Uyarılmış Raman saçılma mikroskopisi, lipitlerin hızlı ve nicel olarak algılanmasını sağlayan ve canlı hayvanlarda lipitlerin etiketsiz bir şekilde izlenmesini sağlayan kimyasal bir görüntüleme teknolojisidir. SRS mikroskopisinin geleneksel lipit algılama tekniklerine göre en önemli avantajı etiketsiz olması ve bu nedenle fotoğraf ağartma için diğer floresan ve boyama konuları kadar sürdürülebilir olmamasıdır. SRS mikroskopisinin model organizmalar, özellikle Caenorhabditis elegans için mevcut genetik ve biyokimyasal araçlarla birlikte kullanılması, lipid biyolojisinin ve metabolizmasının normal düzenleyicilerini incelemek için güçlü bir çerçeve sağlar.
Lazer ışınlarını SRS mikroskobuna beslemek için, önce periskopu, ışını bir picosecond ışık kaynağı çıkışından mikroskopun tarayıcısındaki kızılötesi lazer giriş bağlantı noktasına kaldıracak şekilde ayarlayın ve lazerleri başlatmak için lazer kontrol yazılımını açın. Pompa lazer gücünü 50 miliwatt'a düşür ve pompa sinyalini 750 nanometreye ayarlayın. Mikroskop hedeflerinin arka diyafram açıklığına uyacak şekilde ışın çapını ayarlamak için bir ışın genişletici kullanın.
Lazer ışınını periskopa yönlendirmek ve periskopun başını sallamayı ayar aralığının ortasına ayarlamak için M1 ve M2 olmak üzere iki röle aynası kullanın. Her aynanın ilk konumunu ve açısını seçin, böylece lazer ışını yaklaşık olarak aynanın ortasına çarparak ışını mikroskopa fırlatır ve ders hizalamasını gerçekleştirmek için mikroskobun nesnel kulesinde boş bir bağlantı noktası kullanın. İletilen ışığın gücünü ölçmek için güç ölçer probunun hedef bağlantı noktasına yerleştirin ve mikroskop tarayıcısını en yüksek yakınlaştırma olan 50X'e ayarlayın.
Odaklanmış lazer ışını noktası ile iletilen ışığın gücünü ölçün ve en yüksek iletimli lazer gücünü elde etmek için M1 ve M2 aynalarının düğmelerini yinelemeli olarak optimize edin. Işığın hedefin merkezinden geçtiğinden emin olmak için iletilen ışığın ince hizalamasını gerçekleştirmek için hizalama aracını kullanın ve floresan hedef hizalama kapağını boş nesnel koltuğa yerleştirin. Lazer ışını noktasını ortalamak için ilk direksiyon aynası M1'in düğmelerini ayarlayın ve diğer ucunda hizalama kapağı olan uzatma tüpünü lazer ışını noktasını izlemek için boş bir nesnel koltuğa takın.
Ardından, ikinci direksiyon aynası M2'nin düğmelerini, lazer ışını noktasını uzatma tüpünün diğer ucunda tekrar ortalamak için ayarlayın. SRS algılama modülünü kurmak için, iletilen lazeri fotoğraf diyot modülüne yönlendirmek için kondenserden sonra bir ışın ayırıcı küp yerleştirin. Elektronik bağlantıyı kurmak için, Stokes ışınının yoğunluğunu modüle etmek ve uyarılmış Raman kaybının demodülasyonu için fotoğraf diyotunun çıkış sinyalini kilitlenmiş amplifikatöre beslemek için picosecond tune-able lazerin içinde 20 megahertz'de yerleşik bir elektro optik modülatör kullanın.
Ardından, elektrik analog sinyalini dijital sinyale dönüştürmek için kilitli amplifikatör çıkışını mikroskobun analog kutusuna besleyin. Görüntüleme koşullarını optimize etmek için, mini mikroskop slayt odasına beş mikrolitre oleik asit ekleyin ve numuneyi bir kapak kayması ile örtün. Numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin ve damlacığı bulmak ve odaklanmak için ped kenarını kullanın.
Kohler aydınlatması için kondenseri ayarlayın ve pompa ışını yolunun hala doğru olup olmadığını kontrol etmek için kızılötesi sensör kartı ve kızılötesi görüntüleyici kullanın. Gecikme aşamasının sıfır femtosaniye olarak ayarlandırıldığını onaylayın ve pompa ışını dalga boylarını 795,8 nanometreye ayarlayın. Pompa ışınının gücünü 50 miliwatt'a ayarlayın ve Stoke ışınını 100 miliwatt'a ayarlayın.
Hem kirişler hem de lazerin ana deklanşörü için deklanşörü açın. Örneği tarayın ve bilgisayar ekranındaki görüntüyü kontrol edin. Ekran modunu yüksek düşük olarak değiştirin ve aralığı yaklaşık %50 doygunluk görecek şekilde ayarlayın.
