Wir danken Maegan B. Colehour um Hilfe bei der Bioreaktor Entwicklung. Diese Studien wurden von der Yale University Klinik für Anästhesie und von NIH HL 098220 (LEN) finanziert. THP wurde durch die NIH T32 GM007171 unterstützt.

1. Bioreaktor Assembly Detaillierte Figur (en) des Bioreaktors Konstruktion und Montage für beide Dezellularisierung und Kultur sind in den Abbildungen 1 und 2, jeweils. Alle Komponenten müssen vor der Montage des Bioreaktors sterilisiert werden. Die folgenden spezifischen Punkte werden notiert: ANSCHLÜSSE: <ol><li> Die arterielle Kanüle besteht aus einem Luer-Lock-Ansatz verbunden mit einem Y-Splitter durch einen kurzen Abschnitt der Rohre. Der Luer-Lock-Anschluss ist der Infusionsschlauch angebracht, und das Segment der Y, die nicht der Lungenarterie angenäht ist ein Einweg-Ventil verbunden. Die Ein-Wege-Ventil ist so ausgerichtet, dass Flüssigkeit kann bis in den Schlauch (in die entgegengesetzte Richtung wie Perfusion) gezogen werden, aber während der Organperfusion alle Medium strömt in die Lunge. </li><li> Die Trachealkanüle besteht ebenfalls aus einem Luer-Lock-Anschluss in Verbindung mit einem Y-Verteiler mit Schlauch. Der Luer-Lock-Verbindung zu einem Atemkreislauf zwischen der Luftröhre Reservoir und der Hauptkammer. Das Segment der Y-Stecker, der nicht auf die Luftröhre wird vernäht ist auch ein Einweg-Ventil verbunden. Die Ein-Wege-Ventil ist in der gleichen Weise wie die arterielle Kanüle ausgerichtet. </li></ol> FUNKTIONEN: <ol start="3"><li> Die Ein-Wege-Ventile in den arteriellen und Trachealkanülen werden eingesetzt, um Luftblasen in den Schlauch klar, indem Umkehrung der Strömung in der Rohrleitung und daher erlaubt Luftblasen zu entfernen. </li><li> Die &quot;atmende loop&quot; enthält zwei Einweg-Ventile, so positioniert, dass mittelfristig nach einem anderen Weg in und aus der Lunge. Eine ausführlichere Beschreibung dieser Funktion ist in einer früheren Publikation aus unserem Labor 2 vorgesehen. </li><li> Vascular Perfusion erfolgt mit Hilfe einer Walze Pumpe. Medium in die Pulmonalarterie erfolgt über den beiliegenden Kanüle perfundiert, fließt durch die Lunge Gefäßsystem und die Lungenvene direkt in die Haupt-Bioreaktor, wo mittel-bis zur Perfusion gezogen wird. </li></ol> 2. Organentnahme <ol><li> Euthanize Erwachsenen (3-6 Monate alt) Fischer 344 Ratten durch Natrium-Pentobarbital Überdosierung, nach Leitlinien, die von der American Veterinary Medical Association (60 mg / kg IP) gesetzt. Hinweis: die Pentobarbital-Lösung umfasst Heparin bei 100 Einheiten / ml zur Antikoagulation. </li><li> Spray oder wischen Sie die Brust und Unterleib mit 70% Ethanol. </li><li> Öffnen Sie die Brusthöhle, Freilegung der Herz und Lunge, wobei darauf zu achten nicht beschädigen die Lunge. Vorsichtig einen kleinen Fenster, durch das Zwerchfell in die Brusthöhle, wodurch die Lunge zu widerrufen, und erweitern Sie dann diesen Schnitt horizontal, um die Grundlagen der Lunge aufzudecken. Machen Sie zwei Schnitte senkrecht durch die Rippen, und schieben Sie den Brustkorb in das Herz und die Lungen aussetzen. </li><li> Bereiten Sie einen Schwerpunkt Perfusion, dh mit Hilfe einer Spritze mit Kolben entfernt, ein 3-Wege-Hahn, und ~ 20 cm Schlauch mit einem 1.5, 21-Gauge-Nadel. Pflegen Sie die Spritze bei ~ 20 cm über dem Tier mit einem Ring zu stehen. Stellen Sie sicher, dass alle Luft aus dem Infusionsschlauch entfernt wird. </li><li> Schneiden Sie den rechten Vorhof Blut drain, verhindern, dass es wieder in die Lungen. Cutting den linken Vorhof zur einfachen Entwässerung von Blut und Perfusat