Ringraziamo Maegan B. Colehour per facilitare lo sviluppo di bioreattori. Questi studi sono stati finanziati dalla Yale University Dipartimento di Anestesia e dal NIH concedere HL 098220 (per LEN). THP è stato sostenuto da NIH T32 GM007171.

1. Bioreattore Assemblea Figura dettagliate (s) del bioreattore progettazione e montaggio sia per decellularization e la cultura sono forniti nelle figure 1 e 2, rispettivamente. Tutti i componenti devono essere sterilizzati prima del montaggio del bioreattore. I seguenti punti specifici sono indicati: COLLEGAMENTI: <ol><li> La cannula arteriosa è costituito da un raccordo luer-lock collegato ad un Y-splitter da un breve segmento di tubo. Il connettore luer-lock è collegato al tubo di perfusione, e il segmento del cromosoma Y che non è suturato l&#39;arteria polmonare è collegato a una valvola unidirezionale. La valvola unidirezionale è orientato in modo che il liquido può essere redatto nel tubo (nella direzione opposta di perfusione), ma durante la perfusione degli organi tutti fluido scorre nei polmoni. </li><li> La cannula tracheale è composto anche di un connettore luer-lock collegato a un Y-splitter con tubi. Il luer-lock si connette a un circuito respiratorio tra il serbatoio trachea e la camera principale. Il segmento del connettore a Y che non è suturato alla trachea è anche collegato ad una valvola unidirezionale. La valvola unidirezionale è orientata nello stesso modo come la cannula arteriosa. </li></ol> FUNZIONI: <ol start="3"><li> Il senso unico valvole nella cannule arteriose e tracheale sono utilizzati per eliminare le bolle d&#39;aria nel tubo, consentendo l&#39;inversione del flusso nei tubi e quindi permettendo bolle d&#39;aria da rimuovere. </li><li> Il &quot;circuito respiratorio&quot; comprende due valvole unidirezionali, posizionati in modo tale che la media segue un percorso diverso dentro e fuori del polmone. Una descrizione più dettagliata di questa funzione è disponibile in una pubblicazione preventiva da parte i nostri 2 di laboratorio. </li><li> Perfusione vascolare è fornito utilizzando una pompa a rulli. Medium è perfuso in arteria polmonare attraverso la cannula collegata, scorre attraverso il sistema vascolare polmonare, e la vena polmonare direttamente nel bioreattore principale, dove è tratto medio per perfusione. </li></ol> 2. Organ Harvest <ol><li> Euthanize adulti (3-6 mesi) Fischer 344 ratti per overdose di sodio pentobarbital, secondo le linee guida stabilite dalla American Veterinary Medical Association (60 mg / kg IP). Nota: la soluzione di pentobarbital include eparina a 100 unità / ml per la terapia anticoagulante. </li><li> Spray o pulire il torace e dell&#39;addome con il 70% di etanolo. </li><li> Aprire la cavità toracica, esponendo il cuore ei polmoni, avendo cura di non danneggiare i polmoni. Cura fare una piccola finestra attraverso il diaframma nella cavità toracica, provocando i polmoni di ritrattare, e quindi espandere questa incisione orizzontale per esporre le basi dei polmoni. Fare due incisioni verticalmente attraverso le costole, e ritirare la gabbia toracica per esporre il cuore ei polmoni. </li><li> Preparare un sistema di perfusione gravità, cioè usando una siringa con stantuffo rimosso, un rubinetto a 3 vie, e ~ 20 centimetri di tubi con 1.5inch, 21-gauge. Mantenere la siringa a ~ 20cm sopra l&#39;animale utilizzando un supporto ad anello. Assicurarsi che tutta l&#39;aria viene rimossa dal tubo di perfusione. </li><li> Tagliare l&#39;atrio destro per drenare il sangue, impedendogli di tornare ai polmoni. Taglio l&#39;atrio sinistro per permettere il drenaggio del sangue facile e perfusato dai polmoni può anche essere utile, ma non è necessario. </li><li> Inserire l&#39;ago nella base del ventricolo destro e aprire il rubinetto di perfusione polmonare con una soluzione di nitroprussiato eparina e sodio (50U/ml e 1ug/ml, rispettivamente) in PBS. Verificare che l&#39;arteria polmonare si riempie di liquido di perfusione, e che il sangue è radura dai polmoni. Se necessario, riempire la siringa con il liquido di perfusione aggiuntivi. Tipicamente solo 10ml ~ è richiesto. </li><li> Continuare fino a quando la perfusione polmonare sono chiari di sangue, poi si ferma perfusione. </li><li> Sezionare il libero trachea, fino al collo per quanto possibile. Garantire trachea è separato dal esofago. Sezionare tutte le connessioni rimanenti al cuore, polmoni e trachea, e rimuovere in blocco. </li><li> Usando un bisturi o taglienti forbici, tagliare l&#39;apice del cuore, esponendo i ventricoli destro e sinistro. </li><li> Cannulate il tronco