Biz Maegan B. Colehour biyoreaktör gelişimi ile yardım için teşekkür ederim. Bu çalışmalar Yale Üniversitesi Anestezi ve NIH hibe HL 098.220 (LEN) tarafından finanse edilmiştir. THP, Ulusal Sağlık Enstitüsü, T32 GM007171 tarafından desteklenen oldu.

1. Biyoreaktör Meclisi Ayrıntılı biyoreaktör tasarım ve montaj decellularization ve kültür için rakam (lar), sırasıyla Şekil 1 ve 2&#39;de verilmektedir. Tüm bileşenleri biyoreaktör montajı önce sterilize edilmelidir. Aşağıdaki hususlara dikkat edilir: BAĞLANTILARI: <ol><li> Arteryel kanül tüp kısa bir segment bir Y-splitter bağlı bir Luer-lock uydurma oluşur. Luer-lock konnektör perfüzyon tüp takılı ve pulmoner arter sütüre değildir Y segment bir tek yönlü valf bağlı. Tek yönlü valf, sıvı (ters yönde perfüzyon olarak) boru içine çekilebilir odaklı, ancak organ perfüzyon sırasında bütün orta akciğer akar. </li><li> Trakeal kanül, boru ile Y-splitter bağlantılı bir Luer-lock konnektör oluşur. Luer-lock, trakea rezervuar ve ana oda arasında bir nefes döngü bağlanır. Trakea sütüre Y-konnektör bölümü de tek yönlü bir valf bağlanmaktadır. Tek yönlü valf arteryel kanül olarak aynı şekilde aydınlatmaktadır. </li></ol> FONKSİYONLARI: <ol start="3"><li> Arteriyel ve trakeal kanül tek yönlü valfler, tüp ters akış sağlayan ve bu nedenle hava boşlukları giderilmelidir izin tüpün içinde hava kabarcıkları temizlemek için kullanılmaktadır. </li><li> &quot;Nefes döngü&quot; gibi orta akciğer içine ve dışına farklı bir yol izler yerleştirilmiş iki adet tek yönlü valfler, içerir. Bu özelliğin daha ayrıntılı bir açıklama laboratuvar 2 yayınlanmadan önce sağlanmaktadır. </li><li> Vasküler perfüzyon bir roller pompa kullanılarak sağlanır. Orta bağlı kanül aracılığı ile pulmoner arter içine perfüze, akciğer vasküler ve orta perfüzyon için hazırlanan ana biyoreaktör, doğrudan pulmoner ven dışarı akar. </li></ol> 2. Organ Harvest <ol><li> Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği (60 mg / kg IP) tarafından belirlenen kurallarına göre, yetişkin (3-6 aylık) Fischer 344 sodyum pentobarbital aşırı dozda sıçanlarda Euthanize. Not: pentobarbital çözüm antikoagülasyon için 100 ünite / ml heparin içerir. </li><li> Sprey veya% 70 etanol ile göğüs ve karın silin. </li><li> Kalp ve akciğerler açığa akciğerlere zarar vermemeye özen, göğüs boşluğu açın. Akciğerlerde geri çekmek için neden, göğüs boşluğuna dikkatlice diyafram üzerinden küçük bir pencere yapmak, ve ardından akciğer temelleri açığa çıkarmak için yatay kesi genişletmek. Dikey kaburga üzerinden iki insizyon olun ve göğüs kafesi, kalp ve akciğerler maruz için geri çekmek. </li><li> Yani, gravite perfüzyon sistemi kaldırıldı piston ile bir şırınga, bir 3-yollu stopcock ve 1.5inch, 21-gauge iğne ile boru ~ 20cm kullanarak hazırlayın. ~ 20 cm yukarıda bir halka standı kullanarak hayvan şırınga koruyun. Tüm hava perfüzyon tüp çıkarılır emin olun. </li><li> Akciğerlere dönmesini engelleyerek, kan akıtmak için sağ atrium kesin. Akciğerlere kan ve perfüzat kolay drenaj izin vermek için sol atrium Kesme da yararlı olabilir, ancak gerekli değildir. </li><li> Iğne sağ ventrikül tabanına yerleştirin ve PBS içinde heparin ve sodyum nitroprussid (50U/ml ve 1ug/ml, sırasıyla) bir çözüm ile akciğerlere serpmek için stopcock açık. Onaylayın, pulmoner arter perfüzyon sıvı ile doldurur ve bu kan akciğerlerden temizleyerek. Gerekirse, dolum ek sıvı ile perfüzyon şırınga. Genelde sadece ~ 10ml gereklidir. </li><li> Devam perfüzyon akciğerlere kan açıktır kadar, daha sonra perfüzyon durdurun. </li><li> Mümkün olduğunca boynuna, trakea ücretsiz teşrih. Emin olun trakea, yemek borusu ayrılır. Kalp, akciğer ve trakea kalan tüm bağlantıları teşrih ve en blok kaldırmak. </li><li> Bir neşter ya da keskin bir makas kullanarak, sağ ve sol ventriküller açığa kalbin apeks kesti. </li><li> Sağ ventrikül ve sütür ile pulmoner gövde Cannulate. Herhangi bir aşırı sol ventrikül doku çıkarın. </li><li> Trakea ve sütür Cannulate. Hem trakeal ve pulmoner arter kanüller trakea, akciğerler, ya da büyük damarların (Şekil 1) üzerinde herhangi bir burulma gerilmesi olduğu gibi iyi konumlanmış olduğundan emin olun. </li><li> Organ aracılığıyla sabit akış sistemi hava kabarcığı önleyebilir, arteryel kanül hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Bazı durumlarda, bir hava kabarcığı tamamen sıvı flow.To gerçekleştirmek durdurmak, kalp / akciğer bloğun PBS içeren bir kavanoza koyun. Kabarcıkları dışarı atmak için küçük bir miktar PBS kalp kanül içine enjekte etmek için iğne ile bir şırınga kullanın. </li><li> Akciğer mümkün olduğunca çok havayı çıkarmak için, PBS 4-5 kere solunum yolları Lavaj. </li><li> Lavaj adım sonras tam 1ug/ml PBS içeren sodyum nitroprussid (SNP) ile akciğer şişirmek. Trakeal kanül bir stoper koyun, çözüm akciğer kalır. Aynı çözüm pulmoner arter yoluyla damar akar gibi akciğer vazodilatasyon izin, 30 dakika inkübe için izin verin. </li><li> Y-şekilli kanüller, yukarıdaki &quot;Biyoreaktör Meclisi&quot; açıklanan bağlı Luer-lock bağlantıları kullanarak biyoreaktör kap kalp / akciğer bağlayın. (Şekil 1). </li></ol> 3. Organ Decellularization <ol><li> Decellularization aparatı kap (akciğerler bağlı) (Şekil 1) bağlayın. Pulmoner arter kanülü perfüzyon hattına bağlanması gerekir ve trakeal kanül halka açık olmalıdır. Tüm satırları, hava açık olduğundan emin olun. Yukarıda açıklandığı gibi, hava hatları decllularization sıvı akışını engelleyerek kötü decellularization bir kaynak olabilir. Sistemi içinde sıkışan havayı, aynı zamanda, hücre sağkalım 3 üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabileceği durumlarda, kültür zaman devam edebilir. </li><li> PBS / SNP ile akciğer akciğerlerin aşırı şişirilmiş dolu, ancak kadar şişirin. Trakeal kanül hemen akciğer şişirilmiş kalacak şekilde kap. </li><li> ~ 15 mmHg (20cm H 2 O basınç) en az 15 dakika süreyle PBS / SNP ile akciğer serpmek. 