aus der Lunge ermöglichen kann auch hilfreich sein, ist aber nicht notwendig. </li><li> Führen Sie die Nadel in die Basis des rechten Ventrikels und öffnen Sie den Hahn in die Lunge mit einer Lösung von Heparin und Natrium-Nitroprussid (50U/ml und 1ug/ml jeweils) in PBS perfundiert. Bestätigen Sie, dass die Lungenarterie mit Perfusionsflüssigkeit füllt, und das Blut aus den Lungen Lichtung. Wenn nötig, füllen die Perfusion Spritze mit zusätzlicher Flüssigkeit. Typischerweise werden nur ~ 10ml erforderlich ist. </li><li> Weiter Perfusion, bis die Lungen frei von Blut sind, dann stoppen Perfusion. </li><li> Präparieren Sie die Luftröhre frei, bis in den Hals so weit wie möglich. Stellen Sie sicher, Luftröhre von der Speiseröhre getrennt. Dissect alle übrigen Verbindungen zum Herz, Lunge und Luftröhre, und entfernen Sie en bloc. </li><li> Mit einem Skalpell oder einer scharfen Schere, schneiden Sie die Spitze des Herzens, Freilegung der rechten und linken Herzkammer. </li><li> Kanülieren Truncus pulmonalis über die rechte Herzkammer, und Naht in Kraft. Entfernen Sie überschüssiges linksventrikulären Gewebe. </li><li> Kanülieren der Luftröhre und Naht in Kraft. Stellen Sie sicher, dass sowohl der Luftröhre und der pulmonalen arteriellen Kanülen sind so positioniert, dass es keine Torsionsspannung auf die Luftröhre, Lungen oder der großen Gefäße (Abbildung 1). </li><li> Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen in die arterielle Kanüle, da Luftblasen in das System gefangen kann konstanten durch das Organ zu verhindern. In einigen Fällen, eine Luftblase komplett stoppen kann Flüssigkeit flow.To dies zu erreichen, statt das Herz / Lunge bloc in ein Gefäß mit PBS. Verwenden Sie eine Spritze mit Nadel eine kleine Menge von PBS in das Herz Kanüle injizieren, um Luftblasen zu vertreiben. </li><li> Lavage der Atemwege mit PBS 4-5 mal, um so viel Luft wie möglich aus der Lunge. </li><li> Nach Lavage Schritts abgeschlossen sind, blasen die Lunge mit PBS, das Natrium-Nitroprussid (SNP) bei 1ug/ml. Setzen Sie einen Anschlag auf die Trachealkanüle, so bleibt die Lösung in der Lunge. Lassen Sie die Lunge bis zu 30 Minuten inkubieren, als die gleiche Lösung fließt durch das Gefäßsystem über die Lungenarterie, zur Vasodilatation ermöglichen. </li><li> Connect Herz / Lunge einen Bioreaktor Kappe mit dem Luer-Lock-Anschlüsse in Verbindung mit der Y-förmigen Kanülen, in &quot;Bioreaktor Assembly&quot; beschrieben. (Abbildung 1). </li></ol> 3. Orgel Dezellularisierung <ol><li> Schließen Sie den Deckel (mit Lunge angeschlossen ist), um Dezellularisierung Apparat (Abbildung 1). Die Lungenarterie Kanüle sollte auf die Perfusion Linie zu verbinden, und die Trachealkanüle sollte schwimmen frei. Sicherstellen, dass alle Linien sind klar der Luft. Wie oben beschrieben, kann die Luft in den Leitungen eine Quelle der armen Dezellularisierung werden durch die Verhinderung Fluss decllularization Flüssigkeit. Luft im System eingeschlossene Luft kann auch in die Kultur der Zeit bestehen bleiben, wenn es einen negativen Einfluss auf das Überleben der Zelle 3 haben. </li><li> Inflate der Lunge mit PBS / SNP, bis Lungen voll sind, aber nicht über-aufgeblasen. Unmittelbar Kappe der Trachealkanüle, so dass die Lunge aufgeblasen bleibt. </li><li> Perfundieren Lunge mit PBS / SNP für mindestens 15 min bei ~ 15 mmHg (20cm H 2 O Druck). Nach 15min oder länger, entfernen Sie den Stopfen aus der Trachealkanüle, damit die Lunge zu entleeren. </li><li> Weiter Perfusion mit PBS / SNP für 30min. Wenn nötig, zum Nachfüllen PBS / SNP sicherzustellen Perfusionsdruck