Araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağlık hibe AI-52.381, CA138623 ve Kentucky Akciğer Kanseri Araştırma Kurulu ve James Graham Brown Kanser Merkezi&#39;nden kurumsal destek tarafından desteklenmektedir.

Metodoloji Mikroskop açıklaması Eclipse TE300 Nikon Ters Mikroskop bağlı TE-FM Epi-Floresan sistemi kullanılarak yapılan canlı hücre görüntüleme deneyleri. Mikroskop ısıtma sahne ile donatılmıştır. Serin bir ek bileşenini HD dijital / B CCD (Roper Bilimsel) kamera ve LAMDA 10-2 optik filtre değiştirici (Sutter aracı şirket) mikroskop eklenir. Uyarma ve emisyon dalga boylarında filtre çarklarını kontrollü ve Lamba 10-2 filtre çarkı denetleyici tarafından kontrol edilir, Sutter Aletleri Co Pozlama süresi 500 ms canlı hücrelerde RFP veya GFP görüntülemek için yeterli olmalıdır. Donanım kontrolü ve görüntülerin elde edilmesi Metamorph yazılımı tarafından kontrol edilir. EGFP / DsRed çift renk değişikliği, Krom Teknoloji Bu çalışmada filtreleri seçim, filtre S480/20x, S525/40m ve S565/25x, GFP ve RFP S620/60m sırasıyla setleri. Bu filtre, tekerlek altı filtre setleri kapasitelidir. Mikroskop Joy sopayla önce ProScan sahne denetleyicisi ile eklenir. Tüm bu donanım ekler Metamorph yazılım tarafından kontrol edilebilir. Mikroskop mikropipetler tutmak için mikromanipülatörler ile eklenir. A. Ölçüm Lökotrien B 4 Yönetmen Dendritik Hücre Göç Yukarıda açıklanan mikroskop ayarını kullanarak, biz, gerçek zamanlı olarak ligand yönettiği dendritik hücre göçü takip etmek için yöntemler geliştirdi. İki mikromanipülatörler (Narishige) mikroskop bağlı. LTB 4 degrade doğru dendritik hücreler (BMDCs) elde edilen fare kemik iliği kemotaksis kaydedildi. Burada, biz, mikro-pipet içine ligand yükleme ve hücre yönlü göç izlemek için mikroskobun ısıtılmış sahnede kemotaksis deney kurma, mikro-pipet çektirmesi kullanarak mikro-pipetler hazırlamak için yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yöntem, göçün yanı sıra canlı hücrelerde kemotaksis inhibitörleri etkisi inducing farklı chemoattractants etkinliğini test etmek için uygulanabilir. Jüpiter 22 dahil olmak üzere çeşitli yayınlarda fare BMDCs 21 izolasyonu tarif edilmiştir. 1. BMDCs, hazırlanması <ol><li> Kapak kayma alt Fluoro çanak ve onları 16 saat öncesinde deney için büyümeye izin BMDCs Plate (10 gün kültürleme sonra). </li><li> 1X PBS 3 mL en az 2 kez (plaka 1X PBS 3 ml ekleyerek ve tampon dışarı aspire) ile hücrelerin yıkayın. </li><li> Plaka 1XPBS 2 mL ekleyin. Hücreleri deney için hazır. 37 ° C inkübatör önce deneme için hücrelerin tutun. </li></ol> Ligand yüklü mikro pipet hazırlanması: <ol start="4"><li> Dikey mikropipet çektirmesi (Narishige International USA, Inc.), Kılcal cam tüpler (6 &quot;, Kedi # 625.500, Sistemleri A.Ş. Cam standart, 0.75 mm x 0.4 mm) sabitleyin. </li><li> 52 yaşındayken sıcaklık ° C ve cam, keskin kenar ipuçları oluşturacak şekilde eritebilir ve apart çekmek için izin tutun. </li><li> Pipet mikro pipet tutucu üzerine sabitleyin. </li><li> M-900 (Narishige International USA, Inc.) Mikroskop altında seyrederek Micro sahte mikro pipet kullanarak pürüzlü kenarlar pürüzsüz. </li><li> Her bir deney için en az 10-20 pipetler hazırlayın. Not: mikropipetler Dünya Hassas Aletler (μ TIP, T1801TW1F) satın alınabilir. </li><li> Ligand istenen konsantrasyon (500 