15 dakika veya daha uzun süre sonra, akciğer deflate izin trakeal kanül stoper çıkarın. </li><li> 30 dakika PBS / SNP ile perfüzyon devam edin. Gerekirse, dolum PBS / SNP perfüzyon basıncı 10-15 mmHg korunmasını sağlamak için. </li><li> Perfüzyon decellularization solüsyonu (8mm ahbap, 1M NaCl, 1X PBS içinde 25mm EDTA) ile başlayın. Tüm satırları, hava açık olduğundan emin olmak için özen gösterin. Bir vakum sistemi, emiş sağlamak için yararlı olabilir. </li></ol> Kadar çözüm 500ml akciğer yoluyla perfüze decellularization çözüm serpmek. Optimal basıncı &lt;15 mmHg (~ 20 cm H 2 O). Bu genellikle 2,5 saat gerekecektir. Akış hızları, başlangıçta genellikle çok yavaş (0.2-0.5ml/minute), ve hızlı bir şekilde ikinci saat boyunca yaklaşık 1ml/minute veya daha fazla artması. Periyodik olarak, yeterli sıvı sağlanması, biyoreaktör kullanılan decellularization sıvı kaldırmak, akciğer ve trakeal kanül destek beklemektedir. 4. Organ durulama ve sterilizasyon <ol><li> Akciğer ve doku kültürü kaputu biyoreaktör aktarın. Decellularization sıvı içeren 500ml kavanoz kaldırma ve 1L kadar steril PBS içeren steril bir kavanoz ile değiştirerek steril PBS ile durulama başlayın. Vakum emiş hatları hava açık olduğundan emin olmak için kullanın. </li><li> 10-15 mmHg damar yoluyla serpmek PBS, decellularization için de aynı şekilde. Periyodik olarak, biyoreaktör atık PBS kaldırmak ve temiz, steril PBS ile PBS kavanoz yerine ve / veya dolum. Steril tekniğinin kullanılması tavsiye edilir. </li><li> En az 2,5 L steril PBS akciğer perfüze kadar Yıkamaya devam edin. </li><li> Taze PBS içeren bir yeni, steril bir biyoreaktör sistemi akciğer aktarın. Tüm perfüzyon loop ve tüm hava yolu hatları sıvı ile dolu olduğundan emin olun. Tüm sonraki adımları 5ml/min akciğerler serpmek için pulsatil pompa kullanabilirsiniz. </li><li> PBS içinde% 0.1 perasetik asit ile PBS +% 10 FBS +% 10 kalem strep çözüm ya da bir gecede 3 saat perfüzyon yoluyla, iskele sterilize edin. Ikincisi artık asit kaldırmak için, birkaç saat içinde 250 ml PBS 3 değişiklikleri ile akciğer durulama gerektirir. Her durulama için, akciğer dokusunun tüm parçaları iyice durulanır olduğundan emin olmak için hem de perfüze havalandırmalı olmalıdır. </li><li> Sıcaklığı Benzonase tedavi için hazırlık dengelenmiş kadar% 10 FBS ve% 10 penisilin / ~ 1hr streptomisin veya PBS ile 37 ° C inkübatör ve serpmek için akciğer aktarın. </li><li> Kalıntı DNA kaldırmak Benzonase akciğer davranın: <ol><li> 37 ° C&#39;ye kadar Benzonase tampon Sıcak (Reaktifler Tablo bakınız) </li><li> Her bir akciğer için tampon 90U/ml Benzonase Benzonase sadece tampon ve bir 10 ml şırınga ile bir 10ml şırınga doldurun. </li><li> Akciğer perfüzyon durdurun. </li><li> Benzonase tamponu ile havayolu şişirin. </li><li> Akciğer deflate izin ver (yaklaşık 1 dakika boyunca). Sonra, akciğer Benzonase çözümü ile şişirmek. Benzonase tampon ve Benzonase enflasyon sırasında, herhangi bir hava akciğer içine enjekte önlemek için deneyin. </li><li> Akciğer Benzonase ile şişirme sonra 1 saat süreyle 37 ° C&#39;de perfüzyon veya havalandırma olmadan oturmak için izin verin. </li></ol></li><li> PBS +% 10 FBS, biyoreaktör zaten% 10 penisilin / streptomisin ve gece boyunca devam perfüzyon Özgeçmiş. Ertesi gün, akciğer ya 4 saklanabilir ° C (3 ay) veya hücre tohumlama için hazırlanmıştır. </li><li> Hücresel repopulation iskele hazırlamak için, PBS / FBS / kültür ortamı ~ 250ml Benzonase çözüm değiştirin. Hücreleri tanıtıldı önce en az bir saat için serpmek,nd doğrudan ekim hücreleri önce taze kültür ortamı değiştirin. </li></ol> 5. Recellularization Organ yeniden tohumlama için hücre kaynağının seçimi, bireysel araştırmacılara bırakılmıştır. Piyasada bulunan nüfus, taze izole yenidoğan veya fetal akciğer hücreleri, embriyonik kök hücreler, ya da piyasada bulunan hücre kaynakları da dahil olmak üzere, birçok hücre kaynakları kullanılabilir. Bu hücre popülasyonları için özel izolasyon protokolleri, başka bir yerde 4,5,6 bulunabilir . Burada, biz nasıl tohum hem endotel ve epitel hücre popülasyonlarının talimatlar sağlar. Endotel tohumlama: <ol><li> Uygun bir kültür ortamı, arzu edilen endotel hücre nüfusun bir süspansiyon hazırlayın. Hücre kümeleri kaldırmak için bir 40um hücre süzgecinden süzülür hücre süspansiyonu. Laboratuvarımızda tipik bir endotel tohumlama kültür ortamı 60ml içinde yaklaşık 30 milyon sıçan akciğer mikrovasküler endotel hücreleri kullanmak istiyorsunuz. </li><li> Hücre süspansiyonu geçici biyoreaktör (Şekil 2) perfüzyon döngüsü içine küçük bir rezervuar içine koyun. Bu rezervuar ve tüm perfüzyon döngüsü tüp hava kabarcıkları açık olduğundan emin olun. </li><li> Bir silindir pompa kullanılarak 3ml/min pulmoner arter içine hücreleri infüze. </li><li> Hücre infüzyonu sonra, istenilen hızda ana biyoreaktör sirküle orta perfüzyon devam etmektedir. </li><li> Günlük olarak, perfüzyon tüp hava kabarcıkları açık olduğundan emin olun. </li><li> Orta taze orta ile düzenli olarak değiştirilmesi gerektiğini, bu genellikle 3-4 günde yapılır. </li></ol> Epitel tohumlama: <ol><li> Istenilen epitel hücre popülasyonunun bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Laboratuvarımızda, bu genellikle yaklaşık 50-100 milyon yenidoğan sıçan akciğer hücreleri oluşur. 