Bu çalışma, NSF ödül DBI 0852891 tarafından finanse edildi. Bu çalışmanın bir parçası da Kooperatif Anlaşması No PHY0120999 altında, University of California, Davis tarafından yönetilen Biophotonics Bilim ve Teknoloji, NSF Bilim ve Teknoloji Merkezi Merkezi tarafından finanse edildi.

1. Bazı bakım, bu sistem içinde bir Raman numune hazırlama ve yerleştirme alınması gerekmektedir. <ol><li> Sistem genellikle çok kısa mesafelerde çok yüksek sayısal diyafram hedefleri kullanmak yapar, çünkü örnekler bir lamel üzerine yerleştirilir. Biyolojik numunelerin tipik bir Attofluor hücre odası (Invitrogen, Carlsbad, CA) monte No 1 kalınlığı lamel üzerine yerleştirilir. </li><li> Özellikle Sıvı numuneler, insanlar için toksik olan bir silikon epoksi sayesinde açılış çimentolu bir lamel ile küçük bir cam şişe konur. Şişe sonra ölçüm için ters çevrilir. </li><li> Bizim sistemi, pompa ve sinyal bakliyat hassas zamanlama bağlı olduğundan, biz hedefi yukarı ve aşağı çevirir mikroskop geleneksel odak ayarı, kullanmak için değil kısıtlanır. Bu ekler ve sistemi optik yol çıkarır. Bunun yerine, kendi bağımsız odak denetimi mikroskop sahne üstüne monte edilmiş ikinci aşama bizim örnekleri yer. </li></ol> 2. Zaman-kapılı Raman almak için, uyarma ışını düzgün hazırlıklı olmalıdır. <ol><li> Sapph lazer (Chameleon, Tutarlı Sistemleri, Santa Clara, CA): 2.4 W ayarlanabilir darbeli Ti ortaya çıkan ışık ile başlar. Her bir atım, 80 MHz darbe tren, enerji 30 NJ 140 fs geçici bir genişliğe sahiptir ve 808 nm &#39;de merkezlenmiş ~ 6 nm spektral bant genişliğine sahip bir spektrum vardır. </li><li> Geri-yansımaları lazer boşluğu yeniden girmesini önlemek için, ışık Faraday izolatör geçirilir. Faraday izolatör önce yerleştirilen bir yarım dalga plakası sistemine gönderilen toplam güç sürekli ayar sağlar. </li><li> En Raman modları çözmek için çok geniş bir bant genişliği 6 mil olduğu için, kiriş, 808 nm merkezli bir (0.8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH) çok dar bir bant geçiren filtre ile gönderilir. </li><li> Işık daha sonra akromatik bir kristal (CASIX, Fuzhou, Çin Halk Cumhuriyeti), 808 nm, 404 nm dalga boyu yarıya 5 mm β-Baryum Borat (BBO) üzerine giyilen erkek yeleği (f = 100 mm) odaklanmıştır. BBO kristal bir bağlama ucu ve tilt kontrolleri ile yerleştirilir ve aynı zamanda bir çeviri aşamasında üzerine monte edilmiş. Dalga boyu dönüşüm verimliliği maksimize etmek için, kristal ikilisinin odak hakkında tam simetrik yerleştirilen ve kristal ekseni gelen ışının kutuplaşma hizalanmış olmalıdır. </li><li> Dalga boyu dönüşüm verimliliği kutuplaşma bağımlı olduğundan, örnek gönderilen ışık miktarı üzerinden kontrol Faraday izolatör sonra ikinci bir yarım dalga plakası koyarak elde edilebilir. Bu waveplate döner, örnek gönderilen ışık yoğunluğu şiddeti pompa ışın (aşağıda ele alınacak) gönderilen bağımsız olarak ayarlanabilir. </li><li> Dalga boyu dönüştürülür ışık çıkmadan ışını mikroskop objektif arka diyafram doldurmak için yeterince büyük ve ters bir mikroskobu (IX-71, Olympus, içine yönelik olduğunu gibi seçilen ikinci bir akromatik giyilen erkek yeleği (f = 500 mm) tarafından recollimated iki direksiyon aynalar vasıtasıyla Center Valley, PA). </li><li> Sistemin en monolitik bileşeni içinde barındıran optik eleman mikroskop objektif, optik ekseni tanımlar. Bu eksen uyarma ışın hizalamak için, bir ayna mikroskop örnek düzlemde yer almaktadır. Bir CCD kamera dönemi (μEye, IDS, Obersulm, Almanya) mikroskop görüntüleme bağlantı noktasına bağlı arka yansıtılan lazer ışını gözlemlerken iki direksiyon aynalar sonra iteratif ayarlanmış. Kamera görüntü mikroskop alan görüş merkezli olduğunu varsayarsak, ışın odak noktası, z-ekseni boyunca objektif, mikroskop çip ve çeviri üzerinde yoğunlaşmış-eksen merkez noktası değişmez odak dışı demetinin. </li><li> Bir örnek, örnek düzlemde yerleştirilir ve ışınlanmış zaman lazer ışığı Raman saçılması oluşur. Mikroskop objektif altına yerleştirilen bir dikroik filtre Raman dağınık ışık mikroskop yan port yönlendirme, uyarma ışın dalga boyu kaymıştır Raman dağınık ışık (floresan) ayırır. Mikroskop bu yolu içinde herhangi bir sinyal ışığı collimated mikroskop çıkar böyle lensler, kaldırmak için güncellenmiştir. </li><li> Mikroskop ortaya çıkan sinyal ışını Glan-thompson polarize açık diyafram daha büyük olduğundan, bir 0.47x teleskop iki akromatik çiftleri (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm) inşa ışını küçültmek için kullanılır. </li><li> Sinyal, ışık daha sonra laboratuar çerçevesi dikey saygı ile 0 ° odaklı bir Glan Tekin polarize kutuplaşmış ve pompa ışını ile recombined bir dikroik ayna. </li></ol> 3. En yüksek verimle çalışması için optik kapısı için de pompa ışın (Kerr kiriş) hazırlanması, bakım alınmalıdır. <ol&gt; <li> Pompa darbesinin ilk sinyal ışını nihai boyutuna uyacak şekilde iki akromatik çiftleri (f1 = 35 mm, f2 = 100 mm) ile yapılmış bir teleskop ile 0.35x tarafından büyütülür. </li><li> Pompa ışını sonra, pompa ve sinyal bakliyat (aşağıda ele alınacak ayarlama) zamansal örtüşme sağlamak için ayarlanmış olabilir doğrusal bir çeviri sahne üzerine yerleştirilen uygun bir prizma açısı oluşan bir gecikme hattına gönderilir. </li><li> Gecikme hattı sonra, ışın laboratuar çerçeve içinde dikey 45 ° odaklı bir yarım dalga plakası ve polarize yoluyla gönderilir. Doğrusal olmayan orta ulaştığında pompa ışın uygun kutuplaşma devlet sağlar. </li><li> Işık daha sonra iki direksiyon aynalar, ince pompa ışın konumunu ayarlamak için kullanılan bir piezo-elektrik kontrolleri, yansıyan sinyal ışını ile mekansal örtüşür. Üst üste iki ayrı yerde, biri yakın ve kirişler kombine dikroik ayna uzak bir pompa ve sinyal kirişler gözlemleyerek elde edilir. Yakın ve uzak noktada kirişler üst üste piezo ayna iki kirişler üst üste ilk direksiyon ayna kullanarak, pompa ışınının tam collinear sinyal ışını ile yapılabilir. </li><li> Iki ışın kombine toplanan zaman kapı sinyali en üst düzeye çıkarmak için, Kerr kapısı ve toplama sistemi kurulur. </li></ol> 4. Iki ışın kombine toplanan zaman kapı sinyali en üst düzeye çıkarmak için, Kerr kapısı ve toplama sistemi kurulur. <ol><li> Pompa ve sinyal kirişler, doğrusal olmayan orta içinde, heyecan verici Raman saçılması