bei 10-15 mmHg gehalten wird. </li><li> Begin Perfusion mit Dezellularisierung Lösung (8mm CHAPS, 1M NaCl, 25mM EDTA in 1X PBS). Achten Sie darauf, alle Linien sind klar der Luft. Ein Vakuumsystem kann hilfreich sein, Saug-stellen. </li></ol> Perfundieren mit Dezellularisierung Lösung bis 500ml der Lösung durch die Lunge durchströmt hat. Optimale Druck &lt;15 mmHg (~ 20 cm H 2 O). Diese Regel erfordert 2,5 Stunden. Volumenströme sind in der Regel sehr langsam (0.2-0.5ml/minute) zunächst schnell und in der zweiten Stunde zu erhöhen, um etwa 1ml/minute oder höher. Entfernen Sie regelmäßig verwendet Dezellularisierung Flüssigkeit aus Bioreaktor, wodurch genug flüssig bleibt, um die Lunge und Trachealkanüle zu unterstützen. 4. Orgel Spülen und Sterilisieren <ol><li> Transfer-Lungen-und Bioreaktor zu einer Gewebekultur Kapuze. Begin Spülen mit sterilem PBS, indem Sie die 500ml Glas, dass die Dezellularisierung Flüssigkeit enthalten und ersetzt mit einem sterilen Gefäß mit bis zu 1 Liter sterilem PBS. Staubsauger benutzen, um sicherzustellen, Linien sind klar der Luft. </li><li> Perfundieren PBS durch das Gefäßsystem bei 10-15 mmHg, in der gleichen Weise wie für Dezellularisierung. Entfernen Sie regelmäßig Abfall PBS aus dem Bioreaktor und ersetzen und / oder füllen Sie das PBS-Gefäß mit frischem, sterilem PBS. Es ist ratsam, sterile Technik zu verwenden. </li><li> Weiter spülen, bis mindestens 2,5 l sterilem PBS der Lunge haben perfundiert. </li><li> Transfer Lunge, um eine neue, sterile Bioreaktor-System mit frischem PBS. Stellen Sie sicher, dass sowohl die gesamte Durchblutung Schleife und der gesamten Atemwege Linien mit Flüssigkeit gefüllt sind. Alle weiteren Schritte werden mit einem pulsatile Pumpe in die Lunge bei 5ml/min perfuse. </li><li> Sterilisieren das Gerüst, entweder über Nacht Perfusion mit PBS + 10% FBS + 10% Pen-Strep-Lösung oder für 3 Stunden mit 0,1% Peressigsäure in PBS. Letzteres erfordert Spülung der Lunge mit 3 Änderungen der 250ml PBS über mehrere Stunden, um restliche Säure zu entfernen. Für jede spülen, sollte der Lunge sowie perfundiert, um sicherzustellen, dass alle Teile des Gewebes gut gespült werden belüftet werden. </li><li> Übertragen Sie die Lunge zu einem 37 ° C Inkubator und perfuse mit PBS, dass 10% FBS und 10% Penicillin / Streptomycin für ~ 1 Std. oder hat, bis die Temperatur ist ausgeglichen, in Vorbereitung auf Benzonase Behandlung. </li><li> Gönnen Lunge mit Benzonase um Überbleibsel DNA zu entfernen: <ol><li> Warm die Benzonase-Puffer (siehe Tabelle der Reagenzien) bis 37 ° C. </li><li> Für jede Lunge, füllen einen 10ml-Spritze mit Benzonase Puffer nur und eine 10ml Spritze mit 90U/ml Benzonase in Puffer. </li><li> Stoppen Sie die Durchblutung der Lunge. </li><li> Pumpen Sie den Atemweg mit Benzonase Puffer. </li><li> Lassen Sie die Lunge zu entleeren (für ~ 1 Minute). Dann blasen die Lunge mit der Benzonase Lösung. Während der Inflation mit Benzonase Puffer &amp; Benzonase, versuchen zu vermeiden Injektion keine Luft in die Lunge. </li><li> Lassen Sie die Lunge, ohne Perfusion oder Belüftung bei 37 ° C zu sitzen für 1 Stunde nach dem Aufblasen mit Benzonase. </li></ol></li><li> Fortsetzen Perfusion mit PBS + 10% FBS, 10% Penicillin / Streptomycin, die sich bereits in den Bioreaktor, und weiter über Nacht. Am folgenden Tag kann die Lunge entweder bei 4 ° C gelagert werden (für bis zu 3 Monate) oder vorbereitet für die Zell-Aussaat. </li><li> Zur Vorbereitung des Gerüstes für die zelluläre Wiederbesiedlung, ersetzen Sie das PBS / FBS / Benzonase Lösung mit ~ 250 ml