40um hücre süzgecinden nüfus Filtre ve bir şırınga kültür ortamı 15ml askıya. Kültür ortamı 80ml ile hava yolu rezervuar doldurun. </li><li> 37 ° C doku kültürü inkübatör biyoreaktör yerleştirin ve havalandırma için şırınga pompası bağlamak. Tüm havalandırma hatları, hava açık olduğundan emin olun. <ol><li> Hücre süspansiyonu 15ml trakeal kanül içine tek bir bolus olarak enjekte edilerek akciğer Tohum hücreleri. </li><li> Hemen şırınga pompası kullanan bir tek, yavaş nefes başlar. Bu nefes, bu nedenle yaklaşık 20 dakika süren 3ml/minute ana biyoreaktör hava 60ml çekilme tarafından yönetilmektedir. Ana biyoreaktör hava filtreleri hücre süspansiyonu enjekte hemen sonra ve yavaş nefes başlamadan önce kapatılmış olun. </li></ol></li><li> Akciğerler daha sonra yavaş vasküler perfüzyon başlamak (yaklaşık 0.5 ml / dak) yaklaşık 18hrs statik oturup, ve izin verin. </li></ol> 6. Organ Kültür Perfüzyon ve havalandırma detayları, deneysel tasarım dayalı çeşitlilik göstermekle birlikte, aşağıdaki noktalara dikkat: <ol><li> Endotel kültür sırasında, perfüzyon genellikle 1-3 ml / dk bir roller pompa kullanılarak yapılır. Epitel kültürü sırasında, havalandırma genellikle sürekli bir hızda dakikada bir şırınga pompası ile 1 nefes verilir. Ana biyoreaktör hava 5-10ml Çekilmesi genellikle, normal bir gelgit hacmi akciğer ventilasyonu etkisi gereklidir. Ventilasyon sırasında biyoreaktör hava geçirmeyen korumak için ihtiyaç nedeniyle, havalandırma günlük duraklatılmış olmalıdır ve ana odasında hava değişimi yapılmalıdır. Sistemdeki tüm hava kısmi basıncı yaklaşık% 21 oksijen oda havası. Biyoreaktör (akciğer sıvı 5-10ml ilham indükler) hava 5-10ml çekilme akciğer boyutuna dayanır ve kaç loblar kültürlü (iken loblar, analiz için bağlanır. kalan loblar) kültür devam ediyor. Şırınga pompası tarafından çekilen hava miktarı tahmin kültürlü akciğer &quot;gelgit hacmi&quot; seçilir. </li><li> Orta 3-4 gün boyunca her kültür yaklaşık değiştirilmesi gerekir. </li><li> Epitel ve endotel, laboratuvar tipik ilk tohum mühendislik doku havalandırılan hangi süre içinde 4-8 gün, epitel deneyleri hem de co-kültür sırasında. Endotel sonra doku hem de perfüze ve havalandırmalı, bundan sonra, perfüzyon yoluyla numaralı seribaşı. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Decellularization Protokolü doğru yapıldığında, taze çıkarılan akciğerlerin sızıntı hava tutmak gerekir. Pompalarında hava ile şişirme kontrol edebilirsiniz - hava kaçağı belirten varsa kabarcıkları olmamalıdır. (37 ° C ve PBS sonuçta akciğerler yoluyla yaklaşık 10 ml / dk akış gerekir - 3 saat sonraki decellularization 2.5 boyunca akciğerler yoluyla decellularization sıvı akışı ~ 500ml izin vermelidir~ altında durulama sonunda hidrostatik basınç 15 mm Hg). % 0.1 perasetik asit ve Benzonase ile tedaviden sonra, akciğerler 4 ° C &#39;de 3 ay kadar saklanabilir, ve hala recellularization için uygun kalır. Son decellularized ekstraselüler matriks hücresel malzemeler tamamen yoksun olması ve yerli akciğer, brüt, mikroskopik ve ultrastrüktürel özellikleri korumak gerekir. Yetersiz decellularization veya durulama kalıntı DNA (karşılaştırma için bkz: Şekil 3), leke standart hematoksilen ve eosin ile görüntülendi olabilir iskele, &quot;yapıştırma&quot; neden olabilir. Asellüler matriks ve akciğer doku kültürü, Repopulation Hücreler taze Petersen ve arkadaşları 4 çalışma eşlik çevrimiçi ekte açıklanan 7 gün eski yenidoğan sıçan yavrular, izole edilir, birini (10 yavruların yavruların ortalama 120-150 milyon hücrelerinin bir hücre verim bekleyebiliriz biraz üzerinde 10 milyon yenidoğan başına hücre). Biyoreaktör akciğer hücre ekim ve sonraki kültür için en uygun koşulları iyi dağıtılmış hücrelerin akciğer 5 loblar içinde verim ve ekstrasellüler matriks iskele (Şekil 3) yaklaşık% 70 kapsama sağlamak gerekir. Kültürlü hücre popülasyonunun göreceli bolluk sırasına göre pro-salgı protein-C (SPC), Clara hücre salgı protein (CCSP) ve aquaporin-5 (AQP), (Şekil 4) gibi önemli solunum hücre belirteçleri için pozitif olacaktır. <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Şırıngalar pozisyonları ve decellularization biyoreaktör <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Biyoreaktör tohumlama mühendislik akciğer dokusunun ve kültür için kullanılan <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 yerli, decellularized Histoloji ve depolanmışsa akciğer <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 önemli akciğer belirteçler için immünofloresan boyaması