herhangi bir kalıntı uyarma ışık önlemek için 404 nm dalga boyunda bir OD 6 bir dikroik filtre ilk geçirilir. </li><li> Pompa ve sinyal kirişler sonra her ikisi de bir akromatik doğrusal olmayan malzeme içeren bir 1 cm yollu kuvars küvet içine giyilen erkek yeleği (f = 35 mm) tarafından odaklı. Uygun bir yüksek doğrusal olmayan indeksi (CS 2 daha yüksek) ve uygun kısa temporal yanıt (&lt;2 bg) olan herhangi bir doğrusal olmayan malzeme, burada kullanılabilir. Bu deneyler için, doğrusal olmayan bir dizin n 2 = 3.1 x 10 -18 m 2 / W. karbon disülfit, CS 2, Işık daha sonra ikinci bir ilk özdeş bir odak uzaklığı ile elektronların ikili recollimated. </li><li> Kirişler sonra bir OD (10) 808 nm&#39;de kombine olduğu emme ve girişim filtreleri bir dizi aracılığıyla sonra geçti ve dönen bir montaj Glan Tekin analizörü, ve. </li><li> Son olarak, sinyal, ışık, akromatik, lif, x, y ve z çeviri sağlayan bir sahne monte 50 mikron modlu fiber optik, içine giyilen erkek yeleği (f = 35 mm) tarafından odaklı Lif, daha sonra ticari bir görüntüleme spektrografla bağlı CCD kamera (SP2300i ve sırasıyla Pixis 100B, her ikisi de Princeton Instruments, Trenton tarafından üretilen, NJ) ile birleştirilmiştir. </li><li> Analizörü toplanan sinyali en üst düzeye çıkarmak için toplama sistemi hizalamak için, 0 ° ve toluen bir test örneği örnek düzlemde yerleştirilir. X, y ve z fiber montaj kontrolleri ayarlayarak, toplanan Raman sinyal optimize edilmiştir. </li><li> Pompa ve sinyal kirişler uygun mekansal ve zamansal örtüşme sağlamak için, bir ayna mikroskop örnek düzlemde yer alır. 404 nm filtre sistemden kaldırılır. Analizörü 90 döndürülmüş ° retroreflected 404 nm ışın yoğunluğu ile kamera doyurabilecek olmadığı gibi ayarlanabilir spektrografla içine gönderilir. Kapalı pompa ışını analizörü iletilen 404 nm sinyali en aza indirmek için döndürülür. Pompa ışını geri açıkken 404 nm ışık iletim artmaya başlayıncaya kadar, gecikme sahne yavaş yavaş ayarlanmıştır. Sonra, iteratif gecikme aşamasında, piezo-elektrikli ayna ayarlama, ve x, y ve z fiber kontrolleri, bir sinyalin en üst düzeye çıkarır. </li><li> 404 nm ışın ve Raman dağınık ışık sistemi ile biraz farklı yollar alabilir retro-yansıyan Çünkü, son ayarlamaları değiştirerek örnek sahne ve biraz ince ayar hizalama güçlü bir Raman Yorum; (örneğin, toluen gibi) koyarak yapılır gecikme aşamada, piezeo elektrikli ayna, ve fiber x, y ve z kontrolleri Raman sinyal optimize etmek. </li></ol> 5. Tek bir zaman-kapılı Raman spektrumu toplanması birkaç spektrumları edinimi, sistemi eserler düzeltmek için gereklidir. <ol><li> 0 °, uyarma ışını ve kapalı pompa ışını analizörü ile, bir &quot;ungated&quot; spektrum zaman yolluk sistemi yararına olmadan kazanılmış olurdu spektrumu temsil alınır. </li><li> Analizör 90 °, uyarma kiriş ve pompa ışın hala kapalı olarak ayarlanmış bir arka zemin spektrum sisteminde polarize ve diğer unsurlar sızan sokak ışık miktarını temsil eden, alınır. </li><li> 90 kalan analizörü °ve tüm kirişler, pompa demetinin varlığı ile çapraz polarize üzerinden izin Raman dağınık ışık temsil eden &quot;gated&quot; spektrum