Agradecemos a Maegan B. Colehour para ajudar com o desenvolvimento de biorreatores. Estes estudos foram financiados pela Yale University Departamento de Anestesia e pelo NIH conceder HL 098220 (para LEN). THP foi apoiado pelo NIH T32 GM007171.

1. Biorreator Assembléia Figura detalhada (s) do projeto de biorreatores e montagem tanto para decelularização e cultura são fornecidos nas Figuras 1 e 2, respectivamente. Todos os componentes devem ser esterilizados antes da montagem do biorreator. Os seguintes pontos específicos são observados: CONEXÕES: <ol><li> A cânula arterial é composto por um encaixe luer-lock ligado a um Y-divisor por um pequeno segmento de tubulação. O conector luer-lock está ligado ao tubo de perfusão, eo segmento do Y que não é suturada com a artéria pulmonar é conectado a uma válvula unidirecional. A válvula unidirecional é orientada de modo fluido que pode ser retirado para a tubulação (na direção oposta, como perfusão), mas durante toda a perfusão dos órgãos médio flui para o pulmão. </li><li> A cânula traqueal também consiste de um conector luer-lock ligado a um Y-divisor com tubulação. O luer-lock se conecta a um circuito de respiração entre o reservatório de traquéia e da câmara principal. O segmento do conector Y que não é suturado à traquéia também é conectado a uma válvula unidirecional. A válvula unidirecional é orientada da mesma forma como a cânula arterial. </li></ol> FUNÇÕES: <ol start="3"><li> As válvulas de sentido único nas cânulas arterial e traqueais são utilizados para limpar as bolhas de ar na tubulação, permitindo a inversão do fluxo na tubulação e, portanto, permitir bolhas de ar a ser removido. </li><li> O &quot;loop respiração&quot; inclui duas válvulas de sentido único, posicionado como meio que segue um caminho diferente dentro e fora do pulmão. Uma descrição mais detalhada desta funcionalidade é fornecida em uma publicação prévia do nosso 2 laboratório. </li><li> Perfusão vascular é fornecido utilizando uma bomba de rolete. Medium é perfundido na artéria pulmonar através da cânula em anexo, flui através da vasculatura pulmonar e as veias pulmonares diretamente no biorreator principal, onde meio é elaborado para perfusão. </li></ol> 2. Colheita de órgãos <ol><li> Euthanize adultos (3-6 meses de idade) ratos Fischer 344 por overdose de sódio pentobarbital, de acordo com diretrizes estabelecidas pela American Veterinary Medical Association (60 IP mg / kg). Nota: a solução pentobarbital inclui heparina de 100 unidades / ml para a anticoagulação. </li><li> Spray ou limpar o peito e abdômen com álcool 70%. </li><li> Abrir a cavidade torácica, expondo o coração e os pulmões, tomando cuidado para não danificar os pulmões. Fazer com cuidado uma pequena janela através do diafragma na cavidade torácica, causando os pulmões para retrair e expanda esta incisão horizontal para expor as bases dos pulmões. Faça duas incisões verticalmente através das costelas, e retrair a caixa torácica para expor o coração e os pulmões. </li><li> Preparar um sistema de perfusão gravidade, ou seja, utilizando uma seringa com êmbolo removido, uma torneira de 3 vias, e ~ 20 centímetros de tubo com um 1.5inch, agulha 21 gauge. Manter a seringa em ~ 20 centímetros acima do animal usando um suporte de anel. Assegurar que todo o ar é retirado o tubo de perfusão. </li><li> Corte o átrio direito para drenar sangue, impedindo-a de volta para os pulmões. Corte o átrio esquerdo para permitir a drenagem fácil de sangue e perfusato dos pulmões também pode ser útil, mas não é necessário. </li><li> Inserir a agulha na base do ventrículo direito e abra a torneira para perfundir os pulmões com uma solução de heparina e nitroprussiato de sódio (50U/ml e 1ug/ml, respectivamente) em PBS. Confirmar que a artéria pulmonar se enche com líquido de perfusão, e que o sangue é clearing dos pulmões. Se necessário, encher a seringa com líquido de perfusão adicional. Normalmente apenas 10ml ~ é necessária. </li><li> Continue perfusão até que os pulmões são claras de sangue, então pare de perfusão. </li><li> Dissecar o livre traquéia, até no pescoço, tanto quanto possível. Garantir a traquéia é separado do esôfago. Dissecar todas as conexões restantes para o coração, pulmões e traquéia, e remover em bloco. </li><li> Usando uma tesoura bisturi ou afiada, corte o ápice do coração, expondo os ventrículos direito e esquerdo. </li><li> Canular