<ol>
	<li>American Lung Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lung Disease Data. , (2008).</li><li>Petersen, T. H., Calle, E. A., Colehour, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+for+the+Long+Term+Culture+of+Lung+Tissue.">Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue.</a> Cell Transplant. , (2010).</li><li>Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+surface+tension+induced+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening.">Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).</li><li>Petersen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineerined+Lungs+for+in+Vivo+Implantation.">Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329, 538-5341 (2010).</li><li>Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat Med. 16, 927-9233 (2010).</li><li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation.">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (2010).</li><li>Sugihara, H., Toda, S., Miyabara, S., Fujiuyama, C., Yonemitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+alveolus-like+structure+from+alveolar+type+II+epithelial+cells+in+three-dimensional+collagen+gel+matrix+culture.">Reconstruction of alveolus-like structure from alveolar type II epithelial cells in three-dimensional collagen gel matrix culture.</a> Am J Pathol. 142, 783-7892 (1993).</li><li>Choe, M. M., Sporn, P. H., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+by+dynamic+strain+in+a+three-dimensional+tissue-engineered+human+airway+wall+model.">Extracellular matrix remodeling by dynamic strain in a three-dimensional tissue-engineered human airway wall model.</a> American Journal Respiratory Cell Molecular Biology. 35, 306-306 (2006).</li><li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-enginered+lung:+an+in+vivo+and+in+vitro+comparison+of+polyglycolic+acid+and+pluronic+F-127+hydrogel/somatic+lung+progenitor+cell+constructs+to+support+tissue+growth.">Tissue-enginered lung: an in vivo and in vitro comparison of polyglycolic acid and pluronic F-127 hydrogel/somatic lung progenitor cell constructs to support tissue growth.</a> Tissue Engineering. 12, 1213-1213 (2006).</li><li>Price, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Decellularized+Lung+Bioreactor+System+for+Bioengineering+the+Lung:+The+Matrix+Reloaded.">Development of a Decellularized Lung Bioreactor System for Bioengineering the Lung: The Matrix Reloaded.</a> Tissue Eng Part A. , (2010).</li><li>Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. 16, 814-820 (2010).</li><li>Shannon, J. M., Mason, R. J., Jennings, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+alveolar+type+II+epithelial+cells+in+vitro:+effects+of+cell+shape,+cell-matrix+interactions+and+cell-cell+interactions.">Functional differentiation of alveolar type II epithelial cells in vitro: effects of cell shape, cell-matrix interactions and cell-cell interactions.</a> Biochim. Biophys. Acta. 931, 143-156 (1987).</li><li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Acellular+Natural+Lung+Matrix+on+Murine+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation+and+Tissue+Formation.">Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation.</a> Tissue Eng Part A. , (2010).</li></ol>