alınır. </li><li> Son olarak, hala 90 ° analizörü ile, uyarma ışın ve pompa ışın, ikinci bir arka plan spektrumu spektrografla girerek 808 nm ışık kalıntı miktarları &quot;geçitli&quot; spektrum katkısını temsil alınır. </li><li> Ayrıca, kamera ve elektronik temel &quot;karanlık&quot; sinyal seviyesi karakterize bir spektrum, kapalı tüm lazerler ile alınır. </li><li> Yaygın bir sorun birkaç dakika açıklıklı üzerinden veri satın alırken spektrumları genellikle uzun entegrasyon süreleri gerektirdiğinden, bu kozmik ışınların düzgün bir şekilde düzeltilmesi için izin vermek için birkaç adet (kare) Bu entegrasyon süresi kırmak için zorunludur. </li></ol> 6. Kazanılmış sonra, birkaç işlem adımları verilerin kalite ve görünümünü iyileştirmek için faydalıdır. <ol><li> İlk olarak, tüm spektrumları karanlık bir &quot;karanlık&quot; spektrum çıkarılarak giderilmiştir. </li><li> Kozmik ışınlar düzeltmek için, bir satın alma oluşturan birkaç kare piksel piksel olarak birbirleriyle karşılaştırılır. Tüm kareleri arasında o piksel için medyan değeri 2 medyan sapmalar dışında kalan herhangi bir çerçevenin herhangi bir piksel için, o pikselin değeri tüm kareleri arasında medyan değeri ile değiştirilir. </li><li> Daha sonra kozmik ışın düzeltilmiş kare ortalama ve Savitzky-Golay filtresi 1 yüzey düzeltilmelidir . </li><li> &quot;Gerçek&quot; geçitli spektrum ayıklamak için, ölçülen kapılı spektrumu &quot;pompa sadece&quot; spektrumları &quot;uyarma yalnızca&quot; çıkarma ve. </li><li> Son olarak, kapı ve ungated spektrumları sonra Lieber ve Mahadevan-Jansen 2 yöntemi kullanılarak belirlenen 5 inci sipariş polinom çıkarılarak düzeltilmiş arka plan vardır. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Kerr yolluk sisteminin şematik diyagramı. SHG yolu mavi ile yazılmıştır ise pompa ışın yolu, kırmızı renkte gösterilmiştir. Floresan zamansal filtre yolu sarı gösterilir Raman ve Floresans çakışan yol, yeşil gösterilir. Kısaltmalar aşağıdaki gibi: BPF, bant geçiren filtre, CCD, şarj çiftli aygıt; DCM, dikroik ayna; FI, Faraday izolatör; λ / 2, yarım dalga plakası; LPF, uzun-pass filtre; NLM, doğrusal olmayan orta, P, polarize SHG, ikinci harmonik üretimi kristal. <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2: immersiyon çözünmüş kumarin Ham spektrumları. Kırmızı eğri kapısı açık tutulan (analizörü maksimum iletim) ile alınan spektrum gösterir. Siyah eğri minimum iletim ve bir pompa ışın uygulanır (kapılı spektrum) hizalanmış analizörü ile alınan spektrum gösterir. Mavi eğri minimum iletim ve hiçbir pompa ışın uygulanan dizilen analizörü ile alınan spectum (kapı kapalı tutulan) gösterir. Yeşil eğri, sadece pompa ışın uygulanmış alınan spektrum gösterir. Kesikli kırmızı çizgiler aşağıda panelinde gösterilir spektral bölgede göstermektedir. Tüm spektrumları 11 puan, 3. sıra Savitzky Golay filtre ile düzeltti olmuştur. Alt: floresan arka plan çıkarma sonra immersiyon çözünmüş kumarin Spectra. Kırmızı eğri kapısı ile spektrum açık tutulan, ve mavi kapılı spektrum eğrisi. Kapılı spektrum yağların dolambaçlı wavenumber yüksek tepe özelliği açıkça gösterir.

