1. Örnek fiksasyon ve reçine gömme <ol><li> , Taze doku ve hücreler örnekleri% 2 paraformaldehid en az 2 saat süreyle sabit ve% 2.5, 7.4 pH 0,1 M fosfat tamponu glutaraldehid. Örneklem büyüklüğü yeterli penetrasyon veya sabitleştirici izin 0.150 mm kalınlığında geçmemesi gerektiğini ve düzeltmenin 12 saatten daha uzun süre bırakılmamalıdır. </li><li> Örnekleri, 20ml cam sintilasyon şişeleri yerleştirin ve onları 0.1M cacodylate tampon üç kez, her biri 5 dakika yıkayın. </li><li> % 1.5 (w / v) 30 dakika için 0.1 M cacodylate tamponu (0.1 M, pH 7.4), potasyum ferrosiyanat ve% 1 (w / v) osmiyum tetroksit Leke. </li><li> 30 dakika boyunca% 1.0 (w / v) 0.1M cacodylate tampon osmiyum tetroksit Leke. </li><li> 3 dakika boyunca bir kez çift distile su ile durulayın. </li><li> % 1 (w / v) 30 dakika çift distile su uranil asetat ile Leke. </li><li> Çift distile su ile 5 dakika için bölümler durulayın ve kademeli alkol serisi her değişikliği (1 x% 50, 1 x% 70, 1 x% 90, 1 x% 95, 2 x% 100), 2 dakika sonra kurutmak. </li><li> % 70,% 90,% 95 ve% 100:% 50 etanol içinde Durcupan başlayan etanol ile karışık Durcupan reçine her değişiklik, 30 dakika, artan konsantrasyonlarda göm, daha sonra takip. </li><li> Taze Durcupan ile değiştirin ve 4 saat boyunca yavaş yavaş tahrik. </li><li> Yeri bölümleri, kalıp ayırma maddesi ile kaplı ve 65 yer, cam mikroskoplar, ahşap, kokteyl çubukları slaytlar kullanarak 24 saat boyunca ° C fırın. </li></ol> 2. FIB / SEM için numune hazırlama <ol start="11"><li> Örnekleri içeren, iki cam mikroskop slaytlar arasında, reçine katmanı ayrı ve ayırıcı herhangi bir kalıp çıkarmak için iyice yıkayın. </li><li> Düşük güç hedefleri ile bulaşan bir ışık mikroskobu kullanılarak, ya da reçine dilim içinde ilgi bölgeyi tanımlamak için, iletilen aydınlatma ile mikroskop diseksiyon. </li><li> Jilet kullanarak ilgi bölge etrafında kare (3 mm x 3 mm) Kesme ve akrilik tutkal ile boş reçine blok (Şekil 1) üst sopa. Sertleşmesine tutkal için 5 dakika bekleyin ve sonra bir sonraki adıma devam. </li><li> Ulramicrotome sahibi blok Kelepçe ve ekli stereomikroskopta kullanarak, bir jilet ile ilgi bölgenin çevresinde maddi kalıntıların sadece küçük bir piramit kadar kırpın. </li><li> Ayrıca, ilgi bölgede tam saygı ile blok yüzeyinin (Şekil 1) boyutları bulunan, böylece ultramicrotome içine sabit bir cam bıçak kullanarak, blok kırpın. Bir kenarı blok kesme, dik bir adım örnek üzerinden kesilir (Şekil 1 ve 2), böylece ilgi bölgeye yakın. Bu adım, görüntüleme yüz (Şekil 2) oluşturur. </li><li> Iletilen bir ışık mikroskobu kullanılarak, ultramicrotome ve fotoğraf blok içinde ilgi bölge blok çıkarın. </li><li> Uzak kalan reçine saplama kesilmiş blok kesin. Bu bir kuyumcuya testere kullanılarak yapılan ve sadece küçük bir blok FIB / SEM içine yerleştirilmiş olmasını sağlar. Bu blokta toplam yüksekliği 5 mm&#39;den fazla olmamalıdır. </li><li> Tutkal Görüntülenecek tarafındaki en dış kenarına (Şekil 1) olmasını sağlamak karbon macun ile bir alüminyum saplama blok. </li><li> Tutkal kuruduktan sonra, blok (&gt; 20 nm; Cressington vakum evaporasyon sistemi) altın ince bir tabaka ile kaplayın. </li></ol> 3. FIB / SEM görüntüleme <ol start="20"><li> Düşük bir büyütme, ilgi ve blok tarafında seçtiğiniz bölge görüntülü böylece ikincil elektron görüntüleme (5 kV, 0.5 nAmp), şark blok kullanarak (Şekil 2 c, d) operatör karşı karşıya. </li><li> Orient yüze görüntülü böylece blok freze ışınına paralel yatıyor. Bu, elektron ışını, bu yüz ila 54 ° (Şekil 2 b) yönelik anlamına gelecektir. </li><li> 13 iyon demeti akımı kullanma - 30 kV 27 nAmps Görüntülenecek bölgenin ön reçine dar bir bant çıkarın. </li><li> Ilgi bölge üzerine, öğütülmüş yüz görüntülemek için saçılmış görüntüleme moduna geçin. </li><li> (Şekil 2) öğütülür ve yansıması blok tam bir bölge bulmak ışık mikroskobu referans görüntü (adım 16 yaşında çekilmiş) ve öğütülmüş yüz görüntü kullanma. </li><li> Mevduat faiz bölge (Şekil 2) Yukarıdaki blok yüzeyine, mikroskop gaz enjeksiyon sistemi kullanarak karbon (veya metal) bir koruyucu tabaka (yaklaşık 1 mikron kalınlığında). </li><li> 700 picoAmps, ince değirmen son görüntüler alınacaktır blok içinde bölgede bir akım kullanılması. </li><li> Freze ışın tamamen değirmen bu görüntü yüzü hiç freze eserler karşısında görülebilir kadar bırakın. Yüz tam bir değirmen tüm görüş alanı genelinde sonraki her görüntü değişiklikleri gözlemleyerek kontrol edilir. Yetersiz freze vertica görünen beyaz çizgiler veya &#39;perde&#39; olarak görülmektedir.lly görüntü. </li><li> Mikroskop dağıtmak için herhangi bir termal değişiklikler için en az 2 saat bekletin. Bu blok yüz hizalanmamıs görüntüler sonuçlanan görüntüleme sırasında sürüklenme riskini