polmonare attraverso il ventricolo destro, e la sutura al suo posto. Rimuovere qualsiasi tessuto in eccesso del ventricolo sinistro. </li><li> Cannulate la trachea e la sutura al suo posto. Assicurarsi che sia la cannula tracheale e polmonare arteriosa sono posizionati in modo tale che non ci sia lo stress torsionali sulla trachea, polmoni, o grossi vasi (Figura 1). </li><li> Assicurarsi che non ci siano bolle d&#39;aria nella cannula arteriosa, dal momento che bolle d&#39;aria intrappolate nel sistema può impedire il flusso costante di attraverso l&#39;organo. In alcuni casi, una bolla d&#39;aria può completamente fermare flow.To fluido ottenere questo risultato, luogo del cuore / polmone blocco in un vaso contenente PBS. Utilizzare una siringa con ago per iniettare una piccola quantità di PBS nella cannula cuore di espellere eventuali bolle. </li><li> Lavaggio delle vie aeree con PBS 4-5 volte, per eliminare l&#39;aria il più possibile dal polmone. </li><li> Dopo il passaggio lavandas sono completi, gonfiare il polmone con PBS contenente sodio nitroprussiato (SNP) a 1ug/ml. Mettere un tappo sulla cannula tracheale, per cui la soluzione rimane nel polmone. Lasciare che il polmone di incubare per 30 minuti, come la stessa soluzione passa attraverso il sistema vascolare attraverso l&#39;arteria polmonare, per permettere vasodilatazione. </li><li> Collegare cuore / polmoni per un berretto bioreattore utilizzando il luer-lock connessioni legate alla forma di Y cannule, descritto in &quot;Assemblea bioreattore&quot; di cui sopra. (Figura 1). </li></ol> 3. Organo Decellularization <ol><li> Collegare il tappo (con i polmoni in allegato) agli apparecchi decellularization (Figura 1). La cannula arteriosa polmonare dovrebbe collegarsi alla linea di perfusione, e la cannula tracheale dovrebbe flottante. Assicurarsi che tutte le linee sono chiare d&#39;aria. Come descritto in precedenza, l&#39;aria nelle linee può essere una fonte di decellularization poveri, impedendo il flusso di liquido decllularization. L&#39;aria intrappolata nel sistema può anche persistere nel tempo la cultura, quando essa potrebbe avere un impatto negativo sulla sopravvivenza delle cellule 3. </li><li> Gonfiare il polmone con PBS / SNP fino polmoni sono pieni, ma non troppo inflazionato. Immediatamente cappuccio della cannula tracheale in modo che il polmone rimane gonfiato. </li><li> Perfusione polmonare con PBS / SNP per almeno 15 min a ~ 15 mmHg (20 cm H 2 O di pressione). Dopo 15 minuti o più, togliere il tappo dalla cannula tracheale per consentire al polmone a sgonfiarsi. </li><li> Continua perfusione con PBS / SNP per 30min. Se necessario, riempire PBS / SNP per garantire la pressione di perfusione è mantenuta a 10-15 mmHg. </li><li> Iniziare perfusione con soluzione decellularization (CHAPS 8mm, 1M NaCl, 25mM EDTA in PBS 1X). Aver cura di garantire tutte le linee sono chiare d&#39;aria. Un sistema di vuoto può essere utile per fornire aspirazione. </li></ol> Profumato con la soluzione decellularization fino a 500 ml di soluzione ha perfuso attraverso il polmone. Pressione ottimale è &lt;15 mmHg (~ 20 cm H 2 O). Questo di solito richiede 2,5 ore. Le portate sono in genere molto lento (0.2-0.5ml/minute) inizialmente, e di aumentare rapidamente nel corso della seconda ora a circa 1ml/minute o superiore. Periodicamente, rimuovere il liquido decellularization utilizzati da bioreattore, assicurando abbastanza fluido rimane per sostenere il polmone e cannula tracheale. 4. Lavaggio e sterilizzazione degli organi <ol><li> Trasferimento del polmone e bioreattori a un cappuccio coltura di tessuti. Iniziare risciacquo con PBS sterile, eliminando il barattolo da 500 ml che conteneva il liquido decellularization e la sostituzione con un vasetto sterile contenente fino a 1 litro di PBS sterile. Usa aspirazione vuoto per garantire le linee sono chiare d&#39;aria. </li><li> Profumato PBS attraverso il sistema vascolare a 10-15 mmHg, nello stesso modo come per decellularization. Periodicamente, rimuovere i rifiuti dalla PBS bioreattore e sostituire e / o di riempire il vaso con PBS fresco, PBS sterile. Si consiglia di usare la tecnica sterile. </li><li> Continuare a sciacquare fino a quando almeno 2,5 l di PBS sterile hanno perfusi del polmone. </li><li> Trasferimento del polmone ad un nuovo sistema di bioreattore sterili contenenti PBS fresco. Assicurarsi che sia la perfusione intero ciclo e le linee aeree intero sono pieni di liquido. Tutte le fasi successive si utilizza una pompa di perfusione pulsatile i polmoni a 5ml/min. </li><li> Sterilizzare il patibolo, tramite