<ol>
	<li>Savitzky, A., Golay, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoothing+and+differentiation+of+data+by+simplified+least+squares+procedures.">Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures.</a> Analytical Chemistry. 36, 1627-1639 (1964).</li><li>Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+subtraction+of+fluorescence+from+biological+Raman+spectra.">Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra.</a> Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).</li><li>Gniadecka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+diagnosis+by+Raman+spectroscopy+and+neural+networks:+Structure+alterations+in+proteins+and+lipids+in+intact+cancer+tissue.">Melanoma diagnosis by Raman spectroscopy and neural networks: Structure alterations in proteins and lipids in intact cancer tissue.</a> Journal of Investiga-tive Dermatology. 122, 443-449 (2004).</li><li>Lieber, C. A., Majumder, S. K., Billheimer, D., Ellis, D. L., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+microspectroscopy+for+skin+cancer+detection+in+vitro.">Raman microspectroscopy for skin cancer detection in vitro.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 024013-024013 (2008).</li><li>Chen, K., Qin, Y., Zheng, F., Sun, M., Shi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+colorectal+cancer+using+Raman+spectroscopy+of+laser-trapped+single+living+epithelial+cells.">Diagnosis of colorectal cancer using Raman spectroscopy of laser-trapped single living epithelial cells.</a> Optics Letters. 31, 2015-2017 (2006).</li><li>Chan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondestructive+identification+of+individual+leukemia+cells+by+laser+trapping+Raman+spectroscopy.">Nondestructive identification of individual leukemia cells by laser trapping Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 80, 2180-2187 (2008).</li><li>Zhu, Q. Y., Quivey, R. G., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+bacterial+concentration+fractions+in+polymicrobial+mixtures+by+Raman+microspectroscopy.">Measurement of bacterial concentration fractions in polymicrobial mixtures by Raman microspectroscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 9, 1182-1186 (2004).</li><li>R&#246;sch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxonomic+identification+of+single+bacteria+by+micro-Raman+spectroscopy:+Application+to+clean-room-relevant+biological+contaminations.">Chemotaxonomic identification of single bacteria by micro-Raman spectroscopy: Application to clean-room-relevant biological contaminations.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 1626-1637 (2005).</li><li>Moritz, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopic+signatures+of+the+metabolic+states+of+escherichia+coli+cells+and+their+dependence+on+antibiotics+treatment.">Raman spectroscopic signatures of the metabolic states of escherichia coli cells and their dependence on antibiotics treatment.</a> Biophysical Journal. 98, 742a-742a (2010).</li><li>Dehring, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+chemical+changes+in+subchondral+bone+taken+from+murine+knee+joints+using+Raman+spectroscopy.">Identifying chemical changes in subchondral bone taken from murine knee joints using Raman spectroscopy.</a> Applied Spectroscopy. 60, 1134-1141 (2006).</li><li>Berger, A. J., Koo, T. W., Itzkan, I., Horowitz, G., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+blood+analysis+by+near-infrared+Raman+spectroscopy.">Multicomponent blood analysis by near-infrared Raman spectroscopy.</a> Applied Optics. 38, 2916-2926 (1999).</li><li>Qi, D., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+concentration+measurement+in+blood+serum+and+urine+samples+using+liquid-core+optical+fiber+Raman+spectroscopy.">Chemical concentration measurement in blood serum and urine samples using liquid-core optical fiber Raman spectroscopy.</a> Applied Spectroscopy. 46, 1726-1734 (2007).</li><li>Beier, B. D., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+automated+background+subtraction+from+Raman+spectra+containing+known+contaminants.">Method for automated background subtraction from Raman spectra containing known contaminants.</a> The Analyst. 134, 1198-1202 (2009).</li><li>De Luca, A. C., Mazilu, M., Riches, A., Herrington, C. S., Dholakia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+fluorescence+suppression+in+modulated+Raman+spectroscopy.">Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 738-745 (2010).</li><li>Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+imaging+of+tissue+in+vivo+with+video-rate+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 16807-16812 (2005).</li><li>Jones, W. J., Stoiche, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+raman+spectra:+Induced+absorption+at+optical+frequencies.">Inverse raman spectra: Induced absorption at optical frequencies.</a> Physical Review Letters. 13, 657-659 (1964).</li><li>Freudiger, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+et+Imaging+with+High+Sensitivity+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Label-Free et Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Cui, M., Bachler, B. R., Ogilvie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+coherent+and+spontaneous+Raman+scattering+under+biological+imaging+conditions.">Comparing coherent and spontaneous Raman scattering under biological imaging conditions.</a> Optics Letters. 34, 773-775 (2009).</li><li>Matousek, P., Towrie, M., Stanley, A., Parker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+rejection+of+fluorescence+from+Raman+spectra+using+picosecond+Kerr+gating.">Efficient rejection of fluorescence from Raman spectra using picosecond Kerr gating.</a> Applied Spectroscopy. 53, 1485-1489 (1999).</li><li>Matousek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+suppression+in+resonance+Raman+spectroscopy+using+a+high-performance+picosecond+Kerr+gate.">Fluorescence suppression in resonance Raman spectroscopy using a high-performance picosecond Kerr gate.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 32, 983-988 (2001).</li><li>Knorr, F., Smith, Z. J., Wachsmann-Hogiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+time-gated+system+for+Raman+spectroscopy+of+biological+samples.">Development of a time-gated system for Raman spectroscopy of biological samples.</a> Optics Express. 18, 20049-20058 (2010).</li></ol>