Kulturmedium. Perfundieren für mindestens eine Stunde vor-Zellen eingeführt werden, einnd mit frischem Kulturmedium ersetzen direkt vor der Aussaat Zellen. </li></ol> 5. Recellularization Die Wahl der Zelle Quelle für Orgel Nachsaat ist Sache der einzelnen Forscher überlassen. Viele Zelle Quellen können verwendet werden, einschließlich im Handel erhältlich Populationen, frisch isolierten neonatalen oder fetalen Lungenzellen, embryonale Stammzellen, oder im Handel erhältliche Zelle Quellen. Spezielle Isolation Protokolle für diese Zellpopulationen anderswo 4,5,6 gefunden werden. Hier stellen wir Anleitungen zur Saat sowohl Endothel-und Epithelzellen Zellpopulationen. Endothelial Aussaat: <ol><li> Eine Suspension von gewünschten Endothel-Zell-Population, in geeigneten Kulturmedium. Filter Zellsuspension durch ein 40 um Zellsieb zu Zellklumpen zu entfernen. Eine typische Endothelzellen Aussaat in unserem Labor würde rund 30 Millionen Rattenlunge mikrovaskulären Endothelzellen in 60ml Kulturmedium zu nutzen. </li><li> Dispense Zellsuspension in ein kleines Reservoir vorübergehend in die Perfusion Schleife des Bioreaktors (Abbildung 2) eingebaut. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch aus diesem Reservoir und die gesamte Durchblutung Schleife frei von Luftblasen ist. </li><li> Infuse Zellen in der Lungenarterie bei 3ml/min mit einer Rolle zu pumpen. </li><li> Nach Zelle Infusion weiterhin Perfusion mit Medium aus dem Haupt-Bioreaktor in der gewünschten Geschwindigkeit zurückgeführt. </li><li> Auf einer täglichen Basis, sicherzustellen, dass die Infusionsschlauch frei von Luftblasen ist. </li><li> Medium sollte mit frischem Medium regelmäßig ausgetauscht werden, ist dies oft getan alle 3-4 Tage. </li></ol> Epitheliale Aussaat: <ol><li> Eine Zellsuspension des gewünschten epithelialen Zell-Population. In unserem Labor, das typischerweise aus ca. 5 bis 10 neugeborenen Ratten Lungenzellen. Filter der Bevölkerung durch 40um Zellsieb und suspendieren in 15ml Kulturmedium in einer Spritze. Füllen Sie die Atemwege Behälter mit 80ml Kulturmedium. </li><li> Setzen Sie den Bioreaktor in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator, und verbinden Sie die Spritzenpumpe für die Belüftung. Sicherstellen, dass alle Entlüftungsleitungen sind klar der Luft. <ol><li> Seed die Zellen in der Lunge durch die Injektion von 15 ml Zellsuspension als einzelner Bolus in die Trachealkanüle. </li><li> Sofort beginnen einen einzigen, langsamen Atemzug mit der Spritzenpumpe. Dieser Atem ist durch den Rückzug 60ml von Luft aus dem Haupt-Bioreaktor bei 3ml/minute verabreicht werden, damit dauerhaft etwa 20 Minuten. Sicherstellen, dass die Luftfilter an der Hauptstraße Bioreaktor off werden sofort nach der Injektion der Zellsuspension und vor Beginn der langsamen Atem begrenzt. </li></ol></li><li> Lassen Sie die Lunge zu statisch sitzen etwa 18h, und beginnen Sie dann langsam Gefäßperfusion (ca. 0,5 ml / min). </li></ol> 6. Organ Culture Obwohl die Einzelheiten der Perfusion und Ventilation basiert auf experimentellen Design variieren, sind folgende Punkte zu beachten: <ol><li> Während endothelial Kultur, ist die Perfusion in der Regel bei 1-3 ml / min mit einer Walze Pumpe durchgeführt. Während epithelialen Kultur, ist die Belüftung in der Regel mit einer kontinuierlichen Rate von 1 Atemzug pro Minute mit einer Spritze Pumpe vorgesehen. Rücknahme von 5-10ml von Luft aus dem Haupt-Bioreaktor ist in der Regel erforderlich, um Lungenventilation bei einem normalen Atemzugvolumen Wirkung. Aufgrund der Notwendigkeit, den Bioreaktor luftdicht während