Yazarlar ilk K562 aAPC ve mIL21 füzyon vektörler oluşturmak Laurence Cooper, Harjeet Singh ve Lenka Hurton çalışmaları için teşekkür etmek istiyorum. UT MD Anderson Doktor Bilim Adamı Programı, St. Baldrick Vakfı ve Friendswood Legends tarafından bu iş için finansman sağlanmıştır.

1. Buffy Coat PBMC&#39;ler izolasyonu Periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) leukapheresis tarafından elde edilen sağlıklı donör buffy coat örnekleri Ficoll-Paque batmaz yoğunluğu santrifüj ile elde edilir. <ol><li> Ficoll Paque santrifüj başına çok küçük değişiklikler yaparak üreticinin protokolü olarak yapılır. </li><li> Son hacim 140 mL (tipik buffy coat hacmi 40-70 ml) bir kan bankası buffy coat normal bir donör PBS ekle. </li><li> Katman buffy coat örnek 35 ml Ficoll-Paque (4 tüpler) 15 ml. </li><li> Frensiz 20 dakika 400g santrifüjleyin. </li><li> Ficoll-Paque PBMC&#39;ler Kurtar: plazma arayüzü, Ficoll-Paque altındaki eritrositlerde atmayın. </li><li> PBMC&#39;ler 400g her zaman 10 dakika boyunca santrifüj, PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> PBMC&#39;ler RosetteSep tarafından izole edilebilir (Bölüm 4) bu aşamada NK hücre genişlemesi veya NK hücreleri için doğrudan kullanılmamalıdır. </li><li> Kalan PBMC&#39;ler sıvı nitrojen içinde% 10 DMSO içeren FBS donmuş olabilir. </li><li> Ficoll aspire ve iki adet 50 ml santrifüj tüpüne adım 5 kırmızı kan hücreleri toplamak, (50 ml işareti eklendi) PBS ile üç defa yıkamak, her defasında RBC tabakasının üst granülositler kaldırmak için supernatant kaymağını aspirat. </li><li> Eritrositlerde hemen NK hücreleri RosetteSep  arıtma (bakınız Bölüm 4) için kullanılan ya da 4 Alsever çözümü eşit hacmi saklanabilir ° C (eritrositler daha sonra kullanmak üzere en fazla 4 hafta bir mağaza olabilir). </li></ol> 2. NK hücre genişletme NK hücre genişleme PBMC&#39;ler kullanarak veya NK hücreleri saflaştırılmış başlatılabilir. Genişlemesi için kullanılan PBMC&#39;ler miktarı, üç hafta genişleme sonunda istenen NK hücreleri miktarına göre değişik olabilir, ayrıntılı bilgi için temsilcisi sonuç bölümüne bakın. (Bkz. Not 1) UYARIM 1 Gün 0 <ol><li> Genişletilecek her 5x10 6 PBMC&#39;ler için, sayım ve 100 Gy gama ışınlama kullanılarak 10x10 6 K562 CL9 mIL21 ışın tedavisi. </li><li> Mesaj ışınlama hücreleri, NK hücre genişlemesi medya (NKEM) PBS ve tekrar süspansiyon ile yıkayın. </li><li> 10x10 6 ışınlanmış K562 CL9 T75 balonuna 40 ml NKEM mIL21 (1:2 oranı) ve 37 ° dik bir kuluçka yerleştirin ° C ve% 5 CO 2 ile Tohum 5x10 6 PBMC&#39;ler </li></ol> Gün 3 ve 5 <ol start="4"><li> 400g az 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri kurtarır ve taze NKEM medya yarısını yerine (tüm medya hacmi için taze IL2 ekleyerek) ve kültür devam ediyor. </li></ol> UYARIM 2 7. Gün <ol><li> Bir hafta sonunda kültür hücrelerinin sayısını sayın. </li><li> Flow sitometri fenotipleme için 5x10 5 hücre (Not 2) bir kenara </li><li> Restimulated her 5x10 6 hücre için, sayım ve 100 Gy gama ışınlama kullanarak 5x10 6 K562 CL9 mIL21 ışın tedavisi. </li><li> (Bkz. Not 3), 2.5x10 5 toplam hücre / ml NKEM ışınlanmış K562 CL9 mIL21 (1:1 oranı) ve tekrar süspansiyon eşit sayıda ekleyin . </li><li> T75 şişeler tohum hücreleri (şişeyi başına maksimum 50 ml). </li></ol> 10 ve 12 Gün <ol start="6"><li> Hücre sayısını. </li><li> (Not 3), hücre sayıları dayalı taze NKEM ile tüm medya değiştirin. </li></ol> 14. Gün <ol start="8"><li> Genişleme iki hafta sonunda kültür hücrelerin sayısını. </li><li> Flow sitometri fenotipleme için 5x10 5 hücre (Not 2) bir kenara </li><li> NK hücreleri, genişleme PBMC&#39;ler başladı genişleme RosetteSep arıtma protokolü (bakınız Bölüm IV) kullanarak bu aşamada arındırılmalıdır. Stimülasyon 3 geçin NK hücreleri saflaştırılmış genişleme başladı. </li><li> NK hücreleri (Adım 8) saflığını doğrulamak için flow sitometri fenotipleme için arıtma kenara 5x10 5 hücre ayarladıktan sonra. </li><li> Uyarım 3 arıtılmış NK hücreleri (Not 4) ile devam edin. </li></ol> UYARIM 3 <ol><li> NK hücreleri, hücre sayıları dayalı NKEM ışınlanmış K562 CL9 mIL21 (1:1 oranı) (Not 3) ile yeniden süspanse. </li></ol> 17 ve 19 Gün <ol start="2"><li> Hücre sayısını. </li><li> (Not 3) hücre sayıları dayalı taze NKEM ortam değiştirin. </li></ol> 21. gün <ol start="4"><li> Genişleme üç hafta sonunda kültür hücrelerin sayısını. </li><li> Recover tam NK hücre fenotipleme antikor panel için flow sitometri analizi için 1x10 6 hücre (Bakınız Tablo 1). </li><li> Ileride kullanmak üzere flakon başına 5x10 7 hücre maksimum yoğunluğu% 10 DMSO içeren FBS hücrelerin dondurun. </li></ol> 3. NK Hücre Sitotoksisite Testi <ol><li> NKEM NK hücreleri ve tohum bir flakon, pe önce bir gün Çözülmekurtarma izin sitotoksisite testinde rforming. </li><li> (Not 5) tek bir hedef hücre hattı, 6x10 5. NK hücreleri ve 3x10 5 hedef hücreleri kullanarak her NK hücre sitotoksisite testi için gereklidir. </li><li> NKEM Calcein-AM (1 DMSO mg / ml stok) (Not 6) seyreltilmesi CAM-Media hazırlayın. </li><li> (Bakınız Not 7) CAM-medya 1 ml 10 6 hedef hücreleri tekrar </li><li> Arada sırada sallayarak, 37 ° C&#39;de 1 saat inkübe edin. </li><li> Yeniden süspanse NK, 1x10 6 hücre / mL hücre ve NK hücre süspansiyonu her bir U-bottom 3 kuyu 200uL eklemek 96-plaka ilgili to10: 1 D: Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi T oranı . (Not 8) </li><li> &quot;Maksimum&quot; dışında kalan tüm kuyular tam bir medya 100uL ekleyin. </li><li> &quot;Maksimum&quot; 100uL 2% Triton X-100 ekleyin. </li><li> 5 sonraki E NK hücreleri seri dilüsyonları yapın: her seferinde hücre 100uL aktararak T oranları, iyice karıştırın. Son kuyuları (0.3125:1, T oranı E) 100uL atın. </li><li> Calcein yükleme 1 saat sonra, 1200 rpm&#39;de 5 dakika için santrifüj, iki kez NKEM hedef hücreleri yıkayın. (Not 9) </li><li> 1x10 5 hücre / mL hedef hücreleri ve tekrar süspansiyon yeniden saymak. </li><li> (1x10 