LEN Humacyte, rejeneratif tıp şirket hisse senedi tutar. Humacyte bu çalışmaların finanse etmedi, ve açıklanan deneyler veya yöntemlerden herhangi birinin tasarım, yorumlama ve raporlama etkilemez. Yazarlar (LEN, THP, EAC) ve Yale Üniversitesi, akciğerlerde doku mühendisliği ile ilgili bir patent başvurusunda var.

Sistemin en kritik yönlerini burada kısırlık bakım ve vasküler yatağın iskele ve kültür depolanmışsa akciğer hazırlanması ve ekim süreci boyunca uygulanan baskıların yakından izlenmesi sundu. Sterilite kullanmadan önce tüm malzemeleri otoklav ve kapalı bir sistem, kısa bir süre eksplant sonra akciğer montaj ve bu bariyer sonraki ihlalinden kaçınarak en iyi korunur. Decellularized matris iyice durulanır ve steril bir kültür biyoreaktör transfer sonra, silikon kapağı ve diğer mühürler ve bağlantıları rahatsız veya kaldırılabilir olmamalıdır. Mümkün basınçları kontrol altında tutmak için, yerçekimi tarafından tahrik akış tercih edilir. PBS ve devam eden kültür sırasında ile iyice durulandıktan sonra başlayan, bir pompa sıvı devridaim için gerekli olduğunda, doğrudan dalmadan hemen önce sıvı basınç dönüştürücü ile pulmoner arter basıncı ölçüm tavsiye ederiz. Uygulanan basıncın büyüklüğü 15 mm Hg geçmemelidir. Recellularized akciğerler genellikle 4 günden 3 haftaya kadar değişen zaman dilimlerinde, değişik kültür olabilir. Havalandırma genellikle epitel kültürü sırasında 1 nefes / dakika hızında uygulandığında ise vasküler perfüzyon genellikle 1-3 ml / dk endotel kültür sırasında gerçekleştirilir. Kombine kültür dönemlerinde, simultane ventilasyon ve perfüzyon uygundur. Havalandırma sıvı orta veya hava ile yapılabilir. Son birkaç on yıl boyunca, çeşitli gruplar, akciğer epitel ayırt in vitro ve fizibilite kopyalayan akciğer mikroanatomisinin 7,8,9, 10 çeşitli yönlerini gösteren önemli doku mühendisliği çalışmaları yaptık . Ancak, yakın zamana kadar, akciğer dokusunda mühendisi bu girişimleri 4,5 hiçbiri implante organ, kan ve hava yolu arasındaki mesafeyi korumak için ve gaz alışverişinde de katılabileceği bir yol açtı . Bu nedenle, açıklanan yöntemlerden sadece fonksiyonel akciğer dokusu üretme uzun vadeli bir hedefe doğru bir ilk adım olmasına rağmen, bu işi nakli için kullanılabilir akciğer dokusunun miktarını artırarak olasılığı yönünde cesaret verici bir adımdır. Ayrıca, doku mühendisliği karmaşık üç boyutlu yapılar için bir iskele olarak bu işi bir decellularized ekstrasellüler matriks etkinliğini gösteren ve çeşitli türde hücrelerin büyüme ve hayatta kalma destekleyen, Ott ve ark. Uygun ve arkadaşları 11,12 tarafından yapılan çalışma ayrıntılarına . Bu çalışma solunum hücre ve moleküler biyologlar armamentarium katkısı da önemlidir. Kültür kemirgen epitel, daha geleneksel yöntemleri 13 ile laboratuvar, bilim adamlarının ne zaman biriyle karşılaşabilirsiniz de uygun, mekanik uyaranlar sağlayabilir ve bu hızlı de-farklılaşma görevlisi tehlike paylaşmak değildir eşsiz, üç boyutlu bir ortam sağlayarak sistemi, hücre farklılaşması ve fonksiyon bir rol oynayan hücre-hücre ve hücre-matriks etkileşimleri yeni bir fikir edinmek için. Bu bilgi Cortiella grubu ilk çalışmalar 14 gösterdiği gibi, çeşitli kök hücre popülasyonlarının kaderi kılavuzu koz olarak kullanılması halinde, özellikle güçlü olabilir .