perfusione durante la notte con PBS + 10% FBS + 10% pen-streptococco soluzione o per 3 ore con 0,1% di acido peracetico in PBS. Quest&#39;ultimo necessita di risciacquo del polmone con 3 cambi di 250ml PBS per diverse ore per rimuovere l&#39;acido residuo. Per ogni lavaggio, il polmone deve essere ventilato e perfuso per garantire che tutte le parti del tessuto perfetta efficienza. </li><li> Trasferire il polmone a 37 ° C in incubatore e profumato con PBS che ha il 10% FBS e il 10% penicillina / streptomicina per ~ 1 ora o fino a quando la temperatura è equilibrato, in preparazione per il trattamento benzonasi. </li><li> Trattare polmone con benzonasi per rimuovere il DNA residuo: <ol><li> Caldo il buffer benzonasi (vedi tabella dei reagenti) a 37 ° C. </li><li> Per ogni polmone, riempire una siringa da 10 ml con tampone benzonasi solo e una siringa da 10 ml con benzonasi 90U/ml nel buffer. </li><li> Interrompere la perfusione del polmone. </li><li> Gonfiare le vie aeree con tampone benzonasi. </li><li> Lasciare che il polmone a sgonfiarsi (per ~ 1 minuto). Poi, gonfiare il polmone con la soluzione benzonasi. Durante l&#39;inflazione con il tampone benzonasi &amp; benzonasi, cercare di evitare di iniettare l&#39;aria nei polmoni. </li><li> Lasciare che il polmone di sedersi senza perfusione o ventilazione a 37 ° C per 1 ora dopo il gonfiaggio con benzonasi. </li></ol></li><li> Riprendere con la perfusione + PBS 10% FBS, 10% penicillina / streptomicina che è già nel bioreattore, e continuare durante la notte. Il giorno seguente, il polmone può essere conservato a 4 ° C (per un massimo di 3 mesi) o preparati per la semina delle cellule. </li><li> Per preparare il patibolo per ripopolamento cellulare, sostituire la PBS / FBS / soluzione benzonasi con ~ 250 ml di terreno di coltura. Profumato per almeno un&#39;ora prima che le cellule vengono introdotte, un° sostituzione con terreno di coltura fresco direttamente prima di seminare le cellule. </li></ol> 5. Recellularization La scelta della fonte di cellule per la nuova semina organo è lasciata ai singoli ricercatori. Molte fonti di cellule può essere utilizzata, comprese le popolazioni disponibili in commercio, appena isolate cellule neonatali o polmonare fetale, le cellule staminali embrionali, o cellule fonti disponibili in commercio. Protocolli di isolamento specifici per queste popolazioni di cellule può essere trovato altrove 4,5,6. Qui forniamo istruzioni su come semi sia le popolazioni delle cellule endoteliali ed epiteliali. Semina endoteliale: <ol><li> Preparare una sospensione di desiderato popolazione di cellule endoteliali, nel terreno di coltura appropriato. Cellula sospensione filtrare attraverso un colino per eliminare cellule 40um grumi di cellule. Una semina tipica endoteliali nel nostro laboratorio avrebbero utilizzato circa 30 milioni di ratto polmone cellule endoteliali microvascolari in 60ml di terreno di coltura. </li><li> Dispensare sospensione cellulare in un piccolo serbatoio temporaneamente incorporata nel ciclo perfusione del bioreattore (Figura 2). Assicurarsi che il tubo da questo serbatoio e l&#39;intero ciclo di perfusione è chiaro di bolle d&#39;aria. </li><li> Infondere cellule in arteria polmonare a 3ml/min utilizzando una pompa a rulli. </li><li> Dopo l&#39;infusione delle cellule, continuare perfusione con mezzo di ricircolo dal bioreattore principale a frequenza desiderata. </li><li> Su base giornaliera, in modo che il tubo perfusione è chiaro di bolle d&#39;aria. </li><li> Medio dovrebbe essere sostituito con mezzo fresco regolarmente, questo è spesso fatto ogni 3-4 giorni. </li></ol> Semina epiteliale: <ol><li> Preparare una sospensione di cellule della popolazione desiderata delle cellule epiteliali. Nel nostro laboratorio, questo consiste tipicamente di circa 50-100 milioni di cellule di ratto neonatale polmonare. Filtrare la popolazione attraverso il filtro delle cellule 40um e sospendere in 15ml di terreno di coltura in una siringa. Riempire il serbatoio delle vie aeree con 80ml di terreno di coltura. </li><li> Posizionare il bioreattore a 37 ° C tessuto cultura incubatore, e collegare la pompa a siringa per la ventilazione. Assicurarsi che tutte le linee sono chiare ventilazione di aria. <ol><li> Semi di cellule nel polmone, iniettando 15 ml di sospensione cellulare in un unico bolo nella cannula tracheale. </li><li> Iniziare immediatamente un unico respiro lento utilizzando la pompa a siringa. Questo respiro è amministrato da ritiro 60ml di aria dal bioreattore principale 3ml/minute, quindi della durata di circa 20 minuti. Assicurarsi