der Beatmung zu erhalten, sollten Lüftungs täglich angehalten werden und die Luft in der Hauptkammer sollte ausgetauscht werden. Alle Luft im System ist Raumluft, die ca. 21% Sauerstoff-Partialdruck ist. Das 5-10ml Rückzug der Luft aus dem Bioreaktor (das führt zu einem 5-10ml Inspiration von Flüssigkeit in der Lunge) ist von der Größe der Lunge auf und wie viele Lappen sind kultiviert (Lappen können für die Analyse eingebunden werden, während die verbleibenden Lappen weiter in Kultur). Die Menge an Luft durch die Spritzenpumpe zurückgezogen ist die Angleichung der &quot;Atemzugvolumen&quot; des kultivierten Lungenzellen gewählt. </li><li> Medium sollte etwa geändert werden alle 3-4 Tage während der Kultur. </li><li> Während Co-Kultur der beiden Epithel-und Endothelzellen, Experimente in unserem Labor in der Regel erste Saat des Epithels für 4-8 Tage, während welcher Zeit die gezüchteten Gewebe belüftet ist. Das Endothel ist dann über Perfusion ausgesät, nach denen das Gewebe sowohl perfundiert und belüftet wird. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Dezellularisierung Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, sollte die frisch entnommenen Lungen Luft, ohne undicht zu halten. Aufblasen sie mit Luft, während in Flüssigkeit eingetaucht können dies - sollte es keine Blasen zeigt Leckagen werden. Die anschließende Dezellularisierung sollte es ~ 500ml Dezellularisierung Flüssigkeit zu fließen durch die Lunge im Laufe der 2,5 bis 3 Stunden bei 37 ° C, und PBS sollte letztlich in der Lage sein über die Lunge auf etwa 10 ml / min Durchfluss (unter ~ 15 mm Hg des hydrostatischen Drucks) am Ende der Spülung. Nach der Behandlung mit 0,1% Peressigsäure und Benzonase, kann in die Lunge bei 4 ° C für bis zu 3 Monate gelagert werden, und bleiben für recellularization geeignet. Die endgültige dezellularisierte extrazellulären Matrix sollten völlig frei von zellularen Werkstoffen und behalten die grobe, mikroskopische und ultrastrukturelle Eigenschaften der nativen Lunge. Unzureichende Dezellularisierung oder Spülen kann in Rest-DNA &quot;Kleben&quot; auf das Schafott, die visualisiert werden mit einer Standard-Hämatoxylin und Eosin-Färbung kann (siehe Abbildung 3 zum Vergleich) führen. Wiederbelegung von azelluläre Matrix und Kultur des Lungengewebes Wenn Zellen frisch aus 7 Tage alten Neugeborenen Rattenjungen, wie in der Online-Ergänzung beschriebenen begleitenden Arbeiten von Petersen und Kollegen 4 isolierte sind, kann man erwarten Zellausbeute von 120-150 Millionen Zellen pro Wurf von 10 Welpen (knapp über 10 Millionen Zellen pro Neugeborene). Optimale Bedingungen für die Zell-Aussaat und anschließende Kultur der Lunge in den Bioreaktor sollte gut verteilte Zellen innerhalb alle 5 Lungenlappen Ertrag, und sollte Abdeckung von ca. 70% der extrazellulären Matrix Gerüst (Abbildung 3) bieten. Die kultivierten Zellpopulation positiv sein wird für die wichtigsten Atemwege Zellmarkern wie pro-sekretorische Protein-C (SPC), Clara-Zelle sekretorischen Protein (CCSP) und Aquaporin-5 (AQP), in der Reihenfolge der relativen Häufigkeit (Abbildung 4). <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Kanülen Positionen und Dezellularisierung Bioreaktor <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Bioreaktor für die Aussaat und Kultur entwickelt Lungengewebe verwendet <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Histologie der native, dezellularisierte, und die Neuansiedlung von Lungenkrebs <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Immunfluoreszenzfärbung für Schlüssel Lunge Marker