Biyomedikal Raman spektroskopisi alanında biyolojik teşhis çok zor zorlukları çözmek için gösterdi potansiyel bir sonucu olarak son birkaç yıl içinde artan bir ilgi gördü. Örneğin, Raman kanser tespiti 3, 4, 5, 6 tanısal değeri olduğu gösterilmiştir. Raman spektroskopisi bakteriyel kantitatif 7, 8 ve bakteriyel ilaç yanıtı 9 da kullanılır olmuştur. Ayrıca kemik sağlığı 10 Biyolojik Akışkanlar analizi 11, 12 arasında değişen diğer...

<table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Lensler </td><td> ThorLabs </td><td> Çeşitli </td><td> Her% 1 maksimum iletim kayıpları var kaplı tüm objektifler </td></tr><tr><td> Ayarlanabilir Ti: Sapph lazer </td><td> Tutarlı </td><td> Bukalemun </td><td> 30 NJ, 200, fs, 80 MHz </td></tr><tr><td> 40X yağ daldırma hedefi </td><td> Olympus </td><td> UApo/340 </td><td> NA = 1.35 </td></tr><tr><td> Ters mikroskop </td><td> Olympus </td><td> IX-71 </td><td> Yan port tüm objektifler kaldırmak için Modifiye </td></tr><tr><td> Yarım dalga plaka </td><td> Thorlabs </td><td> AHWP05M-600 </td><td></td></tr><tr><td> Glan-Tekin polarize </td><td> Thorlabs </td><td> GTH10M </td><td> ~% 10 iletim kaybı </td></tr><tr><td> Spektrometre </td><td> PI Acton </td><td> SP2300i </td><td></td></tr><tr><td> CCD </td><td> PI Acton </td><td> Pixis 100B </td><td></td></tr><tr><td> Mathmatical yazılım </td><td> MathWorks </td><td> MATLAB </td><td> versiyon 2008a </td></tr><tr><td> Faraday izolatör </td><td> EOT </td><td> BB8-5I </td><td></td></tr><tr><td> Piezo-elektrikli ayna </td><td> Newport </td><td> AG-M100 </td><td></td></tr><tr><td> BBO kristal </td><td> CASIX </td><td> özel </td><td> 1 mm kalınlık </td></tr><tr><td> Bandpass 1 </td><td> Andover </td><td> 008FC14 </td><td> 808 ± 0.4 nm </td></tr><tr><td> Dikroik ayna </td><td> Semrock </td><td> FF662-FDI01 </td><td> 662 nm bant kenarı </td></tr><tr><td> Uzun-pass filtre </td><td> Semrock </td><td> BLP01-405R </td><td> 417 nm bant kenarı </td></tr><tr><td> Bandpass filtresi 2 </td><td> Semrock </td><td> FF02-447/60 </td><td> 417-447 nm </td></tr><tr><td> CS 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 335266 </td><td> % 99 saflıkta </td></tr><tr><td> Kumarin 30 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 546127 </td><td> % 99 saflıkta </td></tr><tr><td> Immersiyon </td><td> Cargille </td><td> 16242 </td><td> Tip DF </td></tr></tbody></table>