o tronco pulmonar através do ventrículo direito, e sutura no local. Remova qualquer excesso de tecido ventricular esquerda. </li><li> Canular a traquéia e sutura no local. Certifique-se que ambas as cânulas traqueais e pulmonares arterial estão posicionados de tal forma que não há força de torção na traqueia, pulmões ou grandes vasos (Figura 1). </li><li> Garantir que não há bolhas de ar na cânula arterial, uma vez que as bolhas de ar presas no sistema pode impedir o fluxo constante de através do órgão. Em alguns casos, uma bolha de ar pode parar completamente flow.To fluido conseguir isso, coloque o bloco do coração / pulmão em um frasco contendo PBS. Use uma seringa com agulha para injetar uma pequena quantidade de PBS para a cânula de coração para expulsar as bolhas. </li><li> Lavagem das vias respiratórias com PBS 4-5 vezes, para remover o ar, tanto quanto possível do pulmão. </li><li> Após o passo lavagems são completos, inflar o pulmão com PBS contendo nitroprussiato de sódio (SNP) em 1ug/ml. Coloque uma rolha na cânula traqueal, para que a solução permanece no pulmão. Permitir que o pulmão para incubar por até 30 minutos, a mesma solução flui através da vasculatura através da artéria pulmonar, para permitir a vasodilatação. </li><li> Conectar coração / pulmões para uma tampa de biorreator utilizando as conexões luer-lock ligado ao cânulas em forma de Y, descrito em &quot;Assembléia biorreator&quot; acima. (Figura 1). </li></ol> 3. Decelularização órgão <ol><li> Conecte a tampa (com pulmões ligados) aos aparelhos decelularização (Figura 1). A cânula da artéria pulmonar deve ligar para a linha de perfusão, ea cânula traqueal deve free float. Assegurar que todas as linhas são claras de ar. Como descrito acima, de ar nas linhas podem ser uma fonte de decelularização pobres, impedindo o fluxo de fluido decllularization. Ar preso no sistema pode também persistem no tempo da cultura, quando pode ter um impacto negativo sobre a sobrevivência da célula 3. </li><li> Inflar o pulmão com PBS / SNP até os pulmões estão cheios, mas não exageradas. Imediatamente tampa da cânula traqueal, para que o pulmão permanece inflado. </li><li> Perfundir pulmão com PBS / SNP por pelo menos 15 min a ~ 15 mmHg (20cm H 2 O de pressão). Depois de 15min ou mais, retire a tampa da cânula traqueal para permitir que o pulmão esvaziar. </li><li> Continue a perfusão com PBS / SNP por 30min. Se necessário, recarga PBS / SNP para garantir a pressão de perfusão é mantida em 10-15 mmHg. </li><li> Começar a perfusão com solução decelularização (CHAPS 8mm, 1M NaCl, 25mM EDTA em 1X PBS). Tome cuidado para garantir que todas as linhas são claras de ar. Um sistema de vácuo pode ser útil para fornecer sucção. </li></ol> Perfundir com solução decelularização até 500ml de solução tem perfundidos através do pulmão. Pressão ideal é &lt;15 mmHg (~ 20 cm H 2 O). Isso normalmente requer 2,5 horas. Taxas de fluxo são normalmente muito lento (0.2-0.5ml/minute) inicialmente, e aumentar rapidamente durante a segunda hora para cerca de 1ml/minute ou superior. Periodicamente, remover o líquido decelularização usado de biorreator, garantindo bastante líquido continua a apoiar o pulmão e cânula traqueal. 4. Órgão de lavagem e esterilização <ol><li> Transferência de pulmão e biorreator para uma capa de cultura de tecidos. Começar a lavagem com PBS estéril, removendo o frasco de 500ml que continha o líquido decelularização e substituir por um frasco estéril contendo até 1L de PBS estéril. Use sucção a vácuo para garantir linhas são claras de ar. </li><li> Perfundir PBS através da vasculatura de 15/10 mmHg, da mesma maneira como para decelularização. Periodicamente, remova os resíduos de PBS biorreator e substituir e / ou encher o frasco com PBS fresco, PBS estéril. É aconselhável o uso de técnica estéril. </li><li> Continuar a enxaguar até pelo menos 2,5 L de PBS estéril têm perfundidos no pulmão. </li><li> Transferência de pulmão para um novo sistema de biorreator, estéril, contendo PBS fresco. Assegurar que tanto o ciclo inteiro de perfusão e as linhas das vias aéreas todo são preenchidos com fluido. Todas as etapas subseqüentes será usar uma bomba pulsátil para perfundir pulmões na 5ml/min. </li><li> Esterilizar o cadafalso, quer através de perfusão durante a noite com PBS + 10% FBS + 10% de solução caneta strep ou por 3 horas com 0,1% de ácido peracético