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	<li>American Lung Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lung Disease Data. , (2008).</li><li>Petersen, T. H., Calle, E. A., Colehour, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+for+the+Long+Term+Culture+of+Lung+Tissue.">Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue.</a> Cell Transplant. , (2010).</li><li>Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+surface+tension+induced+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening.">Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).</li><li>Petersen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineerined+Lungs+for+in+Vivo+Implantation.">Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329, 538-5341 (2010).</li><li>Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat Med. 16, 927-9233 (2010).</li><li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation.">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (2010).</li><li>Sugihara, H., Toda, S., Miyabara, S., Fujiuyama, C., Yonemitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+alveolus-like+structure+from+alveolar+type+II+epithelial+cells+in+three-dimensional+collagen+gel+matrix+culture.">Reconstruction of alveolus-like structure from alveolar type II epithelial cells in three-dimensional collagen gel matrix culture.</a> Am J Pathol. 142, 783-7892 (1993).</li><li>Choe, M. M., Sporn, P. H., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+by+dynamic+strain+in+a+three-dimensional+tissue-engineered+human+airway+wall+model.">Extracellular matrix remodeling by dynamic strain in a three-dimensional tissue-engineered human airway wall model.</a> American Journal Respiratory Cell Molecular Biology. 35, 306-306 (2006).</li><li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-enginered+lung:+an+in+vivo+and+in+vitro+comparison+of+polyglycolic+acid+and+pluronic+F-127+hydrogel/somatic+lung+progenitor+cell+constructs+to+support+tissue+growth.">Tissue-enginered lung: an in vivo and in vitro comparison of polyglycolic acid and pluronic F-127 hydrogel/somatic lung progenitor cell constructs to support tissue growth.</a> Tissue Engineering. 12, 1213-1213 (2006).</li><li>Price, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Decellularized+Lung+Bioreactor+System+for+Bioengineering+the+Lung:+The+Matrix+Reloaded.">Development of a Decellularized Lung Bioreactor System for Bioengineering the Lung: The Matrix Reloaded.</a> Tissue Eng Part A. , (2010).</li><li>Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. 16, 814-820 (2010).</li><li>Shannon, J. M., Mason, R. J., Jennings, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+alveolar+type+II+epithelial+cells+in+vitro:+effects+of+cell+shape,+cell-matrix+interactions+and+cell-cell+interactions.">Functional differentiation of alveolar type II epithelial cells in vitro: effects of cell shape, cell-matrix interactions and cell-cell interactions.</a> Biochim. Biophys. Acta. 931, 143-156 (1987).</li><li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Acellular+Natural+Lung+Matrix+on+Murine+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation+and+Tissue+Formation.">Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation.</a> Tissue Eng Part A. , (2010).</li></ol>