4 / iyi) her bir kuyu için hedef hücrelerin 100 mcL ekleyin. Hücre temas başlatmak için 100g az 1 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> 37 ° ° C&#39;de ve% 5 CO 2 4 saat. </li><li> Kültür düzgün yayımlanan Calcein askıya için 100 mcL pipetter pipetleme hafifçe karıştırın, pelet hücreleri 5 dakika 100g plaka aşağı spin ve kabarcıkları önlemek için özen yeni bir plaka süpernatantı 100 mcL transfer. Ince bir iğne kullanarak formu herhangi bir kabarcıklar pop. </li><li> Floresan plaka okuyucu (eksitasyon filtresi 485 nm, emisyon filtresi 530 nm) kullanarak plaka okuyun. Alt okumanız önerilir. </li><li> X 100 - [/ (test sürüm spontan sürümü) (kendiliğinden serbest maksimum sürüm)] formülü göre hesaplayın Yüzde Özel Lizis. </li></ol> 4. RosetteSep tarafından NK Hücre Arıtma <ol><li> (RBC: PBMC 100:1) 50 ml tüp içine PBMC veya genişletilmiş hücreleri ile eritrositlerde 100 kat daha fazla alın. </li><li> Kullanarak taze eritrosit doğrudan bir sonraki adıma devam edin veya 1200 rpm santrifüj, eritrositlerde Alsever s çözümü saklanır olsaydı sayıda eritrosit sayımı ve PBS ile üç kez% 2 FBS ile takviye eritrosit miktarı (100 kat daha fazla) uygun yıkama 10 dakika her zaman için. </li><li> Adım 1.7 veya PBS içinde adım 2.10 genişletilmiş hücreleri PBMC&#39;ler ile eritrositlerde birleştirin +% 2 FBS nihai hacmi PBMC&#39;ler veya genişletilmiş hücreleri 5x10 7 kişi başına 1 ml . </li><li> RosetteSep, 1μL PBMC&#39;ler veya genişletilmiş hücreleri 1x10 6 kişi başına  İnsan NK Hücre Zenginleştirme Kokteyl ekleyin . </li><li> İyice karıştırın ve her 5 dakikada bir karıştırarak yumuşak 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> PBS +% 2 FBS karışımı hafifçe eşit hacim ve Ficoll-Paque üst katman ekleyin. </li><li> (Bölüm I) hücre izolasyonu için açıklanan Ficoll Paque santrifüj adımları tekrarlayın. </li><li> Arıtma sonra kurtarıldı NK hücreleri saymak 5x105 hücreleri ve NK hücre saflık (Adım 8) flow sitometri ile phenotpying için bir kenara koyun. </li></ol> 5. Notlar NOT 1 PBMC&#39;ler gelen NK hücreleri doğrudan genişletilmiş veya RosetteSep  saflaştırılmış NK hücreleri olabilir. Biz benzer bir genişleme verimliliği kaydetti var, ama bazı bağışçılar genişleme önce RosetteSep zorluk arındırıcı çok düşük NK hücre sayıları olabilir. NOT 2: Biz rutin olarak, NK hücreleri, CD3-negatif ve CD16 veya CD56-pozitif olduğu gibi numaralandırma, genişleme sırasında fenotipleme CD56-FITC, CD16-PE, ve CD3-PE- Cy5 kullanabilirsiniz. NOT 3, her ortam değişikliği veya stimülasyon az 2.5 x 10 5 / ml pik genişleme aşamalarında tekrar süspansiyon hücreleri, NK / mL başına ya da 2 milyonun altında PBMC hücre sayıları tutmak için . Bu besinlerin tükenmesi önlemek ve maksimum genişleme ve hayatta kalma elde etmenize yardımcı olacaktır. NOT 4 NK genişleme oranı uyarılara 1 ya da 2 yarı donmuş hücreleri sonunda donör bağımlı ve yarı deneysel ihtiyaç bağlı olarak daha da genişletilmiştir. Biz daha sonra açılımları için donmuş hücreleri kullanarak iyi bir başarı elde ettiler. NOT 5 700 uls NKEM ve sitotoksisite testinde kurmak için NKEM 4 mL yeniden süspanse 4x10 5 Calcein-AM lekeli hedef hücreleri yeniden süspanse 7x10 5 NK hücreleri en az kullanmanızı öneririz hata oda izin için. Eğer hedef hücreler hücreleri yüksek hacimli (6x10 5 ila 6 ml) kullanılan medya havzasının büyüklüğüne göre gerekli olabilir tohumlama için çok kanallı pipet kullanarak. Ayrıca tavsiye edilen NK hücre sayıları, özellikle E: T oranları yüksek E kullanmak için, protokol gösterir: T oranları artırmakbuna göre ml başına NK hücre sayıları (40:1 D için örneğin: T oranı kullanım 4x10 6 hücre / ml) 6 NOT: 1:500, 1:400, aşağıdaki dilüsyonları kullanarak tercih hedef hücre hattı için bir ön Calcein-AM yükleme titrasyon yapmak öneririz. 1:300, 1:200 ve 1:100, maksimum ve spontan sürüm arasındaki optimum bir fark elde etmek. NOT 7, ilk hedef olarak yapışık bir hücre hattı kullanarak enzimatik olmayan hücre disosiasyon tampon kullanarak tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak. CAM-medya ADCC performans varsa, hedef hücreleri yinelenen bir tüp hazırlayın. NOT 8 ADCC performans varsa, aynı NK hücreleri 10:01 e karşılık gelen 3 kuyu ekleyin: T ADCC . Ek donörler için tekrarlayın. Ek hedef hücreler için tekrarlayın. NOT 9 ADCC bir deneyi gerçekleştirmek, Calcein yükleme 45 dakika sonra, hedef hücreleri karşı ADCC inducing için spesifik antikor 10ug ekleyin. 15 dakika daha sonra, 1200 rpm&#39;de 5 dakika için santrifüj iki kez tam bir ortamda hedef hücreleri yıkayın. 1x10 5 hücre / mL yeniden süspanse hücre ve protokolde bir sonraki adıma devam edin . 6. TEMSİLCİSİ SONUÇLAR <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 genişleme düzeni başına yapıldığında, başlangıç ​​materyali, 1x10 9 10 10 hücreleri (donör bağlı değişkenlik) tipik NK hücre verimleri aralığı 5x106 PBMC&#39;ler kullanarak, yukarıda anlatılan. Şekil NK hücre kat genişleme gösterir (n = 19), orijinal ürün bulunan NK hücreleri ile karşılaştırıldığında (medyan + / - dörtte). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 genişletilmiş NK hücreleri, birkaç istisna dışında (CD11b, CD160 ve CD244) ile yorumlanmamış birincil NK hücreleri ile karşılaştırılabilir çeşitli NK hücre reseptörleri ifade . <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 PBMC&#39;ler kurtarma Buffy coat bağımlı donör ve 300x10 6 800x10 6 uzanabilir. PBMC% 18 -% 2 NK hücreleri oluşur. Genişletilmiş hücrelerinin RosetteSep arıtma için,% 40-70 gün saf NK hücreleri 14 aralıkları kurtarma. Genişleme ve saflaştırma önerilen protokol takip ederek,% 99 NK hücre saflığı beklenebilir. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5. Genişletilmiş NK hücreleri tümör hücre hatlarının nöroblastom, AML, osteosarkom ve melanom (temsilcisi AML öldürme yüzde lizis olarak gösterilen) de dahil olmak üzere bir dizi karşı sitotoksisite göstermiştir.