mcL deneyde 100 nM LTB 4) 1 ml effendorf tüpe alın ve çözüm mikro pipet tutmak ve çözüm mikro pipet (dolum) girmek için izin verin . </li><li> 1 ml ligand ve şırınga (1 cc tüberkülin şırınga) içine alın ve yavaş yavaş üst mikro pipet içine doldurun Mikro-iğne (MF 28G-5, Dünya Hassas Aletler) kullanarak ligand doldurun. </li><li> Boru, ligand ile doludur 1 ml şırınga, iğne (21 G 11 / 2), pipet ve tüp pipet sıkıca bağlayın. </li><li> Şimdi, mikro manipülatörler üzerine mikroskop sahne ve düzeltmek için mikro-pipet dolu ligand dikkatli bir şekilde hareket ettirin. </li><li> , Emin ligand ucundan yavaş yavaş serbest olmak için şırınga az basınç uygulayın. </li><li> Mikroskop kaplama olgunlaşmamış BMDCs getirin ve ısıtmalı plaka (37 ° C) evre onları tutmak. </li><li> Floro çanak kapağı çıkarın. </li><li> Immersiyon yağı 60X objektif lens kullanarak hücrelerin odaklanın. </li><li> Dikkatle, pipet hücrelerin yakınlığı &#39;Kaba Kılavuzu Manipulator MN-188NE kullanarak yüklü ligand aşağı getirmek. </li><li> &#39;Hidrolik Güzel Mikromanipülatör MN-188 KD&#39; pipet kullanarak odaklanın. </li><li> Ligand çanak içine serbest olduğundan emin olmak için şırınga az basınç uygulayın. </li><li> Elde etmek için görüntü toplama parametreleri ayarlayın parlak Metamorph yazılım kullanarak 2 saat için her 15 saniyede (10 ms maruz) yayınlandı. </li><li> Pr için her 30 dakikada bir izlemeligand doğru göç ogression. </li><li> Pipet ucu hücreleri de kalabalık iseniz, deney göç devam plakasını ucunun konumunu değiştirmek. </li></ol> B. Ölçüm GPCR (BLT1) ve Sitosolik Protein (β-arrestin) etkileşmeleri, Canlı Hücrelerde Translokasyon 1. Plazmid DNA oluşturur hazırlanması Jala&#39;dan ve ark (2005) 18 DNA plazmid yapıları detayları tarif edildi. 2. İnsan BLT1 RFP ve β-Arrestin-GFP RBL-2H3 Hücreler içine Transfeksiyon <ol><li> Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) 37 Hücreleri (60 ila 70% izdiham) ° C% 95 hava nemlendirilmiş bir atmosferde,% 5 CO 2 büyüme medyada tek tabaka kültürler (DMEM% 15 FBS, 2 ile desteklenmiş olarak koruyun mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve T75 matara 100 mg / ml streptomisin). </li><li> 6 ml tripsin-EDTA (% 0.05 tripsin, 0.53 mM EDTA) kullanılarak ve 37 az 5 dakika boyunca inkübe çanak / şişeler hücreler Ayır ° C,% 95 hava nemlendirilmiş bir atmosferde% 5 CO 2. Hücrelerin dekolmanı ölçüde izlemek için matara yavaşça sallayın. </li><li> 6 büyüme medya mL balona 6 ml tripsin-EDTA içeren ve birden çok kez yukarı aşağı pipetleme karıştırarak hücreleri toplamak. 15 ml şahin tüpler içine hücreleri aktarın. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücre sayımı ve 4 x 10 6 hücre, 200 transfeksiyon medya mcL 3 dakika ve tekrar süspansiyon için 480g rpm (DMEM,% 20 FBS, 50 mM HEPES) 15 ml santrifüj tüpleri ve santrifüj . 3 transfections gerçekleştirmeyi planlıyorsanız, artan hücre sayısı ve hacim transfeksiyon orta hücreleri ve tranfection medya buna göre hazırlamak. </li><li> En az 1.5 mg / ml konsantrasyonlarda transfekte plazmid hazırlayın. Biz QIAGEN Maxi DNA plazmid kiti kullanılarak plazmid DNA hazırlıyoruz. 