LEN hat Bestand in Humacyte, ein Unternehmen der regenerativen Medizin. Humacyte nicht finanzieren diese Studien, und hatte keinen Einfluss auf die Gestaltung, Auslegung oder die Berichterstattung über jegliche der Experimente und Methoden beschrieben. Die Autoren (LEN, THP, EAC) und der Yale University haben eine Patentanmeldung in Bezug auf das Tissue Engineering von Lungen eingereicht.

Die wichtigsten Aspekte der hier vorgestellte System sind die Erhaltung der Sterilität und eine engmaschige Überwachung der Druck aufgebracht, um das Gefäßbett in den Prozess der Vorbereitung und Aussaat das Gerüst und die Kultivierung der neu besiedelt Lunge. Sterilität wird am besten durch Autoklavieren alle Materialien vor dem Gebrauch, und durch die Montage der Lunge in einem geschlossenen System kurz nach Explantation und die Vermeidung von späteren Verletzung dieser Barriere aufrechterhalten. Nach dem dezellularisierte Matrix hat gründlich gespült wurden und in einem sterilen Bioreaktor für Kultur, sollte die Silikonkappe und andere Dichtungen und Verbindungen nicht gestört oder entfernt werden. Um Druck in Schach, wird der Durchfluss durch die Schwerkraft angetrieben vorzuziehen, wenn möglich. Wenn eine Pumpe zur Rückführung von Flüssigkeit erforderlich ist, beginnt nach dem Spülen mit PBS-und Weiterbildung während der Kultur, empfehlen wir direkt den Druck kurz vor der Flüssigkeit der Lungenarterie mit einem Druckwandler eintritt. Die Größe der aufgebrachten Druck sollte nicht mehr als 15 mm Hg. Recellularized Lunge können für unterschiedliche Zeiträume, typischerweise im Bereich von 4 Tagen bis zu 3 Wochen kultiviert werden. Vascular Perfusion ist in der Regel bei 1-3 ml / min bei Endothelzellen Kultur erreicht, während Lüftung ist in der Regel mit einer Rate von 1 Atemzug / min bei epithelialen Kultur angewendet. Während kombiniert Kultur Zeiten, ist die gleichzeitige Ventilation und Perfusion angemessen. Lüftung kann entweder mit flüssigem Medium oder Luft durchgeführt werden. Im Laufe der letzten Jahrzehnte haben mehrere Gruppen wichtige Tissue Engineering Arbeit zeigt die Machbarkeit der Differenzierung Lungenepithel in vitro und der Replikation von mehreren Aspekten der Lunge Mikroanatomie 7,8,9, 10 getan. Doch bis vor kurzem hatte 4,5 keinem dieser Versuche Lungengewebe Ingenieur in einem implantierbaren Organ, das in der Lage, um die Trennung zwischen dem Blut und der Atemwege Fächer zu erhalten und das könnte in den Gasaustausch teilnehmen konnte geführt. Deshalb, obwohl die beschriebenen Methoden nur ein erster Schritt zur langfristigen Ziel der Erzeugung von funktionellen Lungengewebes sind, ist diese Arbeit ein ermutigender Schritt in Richtung der Möglichkeit der Erhöhung der Menge des Lungengewebes zur Verfügung zu verpflanzen. Darüber hinaus erarbeitet diese Arbeit Arbeit von Ott et al. Und Uygun und Kollegen 11,12 getan, was die Wirksamkeit eines dezellularisierte extrazellulären Matrix als Gerüst für das Tissue Engineering von komplexen dreidimensionalen Strukturen und unterstützt das Wachstum und Überleben der verschiedenen Arten von Zellen . Diese Arbeit ist auch für seinen Beitrag zum Rüstzeug der Atemwege Zell-und Molekularbiologen signifikant. Durch die Bereitstellung einer einzigartigen, dreidimensionalen Umgebung, die auch liefern können entsprechende mechanische Reize, und dass nicht teilt die damit verbundene Gefahr der schnellen Entdifferenzierung, dass man die beim Züchten Nagetier Epithel im Labor mit herkömmlichen Methoden 13, Wissenschaftler könnten unser System, um neue Einblicke in die Zell-Zell-und Zell-Matrix-Interaktionen eine Rolle spielen bei der Zelldifferenzierung und Funktion zu gewinnen. Dieses Wissen kann besonders leistungsfähig, wenn als Hebel benutzt, um das Schicksal der verschiedenen Stammzell-Populationen führen, wie Cortiella Gruppe in ersten Studien 14 gezeigt hat.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Sterbehilfe </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> Nitroprussidnatrium </td><td> Fluka </td><td> 71778 </td><td></td></tr><tr><td> Euthasol Euthanasie-Lösung </td><td> Virbac AH </td><td> 710101 </td><td> 390 mg / ml Pentobarbital-Natrium-Stammlösung sollten für IP Anwendung verdünnt werden </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell Lösung </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Amerikanischen Bioanalytische </td><td> AB01915 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Bioreaktor-Komponenten </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 480 ml Glas </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-3460560 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon-Stopfen, Größe 14 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-26 </td><td></td></tr><tr><td> Y-Stecker </td><td> Cole Parmer </td><td> ED-30614-08 </td><td> Wird für die arterielle und Trachealkanülen </td></tr><tr><td> Silikonschlauch </td><td> Masterflex </td><td> 96420-14, 16 </td><td> L / S 14, 16 </td></tr><tr><td> Druckaufnehmer </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX-212 </td><td></td></tr><tr><td> Rückschlagventil </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-98553-20 </td><td> Ein-Wege-Ventil </td></tr><tr><td> 4-Wege-Hähne </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 594WSC </td><td></td></tr><tr><td> Spritzenfilter </td><td> Cole Parmer </td><td> 2915-08 </td><td> PTFE, 0,2 um </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell und Spülen Apparaten (Ergänzungen Bioreaktor) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 und 1000 ml Glasflaschen </td><td> Corning </td><td> 1395-500;-1L </td><td> Wird für Decell und Spülen durch die Schwerkraft </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Benzonase Behandlung </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Amerikanischen Bioanalytische </td><td> AB14043 </td><td> 1M, pH 8,0 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> JT Baker </td><td> 2444-01 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> Sigma </td><td> E1014 </td><td> Endonuklease verwendet werden, um Rest-DNA von der Matrix zu entfernen </td></tr></tbody></table>

