaşlanma çalışma prensibi modelleri biridir. Daha yakın zamanlarda, C.elegans, çünkü onun küçük boyutu ve microtiter plakalar büyümeye yeteneğini fenotip bazlı ilaç ekranlar 5,7,16-20 için bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır . Burada 96 microtiter plakalar C.elegans ömrünü ölçmek için bir test sunuyoruz. Testin geliştirilen ve C.elegans ömrü 7 uzatmak molekülleri için büyük kütüphaneler ekrana başarıyla kullanılmıştır. Birden fazla testleri testinin güvenilirliği değerlendirildi: Önce, farklı sıcaklıklarda yetiştirilen vahşi tip hayvanların ömrünü ölçerek, ikinci, değişen yaşam süresini mutantlar ömrü ölçerek, üçüncü, farklı konsantrasyonlarda yanıt olarak ömrü değişiklikleri ölçerek antidepresan Mirtazepine. Mirtazepine daha önce C.elegans 7 ömrünü uzatmak için gösterilmiştir . Bu testlerin sonuçları, testin diğer testleri önceki bulguları çoğaltmak mümkün ve kantitatif olduğunu göstermektedir. Mikrotiter biçimi de bu ömrü testi otomatik sıvı taşıma sistemleri ile uyumlu hale getirir ve otomatik platformları entegrasyon sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates at JoVE.com

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Bu protokolü biz ölçmek için bir yöntem mevcut.<em&gt; Caenorhabditis elegans</em96 microtiter plakalar&gt; ömrü.

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

36.0K Görüntüleme.  The Scripps Research Institute. Bu protokolü biz ölçmek için bir yöntem mevcut. Caenorhabditis elegans ömrü.

Video: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Biyoloji

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Büyüyen Bir Yöntem Arabidopsis</emYüksek Verim Genotiplendirme için 96-iyi Tabaklar ve Domates Tesisleri>

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Oksidatif Stres Direnci Ölçüm<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 oyuklu mikrotiter plakalarında

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

C. elegans RAN Peptid Toksisitesi Ölçme

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...