che i filtri dell&#39;aria sul bioreattore principale sono ricoperti immediatamente dopo l&#39;iniezione e la sospensione cellulare prima di iniziare il respiro lento. </li></ol></li><li> Lasciare i polmoni di sedersi staticamente per circa 18hrs, e poi iniziare a lenta perfusione vascolare (circa 0,5 ml / min). </li></ol> 6. Organo Cultura Sebbene i dettagli di perfusione e ventilazione variano in base alla progettazione sperimentale, i seguenti punti sono noti: <ol><li> Durante cultura endoteliale, la perfusione è tipicamente effettuata a 1-3 ml / min con una pompa a rulli. Durante cultura epiteliale, la ventilazione è tipicamente fornita a un tasso costante di 1 respiro al minuto con una pompa a siringa. Ritiro di 5-10ml di aria dal bioreattore principale è in genere necessario effettuare la ventilazione polmonare a un volume normale di marea. A causa della necessità di mantenere la tenuta bioreattore durante la ventilazione, la ventilazione dovrebbe essere messo in pausa ogni giorno e l&#39;aria nella camera principale dovrebbe essere scambiati. Tutta l&#39;aria nel sistema è aria della stanza, che è circa il 21% di ossigeno a pressione parziale. Il 5-10ml di aria dal ritiro del bioreattore (che induce una 5-10ml ispirazione del fluido del polmone) si basa sulle dimensioni del polmone e quanti lobi vengono colti (lobi possono essere legati off per l&#39;analisi, mentre il lobi rimanenti continuano a cultura). La quantità di aria ritirato dalla pompa siringa è scelto di approssimare il &quot;volume corrente&quot; del polmone colta. </li><li> Medio dovrebbe essere cambiato circa ogni 3-4 giorni durante cultura. </li><li> Durante la co-cultura di entrambe le epitelio ed endotelio, gli esperimenti di laboratorio nel nostro solito prima l&#39;epitelio per 4-8 giorni, durante i quali è ventilato l&#39;ingegneria tessutale. L&#39;endotelio viene poi seminato attraverso perfusione, dopo di che il tessuto sia perfuso e ventilato. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Decellularization Quando il protocollo è eseguita correttamente, i polmoni appena estratti dovrebbe tenere l&#39;aria senza perdite. Gonfiaggio con aria in immersione in un liquido può controllare questo - non ci dovrebbero essere tutte le bolle che indicano perdite d&#39;aria. Il decellularization successivo dovrebbe consentire ~ 500 ml di liquido decellularization a fluire attraverso i polmoni, nel corso di 2,5 - 3 ore a 37 ° C, e PBS dovrebbe alla fine essere in grado di fluire attraverso i polmoni a circa 10 ml / min (sotto ~ 15 mm Hg della pressione idrostatica) alla fine del lavaggio. Dopo il trattamento con 0,1% di acido peracetico e benzonasi, i polmoni possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 3 mesi, e ancora adatto per recellularization. La matrice extracellulare decellularized finale deve essere completamente privo di materiali cellulari, e conservino le caratteristiche lordo, microscopica e ultrastrutturale del polmone nativo. Decellularization insufficiente o risciacquo può provocare resto DNA &quot;attaccare&quot; al patibolo, che può essere visualizzato con una standard e ematossilina eosina (vedi Figura 3 per il confronto). Ripopolamento di matrice acellulare e della cultura del tessuto polmonare Se le cellule vengono isolate da appena 7 giorni cuccioli di ratto vecchio neonatale, come descritto nel supplemento linea che accompagna il lavoro di Petersen e colleghi 4, ci si può aspettare una resa cellula di 120-150 milioni di cellule per ogni cucciolata di 10 cuccioli (poco più di 10 milioni celle per neonato). Condizioni ottimali per la semina delle cellule e la cultura successiva del polmone nel bioreattore dovrebbe produrre ben distribuita all&#39;interno di tutte le cellule 5 lobi del polmone, e dovrebbe fornire una copertura di circa il 70% della matrice extracellulare patibolo (Figura 3). La popolazione di cellule in coltura sarà positiva per i principali marcatori delle cellule delle vie respiratorie, come pro-secretoria proteina-C (SPC), proteina secretoria delle cellule di Clara (CCSP), e aquaporin-5 (AQP), in ordine di abbondanza relativa (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Posizioni cannule e bioreattore decellularization <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Bioreattori usati per la semina e la cultura del tessuto polmonare ingegnerizzati <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Istologia di natale, decellularized, e ripopolata polmone <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Colorazione di immunofluorescenza per gli indicatori chiave del polmone