procedure for lung engineering

Lungengewebe, einschließlich Lungenkrebs und chronische Lungenerkrankungen wie chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung, kommen zusammen auf rund 280.000 Todesfälle pro Jahr; chronisch obstruktive Lungenerkrankung ist derzeit die vierthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten 1. Dazu trägt die Mortalität ist die Tatsache, dass Lunge in der Regel nicht reparieren oder regenerieren jenseits der mikroskopischen zellulären Ebene. Daher ist das Lungengewebe, die durch Degeneration oder Infektion oder Lungengewebe, die chirurgisch reseziert beschädigt ist funktionell nicht in vivo ersetzt. Um zu erforschen, ob das Lungengewebe in vitro erzeugt werden kann, behandelten wir Lungen von erwachsenen Ratten mit einem Verfahren, dass zelluläre Komponenten entfernt, um eine azelluläre Lunge extrazellulären Matrix Gerüst zu erzeugen. Dieses Gerüst behält die hierarchische Verzweigung Strukturen der Atemwege und Gefäßsystem sowie eine weitgehend intakte Basalmembran, die Kollagen IV, Laminin und Fibronectin enthält. Das Gerüst wird in einem Bioreaktor entwickelt, um kritische Aspekte Lungenphysiologie, wie Unterdruckventilation und pulsatile Gefäßperfusion imitieren montiert. Durch Kultivierung Lungenepithel und Gefäßendothel innerhalb des Bioreaktors montiert Gerüst sind wir in der Lage, Lungengewebe, die phänotypisch vergleichbar mit nativen Lungengewebe ist, und das ist in der Lage, in der Gasaustausch für kurze Zeitintervalle (45-120 Minuten) teilnehmen zu generieren. Diese Ergebnisse sind ermutigend und legen nahe, dass Wiederbesiedlung von Lungen-Matrix ist eine tragfähige Strategie für Lungen-Wiederbelebung. Diese Möglichkeit stellt eine Gelegenheit, nicht nur zur Erhöhung der Zufuhr von Lungengewebe zur Transplantation Arbeit, sondern auch die Atmungsorgane Zell-und Molekularbiologie in vitro über einen längeren Zeitraum und in einer genaueren Mikroumgebung als bisher möglich zu studieren.

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Procedure for Lung Engineering

Wir haben eine dezellularisierte Lunge extrazellulären Matrix und neuartige biomimetische Bioreaktor verwendet werden, um funktionelle Lungengewebe erzeugen können entwickelt werden. Durch Aussaat Zellen in die Matrix und die Kultivierung im Bioreaktor, generieren wir Gewebe, das effektive Gasaustausch zeigt, wenn in vivo für kurze Zeit transplantiert.

Vorgehensweise für Lung Technik

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

46.5K Aufrufe.  Yale University. Wir haben eine dezellularisierte Lunge extrazellulären Matrix und neuartige biomimetische Bioreaktor verwendet werden, um funktionelle Lungengewebe erzeugen können entwickelt werden. Durch Aussaat Zellen in die Matrix und die Kultivierung im Bioreaktor, generieren wir Gewebe, das effektive Gasaustausch zeigt, wenn in vivo für kurze Zeit transplantiert.

Serie: Procedure for Lung Engineering

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

Herstellung von biologisch abgeleiteten Injizierbare Materialien für Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Forschung

Biotechnik

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

Elastomer-PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Synthese von Keratin-basierten Nanofaser für Biomedizinische Technik

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Herstellung von Thermoresponsive nanostrukturierte Oberflächen für Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

Ein Protokoll für einem Maus Cochleae für das Innenohr Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Zwei Methoden zur Decellularization von Pflanzengewebe für Tissue-Engineering-Anwendungen

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...