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Ötenazi </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum nitroprussid </td><td> Fluka </td><td> 71778 </td><td></td></tr><tr><td> Euthasol ötenazi çözümü </td><td> Virbac AH </td><td> 710101 </td><td> 390 mg / ml pentobarbital sodyum stok solüsyonu IP yönetimi için uygun seyreltilmelidir </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell Çözüm </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chaps </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> AB01915 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Biyoreaktör Bileşenleri </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 480 ml kavanoz </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-3460560 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon stoper, boyut 14 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.298-26 </td><td></td></tr><tr><td> Y-konnektör </td><td> Cole Parmer </td><td> ED-30.614-08 </td><td> Arter ve trakeal kanül için kullanılır. </td></tr><tr><td> Silikon tüp </td><td> Masterflex </td><td> 96.420-14; 16 </td><td> L / S 14; 16 </td></tr><tr><td> Basınç Sensörleri </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX-212 </td><td></td></tr><tr><td> Emniyet valfi </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-98.553-20 </td><td> Tek yollu vana </td></tr><tr><td> 4-yol stopcocks </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 594WSC </td><td></td></tr><tr><td> Şırınga filtre </td><td> Cole Parmer </td><td> 2915-08 </td><td> PTFE, 0.2μm </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell ve durulama aparatları (biyoreaktör için eklemeler) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ve 1000 ml&#39;lik cam şişelerde </td><td> Corning </td><td> 1395-500-1L </td><td> Decell için el ve yerçekimi ile durulama </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Benzonase Tedavi </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> AB14043 </td><td> 1M, pH 8.0 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> JT Baker </td><td> 2444-01 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase Nükleazlar </td><td> Sigma </td><td> E1014 </td><td> Endonuclease matris kalıntı DNA kaldırmak için kullanılan </td></tr></tbody></table>