<ol>
	<li>American Lung Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lung Disease Data. , (2008).</li><li>Petersen, T. H., Calle, E. A., Colehour, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+for+the+Long+Term+Culture+of+Lung+Tissue.">Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue.</a> Cell Transplant. , (2010).</li><li>Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+surface+tension+induced+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening.">Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).</li><li>Petersen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineerined+Lungs+for+in+Vivo+Implantation.">Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329, 538-5341 (2010).</li><li>Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat Med. 16, 927-9233 (2010).</li><li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation.">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (2010).</li><li>Sugihara, H., Toda, S., Miyabara, S., Fujiuyama, C., Yonemitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+alveolus-like+structure+from+alveolar+type+II+epithelial+cells+in+three-dimensional+collagen+gel+matrix+culture.">Reconstruction of alveolus-like structure from alveolar type II epithelial cells in three-dimensional collagen gel matrix culture.</a> Am J Pathol. 142, 783-7892 (1993).</li><li>Choe, M. M., Sporn, P. H., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+by+dynamic+strain+in+a+three-dimensional+tissue-engineered+human+airway+wall+model.">Extracellular matrix remodeling by dynamic strain in a three-dimensional tissue-engineered human airway wall model.</a> American Journal Respiratory Cell Molecular Biology. 35, 306-306 (2006).</li><li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-enginered+lung:+an+in+vivo+and+in+vitro+comparison+of+polyglycolic+acid+and+pluronic+F-127+hydrogel/somatic+lung+progenitor+cell+constructs+to+support+tissue+growth.">Tissue-enginered lung: an in vivo and in vitro comparison of polyglycolic acid and pluronic F-127 hydrogel/somatic lung progenitor cell constructs to support tissue growth.</a> Tissue Engineering. 12, 1213-1213 (2006).</li><li>Price, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Decellularized+Lung+Bioreactor+System+for+Bioengineering+the+Lung:+The+Matrix+Reloaded.">Development of a Decellularized Lung Bioreactor System for Bioengineering the Lung: The Matrix Reloaded.</a> Tissue Eng Part A. , (2010).</li><li>Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. 16, 814-820 (2010).</li><li>Shannon, J. M., Mason, R. J., Jennings, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+alveolar+type+II+epithelial+cells+in+vitro:+effects+of+cell+shape,+cell-matrix+interactions+and+cell-cell+interactions.">Functional differentiation of alveolar type II epithelial cells in vitro: effects of cell shape, cell-matrix interactions and cell-cell interactions.</a> Biochim. Biophys. Acta. 931, 143-156 (1987).</li><li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Acellular+Natural+Lung+Matrix+on+Murine+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation+and+Tissue+Formation.">Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation.</a> Tissue Eng Part A. , (2010).</li></ol>