0.4 cm elektrot boşluk steril elektroforez küvetler, (Bio-Rad # 16.552.088), bireysel ya da insan BLT1-RFP (25 mikrogram) ve β-arrestin1-GFP (15 mikrogram) için hem de plazmid DNA&#39;lar kodlama ekleyin. </li><li> Yukarıdaki yeniden süspanse hücre 200 mcL alın ve hBLT1-RFP veya β-arrestin1-GFP veya her ikisini birlikte ya içeren küvetler koyun ve 1 ml steril bir pipet yardımıyla hafifçe karıştırın. </li><li> 10 dakika oda sıcaklığında yukarıdaki küvetler bırakın. </li><li> Gene Verici II hücreleri voltajı 250 v ve kapasitesi 500 μF Electroporate. </li><li> Elektroporasyon sonra hücreler 10 dakika süreyle oda sıcaklığında kalmasına izin. </li><li> Düzenli büyüme orta 1 mL alın ve küvetleri electroporated hücreleri ile karıştırın. </li><li> Bu karışımı,% 5 CO 2 ml normal büyüme medya içeren 35 mm doku cam alt kültür kaplarına (Fluoro çanak, Dünya Hassas Aletler) 300 mcL dağıtın ve 1 saat boyunca inkübe 37 ° C&#39;de% 95 hava nemlendirilmiş bir atmosferde. 2. Hücreleri çanak alt uymak için izin ver. </li><li> Düzenli büyüme medya ile 1 saat sonra inkübasyon ortamı değiştirin ve bunları 37 büyümeye izin ° C,% 95 hava nemlendirilmiş bir atmosferde 18-24 saat için% 5 CO 2 inkübatör. </li></ol> 3. Canlı Hücre Görüntüleme Görüntülerin elde edilmesi <ol><li> 18-24 saat sonra, 10 mM HEPES, pH 7.55 (plaka ve aspirat medya doğrudan sıcak medya 2 mL ekleyin. 2 veya 3 kez tekrarlayın) içeren 2 ml sıcak fenol kırmızısı ücretsiz RPMI hücreleri 2 veya 3 kere yıkayın. 1.8 ml 10 mM HEPES içeren sıcak fenol kırmızısı ücretsiz RPMI ekleyin. </li><li> HBLT1 RFP ve ısıtmalı mikroskop sahnede β-arrestin1-GFP (37 ° C) ile transfekte RBL-2H3 hücreleri içeren Yeri 30 mm cam lamel oturaklı kültür yemekleri. </li><li> 600x büyütme 60 X objektif Nikon Planı Apo 60X/1.4 sayısal diyafram immersiyon yağı lens (mikroskop sistemi mevcuttur) kullanarak hücre görüntüleri toplayın. </li><li> 60 x amacı lens üzerinde bir yağ damlası koyun ve odak düzenli parlak bir alan hücreler, plakanın alt dokunarak ışık iletilir. </li><li> Transfekte proteinlerin floresan, floresan filtre (RFP filtresi, β-arrestin1 görmek istiyorsanız, reseptör veya GFP görmek istiyorsanız), parlak bir alan (iletilen ışık) geçiş izlemek için. </li><li> Parlak ve sağlıklı hücre, hücre yüzeyinde RFP filtre ve görüntü yakalama kullanarak hBLT1 RFP ifade seçin. </li><li> Sonra GFP filtre kayması ve β-arrestin-GFP sitoplazma ifade emin olun ve görüntü yakalama. Sonra sözde hem renkli hem de görüntü yakalama zaman floresan ile kanama RFP ve GFP arasında meydana gelen almayan olduğunu emin olmak için, canlı hücre görüntüler lapsed önce. </li><li> Cep seçim sonra, yazılımı kullanarak amacınıza (bu örnekte Metamorph Yazılımı) göre parametrelerini ayarlamak. </li><li> Mevcut gösteri, onaltı bit görüntüleri geldi ile elde edilenra binning 1 set X 1 60 X objektif Nikon Planı Apo 60X/1.4 sayısal diyafram immersiyon yağı lens ile birlikte. </li><li> Metamorph yazılım tarafından kontrol edilen bu kullanıyorsanız filtre çarklarını 30 saniye zaman aralığı (translokasyon / etkileşim çok hızlı ise, bir zaman aralıklarında azaltabilir) aynı anda RFP ve GFP fluorochromes için floresan görüntüleri toplayın. </li><li> Kamera pozlama süreleri RFP ve GFP 1000 msn ayarlayın. (GFP RFP ve floresan yoğunluğuna göre özel maruz kalma sürelerini ayarlama). </li><li> İlk 1 dakika için 0 noktası olarak hizmet vermektedir ekleyerek ligand olmadan görüntüleri toplamak. </li><li> 1 dakika sonra plaka / veya hücre konumunu bozmadan ligand 