procedure for lung engineering

Akciğer dokusu, akciğer kanseri ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi kronik akciğer hastalıkları, yılda yaklaşık 280.000 ölüm kümülatif hesabı da dahil olmak üzere, kronik obstrüktif akciğer hastalığı, şu anda Amerika Birleşik Devletleri 1 dördüncü ölüm önde gelen nedenidir. Bu ölüm katkıda bulunmak, akciğerler genellikle tamir veya mikroskobik, hücresel düzeyde ötesinde yeniden bu bir gerçektir. Bu nedenle, akciğer dokusunda dejenerasyon ya da enfeksiyon veya cerrahi olarak rezeke edilen akciğer dokusunda hasara işlevsel in vivo olarak değiştirilir. Akciğer dokusunda in vitro oluşturulan olup olmadığını keşfetmek için, biz acellular akciğer ekstrasellüler matriks iskele üretmek üzere hücresel bileşenleri kaldırır bir prosedür kullanılarak yetişkin sıçanların akciğerleri tedavi. Bu iskele, hava yolları ve damarsal hiyerarşik dallanma yapıları, yanı sıra büyük ölçüde sağlam bodrum membran, kollajen IV, laminin ve fibronektin oluşan bir tutar. Iskele gibi negatif basınçlı ventilasyon ve pulsatil vasküler perfüzyon akciğer fizyolojisi eleştirel yönlerini taklit etmek için tasarlanmış bir biyoreaktör monte edilir. Kültür pulmoner epitel ve biyoreaktör monte iskele içinde vasküler endotel, biz yerel akciğer dokusunda fenotipik karşılaştırılabilir ve bu kısa zaman aralıklarında (45-120 dakika) için gaz değişimi katılmak mümkün akciğer dokusu oluşturmak mümkün. Bu sonuçlar cesaret ve akciğer matris bu repopulation akciğer rejenerasyonu için uygun bir strateji olduğunu düşündürmektedir. Bu olasılık, sadece nakli için akciğer dokusunun arzının artırılması yönünde çalışmak için değil, aynı zamanda daha uzun süreler için ve daha önce mümkün olduğundan daha daha doğru bir mikro-çevre içindeki solunum in vitro hücre ve moleküler biyoloji okumak için bir fırsat sunuyor.

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Lung Engineering at JoVE.com

Procedure for Lung Engineering

Biz bir decellularized akciğer ekstraselüler matriks ve fonksiyonel akciğer dokusu oluşturmak için kullanılan olabilir romanı biomimetic biyoreaktör geliştirdik. Biyoreaktör matris ve kültür hücreleri ekim, kısa bir süre için in vivo olarak nakledilen zaman etkili gaz değişimi gösteren doku oluşturur.