LEN detiene azioni in Humacyte, una società di medicina rigenerativa. Humacyte non finanziare questi studi, e non hanno influenzato la progettazione, interpretazione o segnalazione di qualsiasi esperimenti o metodi descritti. Gli autori (LEN, THP, EAC) e Yale University hanno depositato una domanda di brevetto relative a ingegneria dei tessuti di polmoni.

Gli aspetti più critici del sistema indicati comprendono la manutenzione della sterilità, e un attento monitoraggio delle pressioni applicate al letto vascolare in tutto il processo di preparazione e semina il patibolo e la coltura del polmone ripopolato. La sterilità è meglio mantenuta in autoclave tutto il materiale prima dell&#39;uso, e montando il polmone in un sistema chiuso poco dopo l&#39;espianto ed evitare successive violazione di questa barriera. Dopo la matrice decellularized è stato accuratamente sciacquati e trasferito in un bioreattore sterile per la cultura, il tappo in silicone e altre guarnizioni e le connessioni non deve essere disturbato o rimosso. Per mantenere la pressione sotto controllo, il flusso spinto dalla forza di gravità è preferibile, quando possibile. Quando una pompa è richiesto per il ricircolo del liquido, a partire dopo il risciacquo con PBS e continua durante cultura, vi consigliamo direttamente la misurazione della pressione appena prima che il fluido entra l&#39;arteria polmonare con un trasduttore di pressione. L&#39;entità della pressione esercitata non deve superare i 15 mm Hg. Recellularized polmoni possono essere coltivate per diversi periodi di tempo, di solito vanno da 4 giorni fino a 3 settimane. Perfusione vascolare in genere viene eseguita a 1-3 ml / min durante cultura endoteliali, mentre la ventilazione è di norma applicato ad una velocità di 1 respiro / min durante cultura epiteliali. Durante i periodi di cultura combinato, ventilazione simultanea e perfusione è appropriata. Ventilazione può essere effettuata sia con mezzo liquido o aria. Nel corso degli ultimi decenni, diversi gruppi hanno fatto importanti lavori di ingegneria dei tessuti che mostrano la possibilità di differenziare l&#39;epitelio polmonare in vitro e di replicare diversi aspetti del polmone microanatomia 7,8,9, 10. Tuttavia, fino a poco tempo, nessuno di questi 4,5 tentativi di ingegnere tessuto polmonare ha portato ad un organo impiantabili che era in grado di mantenere la separazione tra il sangue e comparti delle vie aeree e che possono partecipare allo scambio di gas. Pertanto, anche se i metodi descritti sono solo un primo passo verso l&#39;obiettivo a lungo termine di produrre tessuto funzionale del polmone, questo lavoro è un passo incoraggiante verso la possibilità di aumentare la quantità di tessuto polmonare disponibili per il trapianto. Inoltre, questo lavoro elabora lavoro svolto dal Ott et al. Uygun e 11,12 e colleghi, che dimostrano l&#39;efficacia di una matrice extracellulare decellularized come impalcatura per l&#39;ingegneria dei tessuti complesse strutture tridimensionali e sostenere la crescita e la sopravvivenza di vari tipi di cellule . Questo lavoro è anche significativo per il suo contributo alla armamentario di cellule respiratorie e biologi molecolari. Fornendo un unico ambiente tridimensionale che può anche fornire adeguati stimoli meccanici, e che non condivide il rischio di compagno di una rapida de-differenziazione che si possono verificare durante roditore epitelio coltura in laboratorio con metodi più tradizionali 13, gli scienziati potrebbero usare il nostro sistema di approfondire la conoscenza dei interazioni cellula-cellula e cellula-matrice che svolgono un ruolo nella differenziazione cellulare e la funzione. Questa conoscenza può essere particolarmente potente se usato come leva per guidare il destino di diverse popolazioni di cellule staminali, come gruppo Cortiella ha dimostrato in studi iniziali 14.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Eutanasia </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio nitroprussiato </td><td> Fluka </td><td> 71778 </td><td></td></tr><tr><td> Euthasol eutanasia soluzione </td><td> Virbac AH </td><td> 710101 </td><td> 390 mg / ml soluzione madre di sodio pentobarbital deve essere diluita opportunamente per la somministrazione IP </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell Soluzione </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Americano Bioanalytical </td><td> AB01915 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-01 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 1X </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Bioreattore Componenti </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 480 ml barattolo </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-3460560 </td><td></td></tr><tr><td> Tappo in silicone, taglia 14 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-26 </td><td></td></tr><tr><td> Y-connettori </td><td> Cole Parmer </td><td> DE-30614-08 </td><td> Utilizzato per cannule arteriose e tracheale </td></tr><tr><td> Tubi di silicone </td><td> Masterflex </td><td> 96420-14, 16 </td><td> L / S 14, 16 </td></tr><tr><td> Trasduttori di pressione </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX-212 </td><td></td></tr><tr><td> Valvola di ritegno </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-98553-20 </td><td> Valvola unidirezionale </td></tr><tr><td> 4-way rubinetti </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 594WSC </td><td></td></tr><tr><td> Siringa filtro </td><td> Cole Parmer </td><td> 2915-08 </td><td> PTFE, 0.2μm </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell e apparati risciacquo (integrazioni al bioreattore) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 e 1000 ml, bottiglie di vetro </td><td> Corning </td><td> 1395-500;-1L </td><td> Utilizzato per decell e risciacquo per gravità </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Benzonasi Trattamento </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Americano Bioanalytical </td><td> AB14043 </td><td> 1M, pH 8,0 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> JT Baker </td><td> 2444-01 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonasi nucleasi </td><td> Sigma </td><td> E1014 </td><td> Endonucleasi usato per rimuovere residui di DNA da matrici </td></tr></tbody></table>