azaltır. </li><li> Yüz seri görüntüleme için mikroskop parametreleri seçin. Elektron ışını blok karşısında malzemenin bir çok sığ bir derinliğe sadece görüntü için yeterince düşük bir gerilim olduğundan emin olun. Bu aynı zamanda kaldırılacak yüz kalınlığı daha çok sığ olmalıdır. Görüntüleme için tipik parametreler 1.2 arasında gerilimleri - 2,0 kV arasındaki piksel boyutları ile 4 - 20 nm. Piksel değirmen yüzü ve tek bir görüntü elde toplam süre (Şekil 3) 2 dakika altında tutulur, böylece yaklaşık 10 μsecs tutulmalıdır zamana ihtiyacı yaşamak. </li></ol> 4. Başarının sırları Adım 1) numuneleri 150 mikrondan daha kalın olmadığından emin olun. Bu malzemenin içine farklı lekeleri ve reçine yeterli penetrasyon sağlayacaktır. Bu fiksasyonun hemen sonra bir vibratome örnekleri kesit elde edilebilir. Bu kalınlığı, beyin dokusu için uygun . Diğer dokulara yeterli fiksasyon ve boyama sağlamak için test edilmesi gerekir. Adım 3) Numuneler çözüm boyunca özgürce dağıtılan ve bu ikincil fiksatif tanıtıldı flakon bir parçası birlikte clumped olmalıdır. Bu örnek maksimum penetrasyon sağlamak ve bu tespit işlemi sırasında bozuk olma örnek azaltacaktır. Bu örnekleri çözüm eklenir hemen sonra flakon içinde yavaşça dönen elde edilir. Adım 15) ilgi bölgesi (&lt;30 mikron) altında hemen blok yüzeyinde yer olduğundan emin olun. Bu görüntü toplama aşamasında, iyon ışını tarafından freze miktarını azaltır . Adım 22) iyon demeti tarama süresi, tüm görüntüleme yüzü tamamen öğütülmüş olduğundan emin olmak için adequte olması gerekiyor . Yetersiz freze görüntüleme yüz aşağı dikey olarak görünen beyaz çizgiler ya da &#39;perde&#39; olarak gösterilir . Adım 26) son öğütülmüş yüze görüntülü bir yüz daha büyük olmalıdır. Bu öğütülmüş reçine, blok ve blok yüzeyine yakın çevresinde redeposits atılır çünkü . Bu redeposition görüntüleme sahaya tecavüz ve görüntülü olan daha bir çok geniş bir alana öğütülmesi ile önlenmiş olur. 20 mikron genişliğinde bir görüntü penceresi için, öğütülmüş blok yüz 30 mikron genişliğinde daha büyüktür. Adım 29), elektron ışını parametreleri görüntü blok yüzeyinin yalnızca ilk birkaç nanometre çıkan elektronlar tarafından oluşturulan bu tür kritik . Bu acheved 2&#39;nin altında kV gerilim en aza indirmek ve hiçbir elektron çok uzak nüfuz sağlamak. Bu aynı zamanda en yüksek enerjiler ile sadece elektron nihai görüntü katkıda bulunmak, böylece dedektör üzerinde bir ızgara gerilimi kullanarak katkıda bulunuyor. Tipik olarak, bir ızgara gerilimi 1,3 kV, 1,5 kV bir görüntüleme gerilim için kullanılır . 5. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 reçine blok hazırlanması a) Reçine bir steromicroscope görüntülenen bir yetişkin sıçan beyin ile koronal bölümünde (80 mikron kalınlığında) gömülü. Görüntü net bir neşter bıçak kullanarak bölümünde (b) kesilebilir farklı beyin bölgeleri gösterir. Burada, korteks 1 mm kare kaldırılır ve (c), d) Daha sonra reçine blok, bir ultramicrotome monte edilmiş bir cam bıçakla kesilmiş ve bir kez blok sadece terk etmek düşürüldü boş bir reçine blok yapışmış ilgi bölgesi (e), bir adım f) gömülü malzemenin ön yüzeyine dik kesilmiş kesilmiş Bu tüm bölge daha sonra reçine geri kalanından kesilir ve bir alüminyum metal kaplama için hazır saplama ve görüntüleme üzerine monte taramalı elektron mikroskobu. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2). FIB / SEM görüntüleme blok yüz hazırlanması ve b) blok ve görüntüleme yüz (siyah çift başlı bir ok ile gösterilen) oluşturmak için öğütülmüş kenarına resimler göstermek. Iyon demeti (beyaz) konumunu görüntüleme yüze paralel olarak gösterilir ve elektron ışını (gri), 54 ° iyon demeti yüz isabet gösterilir. C), elektron ışını ile çekilen blok bir görünümdür. ve ikincil elektronlar ile görüntülenmiş. Bu yan blok boyunca koyu kabaca öğütülmüş yüz bölgesi (noktalı beyaz bir kutu ile gösterilir) bir kısmını gösterir (çift kafalı gösterilened siyah ok) altta yatan bir örnek ortaya çıkarmak için d) bu bölgede sadece saçılmış elektron kullanarak görüntülü gömülü doku görülebilmektedir . Burada gömülü doku bölümün tam genişliğinde çift başlı bir beyaz ok ile gösterilir. C scale bar), 100 mikron . <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 görüntülenmesi izotropik vokseller ile beyin dokusunun hacmi. A) sıçan beyin bir bölge içinde ultrastrüktür gösteren blok yüz kontrast saçılmış görüntü Ters. Tüm membranlar görünür yanı sıra büyük makromoleküler yapıları vardır. B) 1600 görüntülerin toplam 5 nm aralığı izotropik vokseller c) Bu yığın aynı çözünürlüğe sahip herhangi bir düzlemde yansıması ile sonuçlanan bir görüntü yığını toplanmıştır . Bu görüntü, xy düzlemi ve yz düzleminde görüntülü tek sinaptik bağlantı gösterir.