em PBS. Este último vai exigir a lavagem do pulmão com 3 mudanças de 250ml PBS durante várias horas para remover o ácido residual. Para cada lavagem, o pulmão deve ser ventilado, bem como perfundidos para garantir que todas as partes do tecido fiquem completamente lavados. </li><li> Transferência do pulmão para a 37 ° C incubadora e perfundir com PBS que tem 10% de SFB e 10% de penicilina / estreptomicina por ~ 1h ou até que a temperatura é equilibrado, em preparação para o tratamento benzonase. </li><li> Tratar de pulmão com benzonase para remover DNA remanescente: <ol><li> Aquecer o tampão benzonase (ver Tabela de Reagentes) a 37 ° C. </li><li> Para cada pulmão, encha uma seringa de 10 ml com tampão benzonase apenas e uma seringa de 10 ml com benzonase 90U/ml no buffer. </li><li> Parar perfusão do pulmão. </li><li> Inflar as vias aéreas com tampão benzonase. </li><li> Permitir que o pulmão esvaziar (por ~ 1 minuto). Então, encha o pulmão com a solução benzonase. Durante a inflação com tampão benzonase &amp; benzonase, para tentar evitar qualquer injeção de ar no pulmão. </li><li> Permitir que o pulmão se sentar sem perfusão ou ventilação a 37 ° C durante 1 hora após inflável com benzonase. </li></ol></li><li> Retomar a perfusão com o PBS + 10% FBS, 10% de penicilina / estreptomicina que já está no biorreator, e continuam durante a noite. No dia seguinte, o pulmão pode ser armazenado a 4 ° C (por até 3 meses) ou preparados para a semeadura de células. </li><li> Para preparar o andaime para repovoamento celular, substituir o PBS / SBF / benzonase solução com ~ 250ml de meio de cultura. Perfundir por pelo menos uma hora antes de as células são introduzidas, umand substituir com meio de cultura fresco directamente antes de as células semeadura. </li></ol> 5. Recellularization A escolha da fonte de células para reseeding órgão é deixada para os investigadores individuais. Muitas fontes de células podem ser utilizadas, incluindo as populações disponíveis comercialmente, recém-isoladas neonatal ou fetal células pulmonares, células-tronco embrionárias, ou fontes de células disponíveis comercialmente. Protocolos de isolamento específico para estas populações de células pode ser encontrada em outros lugares 4,5,6. Aqui, nós fornecemos instruções sobre como semente de ambas as populações de células endoteliais e epiteliais. Semeadura endotelial: <ol><li> Prepare uma suspensão de população de células endoteliais desejado, em meio de cultura apropriado. Suspensão de células do filtro através de um filtro para remover células 40um aglomerados de células. A semeadura típico endotelial em nosso laboratório poderia utilizar cerca de 30 milhões de pulmão de ratos células endoteliais microvasculares em 60ml de meio de cultura. </li><li> Dispense suspensão de células em um pequeno reservatório temporariamente incorporadas ao circuito de perfusão do biorreator (Figura 2). Garantir que a tubulação a partir deste reservatório e do laço de perfusão inteiro é claro de bolhas de ar. </li><li> Infundir células na artéria pulmonar em 3ml/min usando uma bomba de rolete. </li><li> Após a infusão de células, continue perfusão com meio recirculado do biorreator principal na taxa desejada. </li><li> Em uma base diária, garantir que o tubo de perfusão é claro de bolhas de ar. </li><li> Médio deve ser substituído por meio fresco regularmente, o que muitas vezes é feito a cada 3-4 dias. </li></ol> Semeadura epiteliais: <ol><li> Prepare uma suspensão de células da população de células epiteliais desejado. Em nosso laboratório, isso normalmente é composto por cerca de 5-10 células de rato neonatal pulmonar. Filtrar a população através de peneira de células 40um e suspender em 15ml de meio de cultura em uma seringa. Encher o reservatório das vias aéreas com 80ml de meio de cultura. </li><li> Coloque o biorreator de 37 ° C a cultura de tecidos incubadora, e ligar a bomba de seringa para ventilação. Assegurar que todas as linhas de ventilação são claras de ar. <ol><li> Semente das células para o pulmão através da injeção de 15ml de suspensão celular como um bolus único na cânula traqueal. </li><li> Começar imediatamente uma respiração única e lenta usando a bomba de seringa. Esta respiração é administrado pela retirada de 60ml de ar do biorreator principal no 3ml/minute, portanto, com duração de aproximadamente 20 minutos. Garantir os filtros de ar no