200 mcL (10 mcM stok 1 mcM bir final konsantrasyon) ekleyin. </li><li> Ligand ekledikten sonra 60 dakika floresan görüntülerin dosya adlarının artan sipariş ile toplanır ve TIFF görüntüleri olarak depolanır. </li><li> Tüm bu dosyaları yazılım kullanarak zaman damgaları ile bireysel / kombine floresan görüntüler yığını dosyaları olarak yapılabilir. </li></ol> Süreci ve floresan proteinleri ve yerelleştirme ölçümü görüntüleri <ol><li> RFP ve GFP floresan filtreleri ile düz medya (hücreleri) ile görüntüler elde ve arka plan resimleri olarak kaydedebilirsiniz. Yukarıda elde edilen gerçek veriler görüntüleri çıkarmak için bu görüntüleri kullanın. </li><li> RFP ve GFP görüntüleri için ayrı görüntü yığını hazırlayın. </li><li> RFP ve GFP floresans yoğunluğu (BLT1 ve β-arrestin translokasyon) ölçmek için çeşitli bölgelerinde (yüzey vs sitozolik) Seç / tanımlamak </li><li> Miktarı floresan yoğunlukları zaman fonksiyonu olarak çizilir. Bu grafiği verilen molekülün translokasyonu kinetiği hakkında bilgi verecektir. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar A. Ölçüm Lökotrien B 4 Yönetmen Dendritik Hücre Göç Dendritik hücre lökotrien B 4 (Şekil 1 ve ekli video 1) 21 doğru göç belirlemek için bu protokolü açıklanan yöntem kullanılmıştır. Biz, canlı hücreleri belirli bir ligand için kemotaktik hücrelerinin kapasitesini belirlemek için benzer metodoloji uygulayabilirsiniz. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Fare kemik iliği 100 nM LTB 4 yönelik dendritik hücre göç türetilmiştir. Video 1 BMDCs doğru LTB 4 hücre göçü Live <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala and Boddulrui_Video1.AVI">videoyu görmek için buraya tıklayın</a> . B. Ölçüm GPCR (BLT1) ve Sitosolik Protein (β-arrestin) etkileşmeleri, Canlı Hücrelerde Translokasyon Bu prosedürün tamamlanmasının ardından, bir GPCR sinyalizasyon olaylar aşağıdaki bilgileri alabilirsiniz. <ol class="lroman"><li> GPCR ve sitozolik proteinler ve çekirdeğin lokalizasyonu (Şekil 2). </li><li> Ligand kaynaklı sitozolik protein (bu durumda β-arrestin) (Şekil 3) ile yüzey GPCR (bu durumda BLT1) etkileşimi. </li><li> Membran reseptör içselleştirilmesi ve β-arrestin translokasyon Kinetiği tarafından içselleştirilmesi reseptörleri (Şekil 4) (Jala&#39;dan ve ark 2005) 18 ile birlikte izledi. </li><li> Bir canlı hücrelerde ligand bağımlı reseptör aktivasyonu durumu (video 2 ekli) belirlemek ve reseptör aktivasyonu (Jala&#39;dan ve ark 2005) 18 dahil kritik motifler veya işlemlerin belirleyebilirsiniz. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 RBL-2H3 hücre içine BLT1-RFP (A), β-arrestin-GFP (B) pNuc-CFP (C) İfade. Renk kombine görüntü panel D&#39;de gösterilen <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 reseptör ligand ve β-arrestin kaynaklı translokasyon. Hücrelerde floresan yoğunlukları Hattı tarama gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4, 1 mcM LTB 4 eklenmesi üzerine reseptör içselleştirme ve β-arrestin translokasyon Kinetiği . Floresan yoğunlukları, hücre zarı ve sitozolik yerlerde zamanın bir fonksiyonu olarak ölçüldü. Video 2 1 mcM LTB 4 eklenmesi üzerine BLT1 RFP ve β-arrestin-GFP ifade hücreleri canlı görüntüleme <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala and Bodduluri_Video2.AVI">video izlemek için buraya tıklayın</a>

