Bu protokol, deniz eleganlarında yaşlanmaya hizmet etmek için en düşük maliyetli ve en düşük teknoloji yöntemlerini sunar. Yaşlanma biyolojisinde etkili bir model organizma. Bu yöntemlerin en büyük avantajı, düşük maliyetli ekipman ve malzeme kullanarak uygulama kolaylığıdır.
Onları deneyim veya mevcut finansmandan bağımsız olarak herhangi bir araştırmacıya uygun hale getirmek. Yaşlı bir yaşlanma çalışması olarak, popülasyonlarda sağlıkta doğal değişkenlik vardır. Bu nedenle, deneylerin sağlıklı, iyi beslenmiş ve sıkı bir şekilde senkronize edilmiş hayvanlar üzerinde yapılması önemlidir.
Yırtılma sakatlığını sağlamak için Bir litre nematod büyüme ortamının veya NGM burgu plakasının hazırlanmasına başlayın. Bir karıştırma çubuğuna sahip bir litrelik şişeye 2,5 gram pep tonu, 3,0 gram sodyum klorür ve 20 gram burgu ekleyin ve 970 mililitrelik son hacme damıtılmış su ekleyin. Standart bir otoklav veya ortam sterilizatörü kullanarak NGM burgu çözeltisini bir litrelik şişede sterilize edin.
Ve çözeltinin 60 ila 75 santigrat dereceye kadar soğuyana kadar karıştırılmasına izin verin. Çözelti soğurken, bir boncuk banyosunu 65 ila 70 santigrat dereceye ısıtın. NGM burgu çözeltisi 60 ila 75 santigrat dereceye soğuduktan sonra.
Sıvı katkı maddelerini ekleyin ve çözeltinin beş dakika boyunca tamamen karışmasına izin verin. Ardından, plakaya dökülürken ortamın katılaşmasını önlemek için şişeyi 65 ila 70 santigrat derecede bir boncuk banyosuna batırın. Her 60 mililitrelik plakaya çözeltinin dokuz ila 11 mililitresini pipetleyin.
İşiniz bittiğinde, sıcaklığı korumak ve pipetteki herhangi bir ortamın katılaşmasını önlemek için pipeti ısıtılmış çözeltiye geri yerleştirin. Tüm plakalar için prosedürü tekrarlayın ve NGM plakalarının gece boyunca katılaşmasına izin verin. Katılaştıktan sonra, bunları bakteri içeren tohumlama plakaları için kullanın veya solucanları ağartma yoluyla senkronize etmek için plakaları dört santigrat derecede üç aya kadar kapalı kaplarda saklayın.
Petri kabını fazla doldurmadan solucanları içeren bir tabağa az miktarda M9 çözeltisi dökerek nematodları toplayın. Daha sonra solucanları bakteri çimlerinden gevşetmek için M nine çözeltisini yavaşça döndürün. Daha sonra, yetişkin gravid solucanları serolojik pipetli 15 mililitrelik bir tüpe toplayın.
Burguyu pipet ucuyla delmekten kaçının. Hayvanları 1100 kez G'de 30 saniye boyunca merkeze toplayın ve süpernatanı aspire edin. Solucan peletine taze hazırlanmış ağartma çözeltisinden beş mililitre ekleyin ve solucanları, tüm yetişkin solucan gövdeleri çözülene ve karışımda sadece yumurtalar kalana kadar aralıklı kuvvetli sallama ile birlikte birkaç dakikada bir diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin.
Daha sonra, yumurta ağartıcı karışımını 1100 kat G'de 30 saniye boyunca döndürerek yumurtaları pelet ve ağartma çözeltisini aspire edin. Daha sonra peletlenmiş yumurtaları, 15 mililitreye kadar M9 çözeltisi ekleyerek ve yumurtaları ve çözeltiyi dağıtmak için tüpü dört veya beş kez ters çevirerek yıkayın. Yine, yumurtaları peletlemek ve M9 çözeltisini aspire etmek için tüpü 1100 kez G'de 30 saniye boyunca santrifüj yapın.
Yumurta karışımından herhangi bir ağartıcıyı ortadan kaldırmak için yıkamayı dört kez yapın. Dördüncü yıkama santrifüzyonundan sonra, ağartılan toplam solucan sayısına bağlı olarak M9 çözeltisini 100 mikrolitreden iki mililitreye aspire edin. Kümeleri parçalamak için yumurtaları iyice çalkalayın ve yumurtaların M9 çözeltisinde tamamen yeniden askıya alındığından emin olun.
Alternatif olarak, hayvanlar, 15 mililitrelik bir kronik tüpte yumurta peletine 10 ila 12 mililitre M9 çözeltisi eklenerek daha sıkı bir zamansal senkronizasyon için tutuklanabilir. Solucanların 20 santigrat derecede 24 saate kadar bir rotatörde dönmesine izin verin. Yumurta veya L'ye yaklaşık olarak bir konsantrasyon pipeti, yumurta karışımının dört mikrolitresini bakterilerle oturmuş bir NGM plakasına monte eder.