biorreator principais são tampados imediatamente após a injeção da suspensão celular e antes de começar a respiração lenta. </li></ol></li><li> Permitir que os pulmões para sentar-se estaticamente por cerca de 18hrs, e então começar a perfusão vascular lento (aproximadamente 0,5 ml / min). </li></ol> 6. Cultura de órgãos Embora os detalhes da perfusão e ventilação varia de acordo com desenho experimental, os seguintes pontos são observados: <ol><li> Durante a cultura endotelial, a perfusão é tipicamente realizada em 1-3 ml / min usando uma bomba de rolete. Durante a cultura epitelial, a ventilação é geralmente fornecida a uma taxa contínua de uma respiração por minuto usando uma bomba de seringa. Retirada de 5 10ml de ar do biorreator principal é normalmente necessário para efetuar a ventilação pulmonar em um volume normal de maré. Devido à necessidade de manter o hermético biorreator durante a ventilação, a ventilação deve ser pausada diária e do ar na câmara principal deve ser trocada. Todo o ar no sistema é ar ambiente, que é aproximadamente 21% de oxigênio por pressão parcial. A retirada 5 10ml de ar do biorreator (que induz uma inspiração 5-10ml de fluido pelo pulmão) é baseado no tamanho do pulmão e quantos lobos estão sendo cultivados (lobos pode ser amarrado para análise, enquanto o lobos restantes continuam na cultura). A quantidade de ar retirado pela bomba de seringa é escolhido para aproximar o &quot;volume corrente&quot; do pulmão cultivadas. </li><li> Médio deve ser alterado aproximadamente a cada 3-4 dias durante a cultura. </li><li> Durante a co-cultura do epitélio e endotélio, as experiências em nossa semente de laboratório primeiro tipicamente o epitélio por 4-8 dias, durante os quais o da engenharia de tecidos é ventilado. O endotélio é então semeado através de perfusão, após o qual o tecido é tanto perfundidos e ventilado. </li></ol> 7. Resultados representativos: Decelularização Quando o protocolo é realizado corretamente, os pulmões recém-extraídos deve segurar o ar, sem vazamento. Inflando-os com ar ao mesmo tempo submerso em líquido pode verificar isso - não deve haver quaisquer bolhas, indicando vazamento de ar. A decelularização subseqüentes devem permitir ~ 500ml de líquido decelularização a fluir através dos pulmões ao longo de 2,5 - 3 horas a 37 ° C, e PBS deve finalmente ser capaz de fluir através dos pulmões em cerca de 10 ml / min (em ~ 15 mm Hg de pressão hidrostática) no final da lavagem. Após o tratamento com 0,1% de ácido peracético e benzonase, os pulmões podem ser armazenados a 4 ° C por até 3 meses, e ainda permanecem adequados para recellularization. A matriz extracelular decelularizado finais devem ser completamente desprovido de materiais celulares, e manter as características brutas, microscópicos e ultra-estruturais de pulmão nativo. Decelularização insuficiente ou de lavagem podem resultar em remanescente DNA &quot;degola&quot; para o cadafalso, que podem ser visualizados com um padrão hematoxilina e eosina (veja a Figura 3 para comparação). Repovoamento da matriz acelular e cultura de tecido pulmonar Se as células são recém isoladas de sete dias de idade os filhotes de rato neonatal, conforme descrito no suplemento on-line que acompanha o trabalho de Petersen e colaboradores 4, pode-se esperar um rendimento de células de 120-150 milhões de células por ninhada de 10 filhotes (pouco mais de 10 milhões células por recém-nascido). Condições ideais para a semeadura de células e cultura subseqüente do pulmão no biorreator deve render bem distribuídos em todas as células cinco lobos do pulmão, e deve fornecer uma cobertura de aproximadamente 70% da matriz extracelular andaime (Figura 3). A população de células cultivadas será positivo para os principais marcadores de células respiratórias, como a secretora pró-proteína C (SPC), proteína secretora Clara celular (CCSP), e aquaporina-5 (AQP), em ordem de abundância relativa (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Posições Cânulas e biorreator decelularização <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Biorreator utilizado para plantio e cultura de tecido pulmonar de engenharia <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Histologia de natal, decelularizado e repovoada pulmão <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Coloração de imunofluorescência para os marcadores de pulmão chave