<ol>
	<li>Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors:+molecular+mechanisms+involved+in+receptor+activation+and+selectivity+of+G-protein+recognition.">G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition.</a> FASEB J. 11, 346-354 (1997).</li><li>Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+molecular+mechanisms+involved+in+activation+of+G+protein-coupled+receptors.">Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors.</a> Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li><li>Lefkowitz, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=protein-coupled+receptors.+III.+New+roles+for+receptor+kinases+and+beta-arrestins+in+receptor+signaling+and+desensitization.">protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization.</a> J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).</li><li>Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beta-arrestins+in+the+regulation+of+seven-membrane-spanning+receptor+trafficking+and+signalling.">Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling.</a> Biochem J. 375, 503-515 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-arrest	or.">Beta-arrest	or.</a> Nature. 383, 447-450 (1996).</li><li>Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+mediator+networks+in+cell+signaling:+update+and+impact+of+cytokines.">Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines.</a> Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).</li><li>Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLT1+and+BLT2:+the+leukotriene+B(4)+receptors.">BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors.</a> Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).</li><li>Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukotriene+B4+receptors.">Leukotriene B4 receptors.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69, 575-585 (2002).</li><li>Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+leukotriene+B(4)+receptor+in+mice+reveals+its+role+in+inflammation+and+platelet-activating+factor-induced+anaphylaxis.">Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis.</a> J Exp Med. 192, 433-438 (2000).</li><li>Subbarao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+leukotriene+B4+receptors+in+the+development+of+atherosclerosis:+potential+mechanisms.">Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).</li><li>Jala, V. R., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukotrienes+and+atherosclerosis:+new+roles+for+old+mediators.">Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators.</a> Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).</li><li>Heller, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+atherogenesis+in+BLT1-deficient+mice+reveals+a+role+for+LTB4+and+BLT1+in+smooth+muscle+cell+recruitment.">Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment.</a> Circulation. 112, 578-586 (2005).</li><li>Miyahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+leukotriene+B4+receptor+1+in+allergen-induced+airway+hyperresponsiveness.">Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).</li><li>Terawaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+leukotriene+B4+receptor+1+confers+resistance+to+airway+hyperresponsiveness+and+Th2-type+immune+responses.">Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses.</a> J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).</li><li>Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+leukotriene+B4+receptors+BLT1+and+BLT2:+a+critical+role+for+BLT1+in+collagen-induced+arthritis+in+mice.">Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice.</a> J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).</li><li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis.">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J Exp Med. 203, 829-835 (2006).</li><li>Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-independent+beta-arrestin+translocation+and+internalization+of+leukotriene+B4+receptors.">Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors.</a> J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).</li><li>Jala, V. R., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+in+live+cells.">Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells.</a> Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).</li><li>Del Prete, A., A, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dendritic+cell+migration+and+adaptive+immune+response+by+leukotriene+B4+receptors:+a+role+for+LTB4+in+up-regulation+of+CCR7+expression+and+function.">Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function.</a> Blood. 109, 626-631 (2007).</li><li>Salogni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+A+induces+dendritic+cell+migration+through+the+polarized+release+of+CXC+chemokine+ligands+12+and+14.">Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14.</a> Blood. 113, 5848-5856 (2009).</li><li>Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+myeloid+dendritic+cells+from+bone+marrow+precursors.">Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors.</a> J Vis Exp. , (2008).</li></ol>