Akciğer Mühendisliği Prosedürü

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

46.5K Görüntüleme.  Yale University. Biz bir decellularized akciğer ekstraselüler matriks ve fonksiyonel akciğer dokusu oluşturmak için kullanılan olabilir romanı biomimetic biyoreaktör geliştirdik. Biyoreaktör matris ve kültür hücreleri ekim, kısa bir süre için in vivo olarak nakledilen zaman etkili gaz değişimi gösteren doku oluşturur.

Video: Procedure for Lung Engineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

Elastomerik PGS Arter Doku Mühendisliği Yapı iskeleleri

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Biyomühendislik

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Doku Mühendisliği için elektrospinning Liflerin Postprodüksiyon İşleme

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kardiyak Doku Mühendisliği kılcal Kuvvetleri Litografi

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Biyomedikal Mühendisliği için keratin bazlı nanofiber sentezi

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Doku mühendisliği uygulamaları için bitki dokuların Decellularization için iki yöntem

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Perfkullanılmış Mammalin kalpleri transmural absorbance spektroskopisi kullanarak hücresel metabolizmayı Izleme için kalp içi yan ateş ışık kateter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex vivo. Recently developed organoid models have facilitated the expansion and study of lung epithelial progenitors in vitro, but these platforms typically rely on mouse tumor-derived matrix and/or serum, and incorporate just one or two cellular lineages. Here, we describe a protocol for generating engineered lung tissues (ELTs) based on the multi-lineage recellularization of decellularized precision-cut lung slices (PCLS). ELTs contain alveolar-like structures comprising alveolar epithelium, mesenchyme, and endothelium, within an extracellular matrix (ECM) substrate closely resembling that of native lung. To generate the tissues, rat lungs are inflated with agarose, sliced into 450 &#181;m-thick slices, cut into strips, and decellularized. The resulting acellular ECM scaffolds are then reseeded with primary endothelial cells, fibroblasts, and alveolar epithelial type 2 cells (AEC2s). AEC2s can be maintained in ELT culture for at least 7 days with a serum-free, chemically-defined growth medium. Throughout the tissue preparation and culture process, the slices are clipped into a cassette system that facilitates handling and standardized cell seeding of multiple ELTs in parallel. These ELTs represent an organotypic culture platform that should facilitate investigations of cell-cell and cell-matrix interactions within the alveolus as well as biochemical signals regulating AEC2s and their niche.

This protocol describes a method to generate reproducible, small-scale engineered lung tissues, by repopulating decellularized precision-cut lung slices with alveolar epithelial type 2 cells, fibroblasts, and endothelial cells.

Desellülerize Akciğer Dilimlerinden Hazırlanan Mühendislik Akciğer Dokuları

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Sığır Akciğeri ECM Hidrojelleri için Decellularizasyon Tekniklerinin Karşılaştırmalı Çalışması

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural environment in vitro. However, maintaining the native biochemical content of the ECM, achieving mechanical stability, and comprehending the impact of the decellularization process on the mechanical properties of the ECM hydrogels are challenging. Here, a pipeline for decellularization of bovine lung tissue using two different protocols, downstream characterization of the effectiveness of decellularization, fabrication of reconstituted decellularized lung ECM hydrogels and assessment of their mechanical and cytocompatibility properties were described. Decellularization of the bovine lung was pursued using a physical (freeze-thaw cycles) or chemical (detergent-based) method. Hematoxylin and Eosin staining was performed to validate the decellularization and retention of major ECM components. For the evaluation of residual collagen and sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content within the decellularized samples, Sirius red and Alcian blue staining techniques were employed, respectively. Mechanical properties of the decellularized lung ECM hydrogels were characterized by oscillatory rheology. The results suggest that decellularized bovine lung hydrogels can provide a reliable organotypic<span style="font-size: 11pt; font-family: Calibri, sans-serif; color: black; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">&#160;alternative to commercial ECM products by retaining most native ECM components. Furthermore, these findings reveal that the decellularization method of choice significantly affects gelation kinetics as well as the stiffness and viscoelastic properties of resulting hydrogels.

Yazar Spotlight: Organotipik Hidrojeller için Sığır Akciğeri Decellularizasyonunu Optimize Etme

The protocol elucidates two distinct decellularization methodologies applied to native bovine pulmonary tissues, providing a comprehensive account of their respective characterizations.

Dehücreli Akciğer Ekstraselüler Matriks Hidrojellerinin Geliştirilmesi ve Karakterizasyonu

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...