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LEN possui ações da Humacyte, uma empresa de medicina regenerativa. Humacyte não financiar esses estudos, e não afetar o design, a interpretação, ou o relato de qualquer uma das experiências ou métodos descritos. Os autores (LEN, THP, EAC) e Yale University entraram com um pedido de patente relacionada à engenharia de tecidos dos pulmões.

Os aspectos mais críticos do sistema aqui apresentado incluem a manutenção da esterilidade, e acompanhar de perto as pressões aplicadas ao leito vascular em todo o processo de preparação e semeando o andaime e cultura do pulmão repovoada. Esterilidade é melhor mantida em autoclave todo o material antes do uso, e pela montagem do pulmão em um sistema fechado logo após explante e evitar violação posterior desta barreira. Após a matriz decelularizado foi cuidadosamente lavado e transferido para um biorreator estéril para a cultura, a tampa de silicone e outras vedações e conexões não deve ser perturbado ou removidos. Para manter sob controle as pressões, o fluxo impulsionado pela força da gravidade é preferível sempre que possível. Quando uma bomba é necessária para a recirculação do líquido, com início após lavagem com PBS e continuando durante a cultura, recomendamos medir diretamente a pressão um pouco antes o fluido entra na artéria pulmonar, com um transdutor de pressão. A magnitude da pressão aplicada não deve exceder 15 mm Hg. Recellularized pulmões podem ser cultivadas por períodos variáveis ​​de tempo, normalmente variando de 4 dias para até 3 semanas. Perfusão vascular é normalmente realizado em 1-3 ml / min durante a cultura endotelial, enquanto a ventilação é normalmente aplicado a uma taxa de 1 respiração / min durante a cultura epitelial. Durante os períodos da cultura combinado, ventilação e perfusão simultânea é apropriado. Ventilação pode ser feita com qualquer meio líquido ou ar. Ao longo da últimas décadas, diversos grupos têm feito um trabalho de engenharia de tecidos importantes mostrando a viabilidade de diferenciação epitélio pulmonar in vitro e de reproduzir vários aspectos do pulmão microanatomia 7,8,9, 10. No entanto, até recentemente, nenhum 4,5 dessas tentativas de engenheiro de tecido pulmonar resultou em um órgão implantáveis ​​que foi capaz de manter a separação entre o sangue e os compartimentos das vias aéreas e que poderiam participar em troca de gás. Portanto, embora os métodos descritos são apenas um primeiro passo em direção à meta de longo prazo de geração de tecido pulmonar funcional, este trabalho é um passo encorajador para a possibilidade de aumentar a quantidade de tecido pulmonar disponíveis para transplante. Além disso, este trabalho elabora trabalho realizado por Ott et al. Uygun e 11,12 e colegas, demonstrando a eficácia de uma matriz extracelular decelularizado como um andaime para engenharia de tecidos tridimensionais complexas estruturas e apoiar o crescimento ea sobrevivência de vários tipos de células . Este trabalho também é significativo por sua contribuição ao arsenal de células respiratórias e biólogos moleculares. Ao fornecer um único, ambiente tridimensional que pode também dar o devido estímulo mecânico, e que não compartilha o perigo de atendimento rápido de diferenciação que se pode encontrar ao epitélio cultura de roedores em laboratório com métodos mais tradicionais 13, os cientistas poderiam usar nosso sistema de ganhar uma nova visão sobre célula-célula e célula-matriz interações que desempenham um papel na diferenciação celular e função. Este conhecimento pode ser particularmente poderosa, se usado como alavanca para orientar o destino de populações de células-tronco diferentes, como grupo Cortiella tem demonstrado em estudos iniciais 14.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Eutanásia </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> Nitroprussiato de sódio </td><td> Fluka </td><td> 71778 </td><td></td></tr><tr><td> Euthasol solução eutanásia </td><td> Virbac AH </td><td> 710101 </td><td> 390 mg / ml solução estoque pentobarbital sódica devem ser diluídos de forma adequada para a administração IP </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell Solution </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> AB01915 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Componentes biorreator </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 480 ml jar </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-3460560 </td><td></td></tr><tr><td> Rolha de silicone, tamanho 14 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-26 </td><td></td></tr><tr><td> Y-conectores </td><td> Cole Parmer </td><td> ED-30614-08 </td><td> Usado para cânulas arterial e traqueal </td></tr><tr><td> Tubo de silicone </td><td> Masterflex </td><td> 96420-14, 16 </td><td> L / S 14, 16 </td></tr><tr><td> Transdutores de pressão </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX-212 </td><td></td></tr><tr><td> Válvula de retenção </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-98553-20 </td><td> Válvula unidirecional </td></tr><tr><td> 4-way torneiras </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 594WSC </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de filtro </td><td> Cole Parmer </td><td> 2915-08 </td><td> PTFE, 0,2 Hm </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell e apparati lavagem (adições ao biorreator) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 e 1000 ml de vidro de garrafas </td><td> Corning </td><td> 1395-500;-1L </td><td> Usado para decell e lavagem pela gravidade </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Tratamento Benzonase </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> AB14043 </td><td> 1M, pH 8,0 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> JT Baker </td><td> 2444-01 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> Sigma </td><td> E1014 </td><td> Endonuclease usado para remover restos de DNA a partir da matriz </td></tr></tbody></table>