<ol>
	<li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li><li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope:+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue.">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li><li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy.">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li></ol>

Ilgi bölgede çok büyük değilken FIB / SEM tekniği en iyi şekilde çalışır. Görüntülü bir hacim için üst limit iyon ışını ve alana bağlı olduğunu, uzun çalışma saatleri boyunca tekrar tekrar sürekli değirmen. Şimdiye kadar bu alanlarda yaklaşık 60 x 60 mikron yapıldı, ancak, görüntüleme tüm bu alanda, uygun bir görüntü çözünürlüğü ile böyle büyük bir görüntü toplama zaman faktörü nedeniyle mümkün değildir. Bir örnek olarak, bir pikselin ile 4 kx k 4 görüntü 10 mikrosaniye zaman 2 dakika ve 40 saniye kazanmak için alacağını ve 60 mikron bakış bir alan için bu sadece bir piksel boyutu 15 nm verecek yaşamak. Ultrastrüktür hücre ve doku görüntüleme için daha küçük bir piksel boyutu daha uygundur; genellikle 4 ve 10 nm / piksel arasında. Mikroskop bu yeteneği olsa bile görüntü 60 x 60 mikron bir alan için, 10 saat içinde kazanılmış olacaktır. Bu nedenlerden dolayı, mikroskop, görüntü birimleri için 10 x 10 x 10 mikron, ya da bütün hücrelerinin önemli bölgelerinde sırasını ideal bir araçtır. Bu, 48 saatlik bir süre içinde bu yordamı ile tezat örnekler üzerinde kolayca yapılabilir. Şimdiye kadar ağırlıklı olarak beyin dokusu lamelleri için kalarak kültür memeli hücrelerinin yanı sıra, çeşitli türleri ile protokol olmuştur. Ancak, fiksasyon ve boyama işlemi eşit derecede iyi kontrastlı görüntü yığınları üretmek için bitki materyali de dahil olmak üzere diğer birçok türde, biyolojik madde ile birlikte kullanılabilir. Bu nedenle bu tekniğin ana avantajı izotropik vokseller ile görüntü birimleri için kapasitesini. Bu tür görüntü yığınları, yığın içinde herhangi bir düzlemde alınan görüntüleri kullanarak 3d bir hacim analizleri için izin verir. Bu yarar, herhangi bir yönden gelen görüntü serisi ve daha büyük bir görüntü ayrıntısı (Şekil 3) sağlayan görüntü özellikleri gözlemci izin vermektir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Siyanoakrilat yapıştırıcı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon mikroskobu: Leica MZ8 </td><td> Leica Microsystems, Almanya </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan reçine </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, İsviçre </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM mikroskobu (Zeiss, Nvision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bardak histoloji slaytlar </td><td> Menzel-Gläser, Almanya </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> Cam bıçak üreticisi Leica EM KMR2 </td><td> Leica Microsystems, Almanya </td><td></td></tr><tr><td> Cam sintilasyon şişeleri (20ml) </td><td> EMS, ABD </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> Glutaraldehyde </td><td> EMS, ABD </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> Mücevherci gördüm </td><td> EMS, ABD </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> Kalıp ayırma maddesi </td><td> Glorex, İsviçre </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> Osmium tetroksit </td><td> EMS, ABD </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> Paraformaldehit </td><td> EMS, ABD </td><td> RT 19.208 </td></tr><tr><td> Fosfat tuzları fosfat tamponu </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, İsviçre </td><td> 71.642 ve 71.496 </td></tr><tr><td> Sodyum cacodylate </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, İsviçre </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> Altın hedef Kaplayıcı&#39;ya Sputter </td><td> Cressington, ABD </td><td></td></tr><tr><td> Tris tabanı (TBS) </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, İsviçre </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramicrotome: Leica UCT </td><td> Leica Microsystems, Almanya </td><td></td></tr><tr><td> Uranil asetat </td><td> EMS, ABD </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue

Bu protokol, ne biyolojik örnekler, beyin dokusu gibi, odaklanmış iyon demeti / taramalı elektron mikroskobu (FIB / SEM) kullanarak üç boyutlu olarak görüntülenmiş olabilir açıklar. Osmiyum tetroksit ve uranil asetat kullanarak aldehitler, ağır metal vitray örnekleri ile sabitlenir. Sonra alkol ile kurutulmuş ve daha sonra sertleşmiş reçine ile sızmış. Işık mikroskobu ve cam bıçak ile ultramicrotome kullanarak, yüzeye yakın bölgede faiz içeren küçük bir blok yapılır. Blok sonra FIB / SEM içine yerleştirilir ve iyon demeti, bu bölgeye yakın bloğunun bir tarafı boyunca kabaca değirmen dikey bir yüz için kullanılır. Saçılmış elektron temel yapıları görüntü kullanarak, daha küçük bir yüzü daha ince bir iyon demeti ile öğütülmüş ve yüzey görüntülü ve öğütülmüş tam yüz alanı belirlemek için daha yakından incelenmektedir. Daha sonra mikroskop parametreleri karşısında arka arkaya seri görüntüler blok hacmi ile toplanır, böylece öğütülmüş ve görüntülü şekilde ayarlanır. Görüntü yığını genellikle her yönde küçük bir 4 mil olarak boyutları ile izotropik vokseller içerecektir. Herhangi bir görüntü düzlemi Bu görüntü kalitesi, kullanıcı görüntü yığını içinde herhangi bir görüş açısı hücre ultrastrüktür analiz sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue at JoVE.com

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Bu protokol, taramalı elektron mikroskobu, reçine gömülü beyin dokusu, odaklanmış iyon demeti üç boyutlu olarak hazırlanmış ve yansıması nasıl açıklamaktadır.

Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.8K Görüntüleme.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne. Bu protokol, taramalı elektron mikroskobu, reçine gömülü beyin dokusu, odaklanmış iyon demeti üç boyutlu olarak hazırlanmış ve yansıması nasıl açıklamaktadır.

Video: Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Nörobilim

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Beyin Dokusu Ölçme Ekstraselüler Ion Sinyalleri için Çift namlulu ve Konsantrik Mikroelektronlar

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

Atomik Kuvvet Mikroskobu, Darbe girinti ve reometre kullanarak Beyin Doku Ölçekli Mekanik Özellikleri karakterize

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

Yapma, test etme ve yetişkin beyin doku dilimler halinde potasyum iyon seçici Microelectrodes kullanma

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Fare Beyninin Yatay Hipokampal Dilimleri

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...