<ol>
	<li>McKenna, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Good+manufacturing+practices+production+of+natural+killer+cells+for+immunotherapy:+a+six-year+single-institution+experience.">Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience.</a> Transfusion. 47, 520-520 (2007).</li><li>Koehl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ex+vivo+expansion+of+highly+purified+NK+cells+for+immunotherapy+after+haploidentical+stem+cell+transplantation+in+children.">ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children.</a> Klinische Padiatrie. 217, 345-345 (2005).</li><li>Klingemann, H. G., Martinson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+for+clinical+applications.">ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications.</a> Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).</li><li>Ayello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cord+blood+natural+killer+and+lymphokine+activated+killer+lymphocytes+following+ex+vivo+cellular+engineering.">Characterization of cord blood natural killer and lymphokine activated killer lymphocytes following ex vivo cellular engineering.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 12, 608-608 (2006).</li><li>Carlens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+in+vitro+expansion+of+cytotoxic+human+CD3-CD56++natural+killer+cells.">A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells.</a> Hum Immunol. 62, 1092-1092 (2001).</li><li>Boissel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+increase+expansion+of+cord+blood+natural+killer+cells.">Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).</li><li>North, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-primed+human+natural+killer+cells+lyse+NK-resistant+tumor+targets:+evidence+of+a+two-stage+process+in+resting+NK+cell+activation.">Tumor-primed human natural killer cells lyse NK-resistant tumor targets: evidence of a two-stage process in resting NK cell activation.</a> J Immunol. 178, 85-85 (2007).</li><li>Berg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical-grade+ex+vivo-expanded+human+natural+killer+cells+up-regulate+activating+receptors+and+death+receptor+ligands+and+have+enhanced+cytolytic+activity+against+tumor+cells.">Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells.</a> Cytotherapy. 11, 341-341 (2009).</li><li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+highly+cytotoxic+human+natural+killer+cells+for+cancer+cell+therapy.">Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy.</a> Cancer Res. 69, 4010-4010 (2009).</li><li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+potential+of+human+natural+killer+cells.">Replicative potential of human natural killer cells.</a> Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).</li><li>Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+with+high+cytotoxicity+by+K562+cells+modified+to+co-express+major+histocompatibility+complex+class+I+chain-related+protein+A,+4-1BB+ligand,+and+interleukin-15.">Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15.</a> Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).</li></ol>