procedure for lung engineering

Tessuto polmonare, tra cui il cancro al polmone e malattie polmonari croniche come la broncopneumopatia cronica ostruttiva, cumulativamente rappresentano circa 280.000 morti all&#39;anno; malattia polmonare ostruttiva cronica è attualmente la quarta causa di morte negli Stati Uniti 1. Contribuire a questo mortalità è il fatto che i polmoni in genere non riparare o rigenerare al di là del microscopico, a livello cellulare. Pertanto, tessuto polmonare che è danneggiato da degenerazione o infezione, o nel tessuto polmonare che è chirurgicamente resecato non è funzionalmente sostituito in vivo. Per esplorare se tessuto polmonare possono essere generati in vitro, abbiamo trattato polmoni di ratti adulti utilizzando una procedura che rimuove i componenti cellulari per produrre un acellulare polmone matrice extracellulare patibolo. Questa impalcatura mantiene le strutture gerarchiche ramificazione delle vie aeree e vasi, così come una membrana basale in gran parte intatta, che comprende collagene IV, laminina e fibronectina. Il ponteggio è montato in un bioreattore progettata per imitare gli aspetti critici della fisiologia del polmone, quali la ventilazione a pressione negativa e perfusione vascolare pulsatile. Da epitelio polmonare coltura ed endotelio vascolare all&#39;interno del bioreattore montato un&#39;impalcatura, siamo in grado di generare tessuto polmonare che è fenotipicamente paragonabile a tessuto polmonare nativa e che è in grado di partecipare allo scambio di gas per brevi intervalli di tempo (45-120 minuti). Questi risultati sono incoraggianti e suggeriscono che il ripopolamento del polmone matrice è una strategia praticabile per la rigenerazione del polmone. Questa possibilità rappresenta un&#39;opportunità non solo di lavorare per aumentare l&#39;offerta di tessuto polmonare per i trapianti, ma anche per lo studio delle cellule delle vie respiratorie e la biologia molecolare in vitro per periodi di tempo più lunghi e in un microambiente più accurata rispetto al passato possibile.

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Lung Engineering at JoVE.com

Procedure for Lung Engineering

Abbiamo sviluppato una matrice extracellulare del polmone decellularized e bioreattore romanzo biomimetici che può essere utilizzato per generare il tessuto funzionale del polmone. Con la semina delle cellule e nella matrice coltura nel bioreattore, generiamo tessuto che dimostra efficace scambio di gas quando trapiantate in vivo per brevi periodi di tempo.