rejection of fluorescence background in resonance and spontaneous raman microspectroscopy

Raman spektroskopisi, sık sık, özellikle biyolojik örnekler için, güçlü bir floresan arka plan boğulmuş. Hemen geç gelen floresan ışık Raman dağınık ışık gelen bir örnek, ultra hızlı bakliyat, zamansal zaman çizelgesi izole bir pikosaniye sinyalleri örtüşen Işıksal ayrı bir sistem bir tren ile heyecanlı. Burada Raman ve floresan sinyalleri izole etmek için, düşük güç optik Kerr kapı şeklinde tüm optik anahtarlama kullanan bir karmaşık nonlineer optik sistem inşası ve işletilmesi tartışacağız. &lt;5 mW Raman saçılması heyecanlandırmak için örnek gönderilen 404 nm ışık dönüştürülen 808 nm ışık yaklaşık 200 mW, ortalama güç ve 80 MHz tekrarlama oranı 2,4 W ile tek bir 808 nm lazer ikiye bölünmüş durumda. Kalan dönüştürülmemiş 808 nm ışık daha sonra, tüm optik deklanşör pompa gibi davranır doğrusal olmayan bir orta gönderdi. Deklanşör yaklaşık% 5 &#39;lik bir maksimum verimliliği ile 800 fs açar ve kapatır. Bu sistemi kullanarak, başarılı bir darbe enerjileri ve biyolojik olarak güvenli kalır ortalama güçleri kullanarak 80 MHz bir tekrarlama oranı Raman ve floresan sinyalleri birbirinden ayırmak mümkün. Sistem, optik güç açısından hiçbir yedek kapasite olduğundan, detaylı birçok tasarım ve hizalama konuları sisteminin verimini en üst düzeye yardım. Biz de içinde sinyal ve pompa kirişler Kerr orta mekansal ve zamansal örtüşme yanı sıra spektral edinimi için ayrıntılı bir protokol elde etmek için bizim protokol tartışmak. Sonuç olarak, zaman yolluk sistemi kullanarak güçlü floresan varlığında elde edilen Raman birkaç temsilcisi sonuçları raporu.

Watch this Scientific Journal Video about Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy at JoVE.com

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Biz ultrafast tüm optik anahtarlama floresan sinyallerine karşı Raman izole etmek için kullanan bir karmaşık doğrusal olmayan optik sistem inşası ve işletilmesi tartışacağız. Bu sistemi kullanarak, başarılı bir darbe enerjileri ve biyolojik olarak güvenli kalır ortalama yetkileri kullanan, Raman ve floresan sinyalleri ayrı edebiliyoruz.

Rezonans ve spontan Raman Microspectroscopy Floresan Arkaplan reddi

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

rejection-fluorescence-background-resonance-spontaneous-raman

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K Görüntüleme.  University of California, Davis. Biz ultrafast tüm optik anahtarlama floresan sinyallerine karşı Raman izole etmek için kullanan bir karmaşık doğrusal olmayan optik sistem inşası ve işletilmesi tartışacağız. Bu sistemi kullanarak, başarılı bir darbe enerjileri ve biyolojik olarak güvenli kalır ortalama yetkileri kullanan, Raman ve floresan sinyalleri ayrı edebiliyoruz.

Video: Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Yaşayan Hücreler Moleküler Rotorlar arasında Flüoresans Ömrü Görüntüleme

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Biyomühendislik

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

Kendiliğinden oluşumu ve endoplazmik retikulum için aşağıdan yukarıya Model olarak yapay Lipid nanotüp ağların düzenlenmesi

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

Doku Teşhisi için Fare Beyninin Gerçek Zamanlı, İki Renkli Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...