NK Hücre Genişleme ve Etkinleştirme Medya (NKEM) <ul><li> 90% RPMI 1640 (Cellgro) </li><li> % 10 fetal sığır serumu (Gibco) </li><li> 1x Penisilin / Streptomisin (Cellgro) </li><li> 1x L-Glutamine (Gibco) <ul><li> Kullanımdan önce sterilize medya Filtresi. </li></ul></li><li> 50 U / ml IL2 (Proleukin, Novartis Aşı ve Teşhis, Inc.) <ul><li> - 200 IU ul / stok sulandırılır. Medya istenilen miktarda IL2 ekle hemen önce her zaman kullanın. </li></ul></li></ul> Hücre ve NK Hücre İzolasyonu <ul><li> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li> Alsever çözümü (Sigma) </li><li> RosetteSep İnsan NK Hücre Zenginleştirme Kokteyl (Stemcell Teknolojileri) </li></ul> NK Hücre Sitotoksisite Testi <ul><li> Calcein-AM (Invitrogen) <ul><li> Stok çözelti, 1 mg / ml 50 mcL alikotları donmuş, mağaza. Hücre boyanması için istenen seyreltme ulaşmak için NKEM medya eritin. </li></ul></li></ul> Antikorlar NK hücre fenotipleme için kullanılan antikorların listesi aşağıdaki tabloda listelenmiştir; <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Antikor </td><td> Test başına hacimde </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Tüp 1 </td><td valign="top"> Izotip FITC Izotip FITC Izotip FITC Izotip FITC FACS Tampon Toplam Hacim </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Tüp 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 FACS Tampon Toplam Hacim </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Tüp 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS Tampon Toplam Hacim </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen Ar-Ge Sistemleri Miltenyi Biotec Ar-Ge Sistemleri BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tüp 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS Tampon Toplam Hacim </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tüp 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS Tampon Toplam Hacim </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tüp 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS Tampon Toplam Hacim </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood nk cells