Procedura per l&#39;Ingegneria del polmone

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

46.5K Views.  Yale University. Abbiamo sviluppato una matrice extracellulare del polmone decellularized e bioreattore romanzo biomimetici che può essere utilizzato per generare il tessuto funzionale del polmone. Con la semina delle cellule e nella matrice coltura nel bioreattore, generiamo tessuto che dimostra efficace scambio di gas quando trapiantate in vivo per brevi periodi di tempo.

Video: Procedure for Lung Engineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS elastomerico Ponteggi in Ingegneria tessuto arterioso

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Ricerca

Bioingegneria

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Elaborazione Postproduzione di fibre elettrofilate per l&#39;ingegneria tissutale

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Sintesi di nanofibre cheratina-based per Ingegneria Biomedica

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Vascularized microfluidic multimateriali per l'ingegneria dei tessuti e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Due metodi per decellularizzazione di tessuti vegetali per applicazioni di ingegneria del tessuto

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Catetere leggero intra-cardiaco per il monitoraggio del metabolismo cellulare utilizzando la spettroscopia transmurale di riambente di cuori mammiferi perfusi

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex vivo. Recently developed organoid models have facilitated the expansion and study of lung epithelial progenitors in vitro, but these platforms typically rely on mouse tumor-derived matrix and/or serum, and incorporate just one or two cellular lineages. Here, we describe a protocol for generating engineered lung tissues (ELTs) based on the multi-lineage recellularization of decellularized precision-cut lung slices (PCLS). ELTs contain alveolar-like structures comprising alveolar epithelium, mesenchyme, and endothelium, within an extracellular matrix (ECM) substrate closely resembling that of native lung. To generate the tissues, rat lungs are inflated with agarose, sliced into 450 &#181;m-thick slices, cut into strips, and decellularized. The resulting acellular ECM scaffolds are then reseeded with primary endothelial cells, fibroblasts, and alveolar epithelial type 2 cells (AEC2s). AEC2s can be maintained in ELT culture for at least 7 days with a serum-free, chemically-defined growth medium. Throughout the tissue preparation and culture process, the slices are clipped into a cassette system that facilitates handling and standardized cell seeding of multiple ELTs in parallel. These ELTs represent an organotypic culture platform that should facilitate investigations of cell-cell and cell-matrix interactions within the alveolus as well as biochemical signals regulating AEC2s and their niche.

This protocol describes a method to generate reproducible, small-scale engineered lung tissues, by repopulating decellularized precision-cut lung slices with alveolar epithelial type 2 cells, fibroblasts, and endothelial cells.

Tessuti polmonari ingegnerizzati preparati da fette di polmone decellularizzate

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Studio comparativo delle tecniche di decellularizzazione per idrogel ECM polmonari bovini

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural environment in vitro. However, maintaining the native biochemical content of the ECM, achieving mechanical stability, and comprehending the impact of the decellularization process on the mechanical properties of the ECM hydrogels are challenging. Here, a pipeline for decellularization of bovine lung tissue using two different protocols, downstream characterization of the effectiveness of decellularization, fabrication of reconstituted decellularized lung ECM hydrogels and assessment of their mechanical and cytocompatibility properties were described. Decellularization of the bovine lung was pursued using a physical (freeze-thaw cycles) or chemical (detergent-based) method. Hematoxylin and Eosin staining was performed to validate the decellularization and retention of major ECM components. For the evaluation of residual collagen and sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content within the decellularized samples, Sirius red and Alcian blue staining techniques were employed, respectively. Mechanical properties of the decellularized lung ECM hydrogels were characterized by oscillatory rheology. The results suggest that decellularized bovine lung hydrogels can provide a reliable organotypic<span style="font-size: 11pt; font-family: Calibri, sans-serif; color: black; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">&#160;alternative to commercial ECM products by retaining most native ECM components. Furthermore, these findings reveal that the decellularization method of choice significantly affects gelation kinetics as well as the stiffness and viscoelastic properties of resulting hydrogels.

Autore in primo piano: Ottimizzazione della decellularizzazione polmonare bovina per idrogel organotipici

The protocol elucidates two distinct decellularization methodologies applied to native bovine pulmonary tissues, providing a comprehensive account of their respective characterizations.

Sviluppo e caratterizzazione di idrogel di matrice extracellulare polmonare decellularizzata

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...