Doygunluğun görüntüde ortalanıp ortalanmadığını kontrol edin, görüntü yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak ve en yüksek yoğunluğu gerektiği gibi ortalamak için pompanın ve Stokes'un optimize edilmiş çakışması için picosecond tune-able lazer sisteminin içindeki direksiyon aynalarını dikkatlice ayarlayın. Her görüntüleme oturumundan önce, iki kat laboratuvar bandı ile destek slaytları arasına yerleştirilmiş temiz bir cam slayda 100 mikrolitre sıcak %2 agarose ekleyin ve ilk slaydın üzerine hızlı bir şekilde ikinci bir slayt yerleştirin. İnce, çift agarose ped oluşturmak ve agarose'un soğumasını sağlamak için hafifçe bastırılır.
Solucanları görüntüleme için monte etmek için, bir kapak kaymasına 10 ila 20 solucan başına dört ila beş mikroliter anestezik ajan damlası yerleştirin ve görüntülenecek solucanları seçmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın, solucanları toplandıkları gibi anestezi damlacığı üzerine yerleştirin. Tüm solucanlar toplandığında, solucanları agarose ped ile cam slaytla örtün. Görüntüleme için, solucan örneğini nesnel lense bakan kapak kayması ile monte edin ve solucanları bulmak için parlak alan ışık kaynağını göz merceğine yönlendirin.
Solucanları odak noktasına getirin ve kondenser konumunu buna göre ayarlayın. Pompa lazer gücünü 200 miliwatt'a ve IR gücünü 400 miliwatt'a ayarlayarak lazer güçlerini ayarlayın. Solucan SRS sinyalinin demodülasyonu için kilitleme amplifikatörü ayarlayın.
İlk solucanı hızlı bir tarama hızında taramaya başlayın ve ilgi alanını bulmak için ince odağı ayarlayın. Sinyal optimize edildiğinde, SRS görüntüsünü elde etmek ve görüntüyü yüksek çözünürlük sağlayan bir biçimde kaydetmek için daha yavaş bir tarama hızına ve daha yüksek bir piksel çözünürlüğüne geçin. Tüm numuneler görüntülendiğinde, lazer kaynağını bekleme üzerine yerleştirin ve ilgili tüm ekipmanı kapatın.
Görüntüleri analiz etmek için Dosyaları ImageJ'de açın ve analiz edilecek özellikleri seçmek için ölçümleri analiz et ve ayarla'yı seçin. Ölçülecek solucan bağırsağı bölgesini ana hatlarıyla belirlemek için çokgen seçim aracını kullanın ve tekrar analiz et ve ölç'ü tıklayın. Ölçümler sonuçlar penceresinde görünecektir.
Tüm solucanlar ana hatlarıyla belirtildiğinde, belirli bir genotipteki solucanların her birinin ölçümlerini kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın. Arka plan ölçüm değeri için, solucanın çevresinde herhangi bir SRS sinyali olmayan bir alan seçin ve belirli bir genotip veya test grubundaki tüm solucanlardan çıkarılan ortalama gri değerlerin ortalama ve standart sapmasını hesaplamak için her bir solucan için ölçümden arka plan ortalama gri değerini çıkarın. Bu değerler daha sonra denetim grubunun ortalamasına normalleştirilebilir.
Bu temsili analizde, yaş senkronize vahşi tip solucanlarda ve insülin reseptöründen yoksun daf-2 mutantlarındaki bağırsak lipit düzeyleri yetişkinlik döneminde ölçülmektedir. Beklendiği gibi, vahşi tip solucanlarda, ilk günden başlayarak yetişkinliğin dokuzuncu gününe kadar devam eden lipit seviyelerinde bir düşüş gözlenir. Bununla birlikte, daf-2 mutantlarındaki lipit seviyeleri beş günlük olana kadar artar ve bu noktada vahşi tipten yaklaşık 2,5 ila üç kat daha yüksek sabit kalırlar.
Daf-16 inaktivasyonu, daf-2 mutantlarının lipit seviyelerindeki artışı bastırır. Daf-2, daf-16 çift mutantlarda daf-16a a veya daf-16b izoformunun ekspresyolü lipit seviyelerini geri getirmez. Bununla birlikte, daf-16d/f/h izoformunun ekspresyoformu, daf-2, daf-16 çift mutantlardaki lipit seviyelerini daf-2 tek mutantlarda gözlenen seviyelere geri kazandırmak için yeterlidir.
Bu sonuçlar, daf-16d/f/h izoformun daf-2 mutant solucanlarında lipid metabolizmasını özel olarak modüle ettiğini göstermektedir. Görüntüleme seansı boyunca pompa ve Stokes ışınları için aynı lazer gücünün kullanılması ve her altı ve dört tutarlı nicelemede bir kontrol grubu dahil edilmesi önemlidir. Lipid depolamayı ölçmeye ek olarak, SRS mikroskopisi döteryum gibi biyoorthogonal etiketlerle bir araya gelebilir ve lipid birleştirme, sentez ve bozulma dinamiklerini görselleştirmek için uygulanabilir.
SRS mikroskopisi çoklamaya izin veriyor ve farklı hücre altı bölmelerde birden fazla biyomolekülün görüntülenebilmesi için uygulanabiliyor. Hiperspektral SRS mikroskopisi metabolik dinamikleri keşfetmede harika bir geleceğe sahiptir.