procedure for lung engineering

Tecido pulmonar, incluindo câncer de pulmão e doenças pulmonares crônicas, como doença pulmonar obstrutiva crônica, cumulativamente conta para alguns 280.000 mortes anualmente, doença pulmonar obstrutiva crônica é atualmente a quarta causa de morte nos Estados Unidos 1. Contribuem para esta mortalidade é o fato de que os pulmões não costumam reparar ou regenerar além do nível, microscópicos celular. Portanto, o tecido do pulmão que está danificado pela degeneração ou infecção, ou tecido pulmonar, que é cirurgicamente ressecados não é funcionalmente substituído in vivo. Para explorar se o tecido pulmonar pode ser gerado in vitro, nós tratamos os pulmões de ratos adultos usando um procedimento que remove componentes celulares para produzir uma matriz extracelular do pulmão acelular andaime. Este andaime mantém as estruturas hierárquicas de ramificação das vias aéreas e vasos, bem como uma membrana basal intacta, que compreende colágeno IV, laminina, e fibronectina. O andaime é montado em um biorreator projetado para imitar os aspectos críticos do pulmão da fisiologia, como a ventilação de pressão negativa e perfusão vascular pulsátil. Por epitélio pulmonar e cultura endotélio vascular dentro do biorreator andaime montado, somos capazes de gerar tecido pulmonar que é fenotipicamente comparável ao tecido pulmonar nativa e que é capaz de participar em troca de gás para intervalos de tempo curtos (45-120 minutos). Estes resultados são encorajadores e sugerem que o repovoamento do pulmão matriz é uma estratégia viável para a regeneração de pulmão. Essa possibilidade apresenta uma oportunidade não só para trabalhar para aumentar a oferta de tecido pulmonar para transplante, mas também para o estudo de células respiratórias e biologia molecular in vitro por longos períodos de tempo e em um microambiente mais preciso do que foi previamente possível.

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Procedure for Lung Engineering

Nós desenvolvemos uma matriz extracelular e de pulmão decelularizado biorreator romance biomimético que pode ser usado para gerar tecido pulmonar funcional. Por semeadura de células na matriz e cultura no biorreator, geramos tecido que demonstra a troca gasosa eficaz quando transplantadas in vivo por curtos períodos de tempo.

Procedimento para a Engenharia de pulmão

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

46.5K visualizações.  Yale University. Nós desenvolvemos uma matriz extracelular e de pulmão decelularizado biorreator romance biomimético que pode ser usado para gerar tecido pulmonar funcional. Por semeadura de células na matriz e cultura no biorreator, geramos tecido que demonstra a troca gasosa eficaz quando transplantadas in vivo por curtos períodos de tempo.

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Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Bioengenharia

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS elastomérico Andaimes em Engenharia de Tecidos Arterial

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Processamento de pós-produção de Fibras electrospun para Engenharia de Tecidos

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Síntese de nanofibras baseado em queratina de Engenharia Biomédica

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Preparação de Thermoresponsive nanoestruturados Surfaces para Engenharia de Tecidos

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

Um protocolo para Decellularizing Cochleae Mouse para engenharia de tecidos do ouvido interno

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Dois métodos para Decellularization de tecidos vegetais para aplicações de engenharia de tecidos

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...