Ardından, mikrolitre ortam başına mevcut yumurtaları sayın ve hesaplayın. Yaklaşım plakasına, uygun yumurta sayısına veya L'de bir tutuklu hayvanın, tercih edilen bakterilerle tohumlanmış NGM burgu plakasına göre yaklaşımı iyileştirmek için sayımı üç veya dört kez tekrarlayın. Solucanların lokomotif davranışını thrashing yoluyla ölçmek.
Bir NGM burgu plakasından az sayıda yetişkin solucanı, diseksiyon kapsamı altında 10 ila 20 mikrolitre M9 çözeltisine taşıyın. Ardından, bir seferde bir solucana odaklanın ve numunenin 15 saniye içinde içbükey bir oluşumdan dışbükey formasyona kaç kez geçtiğini sayın. Bir el sayacı ve bir zamanlayıcı kullanın ve 10 ila 15 solucan için prosedürü tekrarlayın.
Solucanları istenen yaşa kadar yaşlandırın ve istenen tüm yaşlarda ezme ölçümlerini tekrarlayın. Görselleştirildiği gibi, yaşlı solucanlar önemli ölçüde daha yavaş hızlarda parçalanır. Miktar ve doğurganlık ölçümleri için.
10 ila 15 Caenorhabditis elegans solucanında, L dört solucanını, tercih edilen bakterilerle tohumlanmış ayrı bir NGM burgu plakasına ayırır. Hayvanların gece boyunca 20 santigrat derecede büyümesine izin verin ve yeni tohumlanmış bir tabak grubunun ertesi gün için hazır olduğundan emin olun. Caenorhabditis elegans tarafından bırakılan yumurta miktarını ölçmek için, yetişkin solucanları, yedi ila sekiz gün boyunca her 12 ila 24 saatte bir yağmalanmış bakterilerle tohumlanmış taze bir NGM burgu bıçağına aktarın veya yumurtalar artık görünür hale gelene kadar ve plakalara bırakılan yumurta sayısını sayın.
Caenorhabditis elegans'ın yavru boyutunu ölçmek için yetişkin solucanları, her 12 ila 24 saatte bir, yedi ila sekiz günde bir veya soy artık görünmeyene kadar bakterilerle tohumlanmış taze bir NGM burgu plakasına aktarın. Yumurta içeren tüm plakaları 20 santigrat derecede tutun. Solucanları aktardıktan iki gün sonra.
Plakadaki gelişmiş soyu sayın. F iki neslinin sonuçları karıştırmadığından emin olmak için L dört aşamasında veya daha önceki tüm canlı ve gelişmekte olan solucanları sayın. Tüm solucanları sayıldıkları gibi plakadan çıkarın.
Gecikmiş kuluçka veya gelişime sahip hayvanların kaçırılmamasını sağlamak için plakaları tekrar puanlamadan önce bir ila iki gün daha saklayın. Sterilizasyon yönteminin vahşi tip N2 nematodlarının ömürleri üzerindeki etkisi, NGM burgu plakalarında yetişen solucanların ömürlerindeki değişikliklerin, NGM burgu FUDR plakalarında yetiştirilen solucanların veya NGM burgu plakalarında yetişen glp dört BN2 mutant hayvanınınkine benzer olduğunu göstermiştir. Kısa ömürlü HSF bir nakavt hayvanı, tüm koşullar için yaşam süresinde önemli bir düşüş gösterdi.
HSF'de, vahşi tip kontrollerine kıyasla yumurtlayan yumurta sayısında ve yavru büyüklüğünde önemli bir azalma bulunmuştur. Bazı HSF bire bir ekspresyon hayvanları, üreme sağlığının uzun ömürlülükle ters orantılı olabileceğini gösteren tam sterilite sergiledi. Çarpma oranı, yaşlı hayvanlarda gençlere kıyasla ezmede önemli bir azalma ile ölçüldüğü gibi, yaşlanma sırasında sağlığı ölçmek için güvenilir bir yöntem sağlamıştır.
Strese karşı sağkalım, organizma sağlığını ölçmek için güvenilir testlerdir, retikulum stresine neden olan Tunicamisin, DMSO kontrolüne kıyasla konsantrasyondan bağımsız olarak daha kısa bir ömürle sonuçlanmıştır. Yüksek paraquat seviyeleri ömrü önemli ölçüde kısaltırken, düşük paraquat konsantrasyonları hormetik etki nedeniyle ömrü arttırdı. Termo tolerans tahlillerinde, HSF'nin aşırı ekspresyonu, tüm yaşam süresi ve yaşlanma deneyleri için termo toleransı 37 santigrat derecede arttırdı.
Sterilizasyon tekniklerinin sonuçları etkileyen organizma sağlığı üzerinde pleiotropik bir etkiye sahip olabileceğini hatırlamak önemlidir. Transkripsiyon, translasyon protein agregasyonu, organel, morfoloji ve metabolik fonksiyonların ölçümleri dahil olmak üzere ekipman ve altyapı mevcutsa, sağlık süresini ölçmek için birçok ek ve tamamlayıcı yaklaşım mevcuttur.