Canlı hücre görüntüleme, gerçek-zamanlı olarak meydana olarak spesifik proteinlerin fonksiyonu ve etkileşimleri göstermek için güçlü bir araçtır. Bu yazıda anlatılan yöntemleri açıkça LTB 4 dendritik hücrelerin hızlı göç neden olduğunu göstermektedir. Bu yöntemler sadece LTB 4 fonksiyon çeşitli hücre tipleri yönlerini genişletin, benzer yöntemlerle diğer kemokinler çeşitli uygulanan ve farklı lökosit alt popülasyonları üzerinde kemotaktik ajanlar olarak et...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell lines:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CRL-2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Media:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Delbecco's modified Eagle&#x2019;s Medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11995</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol red free RPMI or DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11835-030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin (10000 U/mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES (1M)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Others:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>FD35-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>16552088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Instruments/software:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser II electroporater </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Universal Imaging</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vertical Micro-pipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-Forge M-900</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hadraulic Micromanipulator MO-188NE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coarse Manual Manipulator, MN-188NE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cDNA constructs:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jala et al 2005</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (&beta;-arrestin1-GFP in present study).</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jala et al 2005</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

real-time imaging of leukotriene b4 mediated cell migration and blt1 interactions with &beta;-arrestin

G-protein reseptörler (GPCRs) yedi transmembran protein ailesine ait olan ve hücre içi yanıtları ekstraselüler sinyallerin transdüksiyon arabuluculuk. GPCRs kontrolü gibi kemotaksis gibi çok çeşitli biyolojik fonksiyonları, hücre içi kalsiyum salınımını, ligand bağımlı bir şekilde heterotrimeric G-proteinleri 1-2 ile gen regülasyonu . Ligand bağlanması, siklik adenozin monofosfat (cAMP), inositol trifosfat (IP3) ve diacyl gliserol (DG) gibi ikinci haberciler düzeyleri modüle heterotrimeric G-proteinleri aktivasyonu önde gelen yapı değişiklikleri bir dizi neden olur. Reseptör ligand bağlama aktivasyonu ile eş zamanlı, aynı zamanda, duyarsızlaştırma, haciz ve / veya içselleştirilmesi yoluyla sinyalizasyon reseptör azaltmak için bir dizi etkinlik başlatır. GPCRs duyarsızlaştırma süreci, G-protein reseptör kinazlar (GRKs) ve β-arrestins 3 sonraki bağlanma reseptör fosforilasyon yoluyla oluşur . β-arrestins sitozolik proteinleri ve reseptör içselleştirilmesi 4-6 kolaylaştırarak var (çoğu durumda) fosforile reseptörlerine bağlanarak GPCR aktivasyon üzerine membran yerini değiştirmek. Ve LTB 4 reseptörü 2 (BLT2; düşük afinitesi reseptör; lökotrien B 4 (LTB 4), araşidonik asit yolağı ve aracılık eylemleri GPCRs, LTB 4 reseptörü 1 (afinitesi yüksek bir reseptörün BLT1) yoluyla elde edilen bir pro-inflamatuar lipid molekülünün . ) 7-9. LTB 4-BLT1 yolağı, astım, artrit ve ateroskleroz 10-17 dahil olmak üzere birçok iltihabi hastalıklar kritik olduğu gösterilmiştir . Geçerli kağıt LTB 4-kaynaklı lökosit göçü ve BLT1 etkileşimler ile β-arrestin ve mikroskopi görüntüleme teknikleri kullanılarak 18-19 canlı hücrelerde reseptör translokasyon izlemek için geliştirilen metodolojileri açıklanmaktadır. Kemik iliği elde edilen C57BL / 6 farelerinde dendritik hücreler izole edilmiş ve daha önce 20-21 açıklandığı gibi kültüre edildi. Bu hücreler, canlı hücre görüntüleme yöntemleri LTB 4 indüklenen hücre göçü göstermek için test edildi . Insan BLT1 yeşil floresan protein (β-dizi-GFP) ile etiketlenen C-terminalindeki ve β-arrestin1 kırmızı floresan proteini (BLT1 RFP) etiketli ve Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) hücre hatları her iki plazmid transfekte 18-19. Bu proteinler ve yerelleştirme arasındaki etkileşimin kinetiği canlı hücre video mikroskopi kullanılarak takip edildi. Geçerli kağıt metodolojileri, canlı hücrelerin G-protein reseptörler fonksiyonel yanıtları incelemektir mikroskobik teknikler kullandıklarını açıklarlar. Reseptör kinetiği ve sitozolik protein etkileşimleri belirlemek için floresan yoğunlukları ölçmek için de geçerli kağıt Metamorph yazılım kullanımını açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with Î²-arrestin at JoVE.com

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

Bu yazıda, özel ligandlar lökositlerin kemotaktik yanıt belirlemek ve hücre yüzey reseptörleri ve sitozolik proteinler canlı hücre görüntüleme teknikleri kullanarak arasındaki etkileşimleri tanımlamak için metodolojiyi tanımlamaktadır.

Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme 4 Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

real-time-imaging-leukotriene-b4-mediated-cell-migration-blt1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

12.7K Görüntüleme.  University of Louisville. Bu yazıda, özel ligandlar lökositlerin kemotaktik yanıt belirlemek ve hücre yüzey reseptörleri ve sitozolik proteinler canlı hücre görüntüleme teknikleri kullanarak arasındaki etkileşimleri tanımlamak için metodolojiyi tanımlamaktadır.

Video: Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &#946;-arrestin

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Kullanarak İzleme Dendritik Hücre Göç<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Manyetik Rezonans Görüntüleme

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Miyeloid hücrelerin Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme<em&gt; Süm<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Bağırsak Tümörleri Disk Eşodaklı Mikroskopi Spinning tarafından

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanarak Konak Dışında Influenza Virüsünün Hayatta Kalmasını İzleme

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

Meningitik Escherichia Coli ile Enfekte Olan Nötrofillerde Reaktif Oksijen Türlerinin Gerçek Zamanlı Nicelemesi

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...