Doğal öldürücü (NK) hücreleri, bağışıklık gözetim çeşitli bulaşıcı mikroorganizmaların ve tümörleri karşı önemli bir rol oynamaktadır. NK hücreleri ve in vitro genişletmek için yeteneği sınırlı kullanılabilirlik NK hücre immünoterapi gelişimi kısıtladı. Burada fonksiyonel NK hücrelerinin ex vivo olarak, membrana bağlı IL21 ifade K562 hücreleri kullanarak yapay bir antijen sunan hücre (aAPC) büyük miktarlarda verimli bir şekilde genişletmek için bir yöntem açıklanmaktadır. NK hücre bugüne kadar evlatlık tedaviler, T hücreleri veya NK hücreleri pozitif seçimi tükenmesi takip donör kararlı durum leukapheresis hücre elde edilen bir ürün kullanmış olurlar. Genellikle ürün gecede IL-2 aktive ve sonra ertesi gün 1 yönetilmektedir. Çünkü NK hücreleri periferik kan düşük frekanslı, NK hücreleri nispeten az sayıda klinik çalışmalarda teslim edilmiştir. NK hücreleri in vitro yaymak için yetersizlik, en iyi klinik sonuç için yeterli hücre sayıları üretmek için sınırlayıcı bir faktör olmuştur . NK hücreleri bazı genişleme (1-2 hafta içinde 5-10 kat), yüksek doz IL-2 sadece 2 ile sağlanabilir . Otolog T hücrelerinin aktivasyonu da muhtemelen yerel sitokin 3 sürümü ile, NK hücre genişleme arabuluculuk yapabilirsiniz. Mezenkimal stroma veya yapay antijen sunan hücreler (aAPCs) desteği, hem de periferik kan ve kordon kanı 4 NK hücrelerinin büyümesini desteklemek . Kombine NKp46 ve antikor kaplı boncuklar CD2 aktivasyon henüz 21 gün içerisinde yaklaşık 100 kat genişleme, NK hücre genişleme (Miltenyi Biotec, Auburn CA) için pazarlanmaktadır. NK hücreleri aAPC genişletilebilir veya-aktive kullanarak klinik denemeleri devam etmekte, önemli bir genişleme olmadan lösemik hücre hattı CTV-1 - Başbakan ve aktive NK hücreleri 5 kullanarak bir. 21 gün 6 ortalama 490 kat genişleme sağlanması, NK hücre genişlemesi için ikinci bir deneme EBV-LCL kullanır. Üçüncü bir K562 tabanlı aAPC 21 gün içerisinde 277 kat ortalama NK genişleme elde 4-1BBL (CD137L) ve membrana bağlı IL-15 (MIL-15) 7, transduced kullanır. NK hücreleri, K562-41BBL-mIL15 kullanarak genişletilmiş olmasına rağmen, aAPC in vitro ve in vivo yorumlanmamış NK hücrelerine kıyasla son derece sitotoksik, ve ADCC katılmak, onların çoğalması yaşlanması telomer kısalması 8 atfedilen ile sınırlıdır. Daha yakın bir zamanda 350 kat genişleme NK hücreleri K562 ifade MİKA, 4-1BBL ve IL15 9 kullanarak bildirildi. NK hücre genişleme yöntemi, burada 21 günde bir ortalama 21.000 kat genişleme sağlanması yaşlanması olmadan, NK hücreleri hızla çoğalması üreten nitelendirdi.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells at JoVE.com

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Burada genişletmek ve verimli bir şekilde arındırmak çok sayıda insan NK hücre ve kendi fonksiyonunu değerlendirmek için bir metodu tanımlar.

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

47.9K Görüntüleme.  MD Anderson Cancer Center - University of Texas. Burada genişletmek ve verimli bir şekilde arındırmak çok sayıda insan NK hücre ve kendi fonksiyonunu değerlendirmek için bir metodu tanımlar.

Video: Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Zoledronate İnsan Periferik Kan Genişleme γδ T Hücreler

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

Antijenler Kompakt Hyperbranched Polyglycerols Of Aşılama Membran By Fonksiyonel Kırmızı Kan Hücreleri Korumalı

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Cas9 Ribonucleoproteins kullanarak Knock-out birincil ve genişletilmiş insan NK hücre üretimi

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical testing, and cell-based therapies. In this study, a simple, novel protocol to isolate, activate, and expand T cells from PBMCs ex vivo is presented. This study utilizes functionalized buoyancy-activated cell sorting (BACS) technology to isolate and activate T cells. Briefly, the protocol involves the positive selection of CD3+ cells from leukopak-derived PBMCs, followed by a 48 h co-stimulation with pre-conjugated anti-CD28-bound streptavidin microbubbles (SAMBs) prior to transduction in 24-well plates. Functionalized microbubbles offer a unique opportunity to buoyantly activate cells, leading to proliferative phenotypes that allow for expansion with minimal exhaustion. This technique offers reduced exhaustion because the co-stimulatory microbubbles remain buoyant and return to the top of the culture medium, thus reducing the amount of time that the expanding cells are in contact with the co-stimulatory factors. The results indicate that the isolated and cultured T cells receive enough stimulation to activate and proliferate but not to an extent that leads to overactivation, which then leads to exhaustion, as demonstrated by the presence of excessive PD-1.

The objective of this study is to demonstrate the feasibility of flotation-based separation to isolate, activate, and expand primary human T cells.

Flotasyon Bazlı T Hücresi İzolasyonu, Aktivasyonu ve Mikrokabarcıklar Kullanılarak İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücre Örneklerinden Genişleme

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

Fonksiyonel Osteoklastların İnsan Periferik Kanı CD14+ Monositlerinden Farklılaşması

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...