0315741: Biz Bu çalışma Eğitim ve Araştırma (BMBF) projesi Sanal Karaciğer Alman Federal Bakanlığı tarafından desteklenen Şekil 1&#39;de oluşturulmasında desteklerinden dolayı Jia Li Liu teşekkür etmek istiyorum.

Not: Tüm hücreler birincil ya da ikincil karaciğer tümörlerinde parsiyel karaciğer rezeksiyonu sonra kalan rezeke olmayan tümörlü insan karaciğer dokusu, izole edilmiştir. Universitätsmedizin Berlin - hastaların aydınlatılmış onam Charité etik kurallarına göre elde edilmiştir. Malzemelerin ve Çözümleri 1. Hazırlık <ol><li> izolasyon işlemi sırasında bakteri kontaminasyonu önlemek için önceden tüm enstrümanları ve malzemeleri sterilize edin. </li><li> Taze hazırlanmış Sindirime Çözüm hariç olmak üzere, karaciğer doku numunesi, hepatositler ve non-parenkimal karaciğer hücrelerinin izolasyonu işlemi ve Tablo 1 ve 2&#39;ye göre birincil insan karaciğer hücreleri yetiştirme perfüzyon için gerekli çözümler hazırlanması kullanımdan önce. Bütün çözeltiler 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir ve hazırlandıktan sonra 4 hafta içinde kullanılması önerilmektedir. </li><li> sterilize etmek0.22 mikron şişe üst filtre kullanarak tüm çözümleri. </li></ol> Perfüzyon Ekipman 2. Hazırlık <ol><li> Şekil 1A gösterildiği gibi karaciğer doku örneğinin perfüzyon ve sindirim için donatım ayarlayın. </li><li> perfüzyon ve sindirim sırasında optimum kollajenaz P aktivitesini sağlamak için 39 ° C&#39;ye kadar su banyosu sıcaklığını ayarlayın. </li></ol> Karaciğer Doku Örneği 3. perfüzyon ve Sindirim (1.5 saat) <ol><li> rezeke karaciğer dokusundan dokunulmamış Glisson kapsülü bir doku numunesi seçin. Doku örneği keserken, iyi görünür damarlar ile küçük bir kesme yüzeyi elde etmek için deneyin. taşınması ve perfüzyon kadar buz üzerinde karaciğer doku örneği ele alarak sıcak iskemi süreleri kaçının. </li><li> steril koşullar altında, doku ağırlığı alın ve laminer hava akışının bir Petri kabındaki karaciğer doku numuneyi. yeniden steril bir kompres ile doku örneğinin yüzeyini temizleyinkan isti ve tüm kanül geçirgen olmasını sağlamak için 1x Perfüzyon-Çözüm kullanıyorum kanül seti yıkayın. </li><li> Bazı büyük kan damarlarında kanüller zeytin düzeltmek için doku yapıştırıcısı kullanın. Karaciğer doku numunesi uzunluğuna ve yüzeyde damarların sayısına bağlı olarak, 3 ila 8 kanüllü ayarlanmış bir kanül kullanın. perfüzyon test ve sızıntı olup olmadığını kontrol edin. doku yapıştırıcısı ile net 1x Perfüzyon-Çözüm I sızıntısı tüm yakın kan damarları. </li><li> Kendi delikli bir filtre diski (Şekil 1a) Buchner hunisi içine kanüle karaciğer doku numunesi yerleştirin. </li><li> 7.5 ml / dak ve ikinci kanül sayısına ve karaciğer dokusunda direncine bağlı olarak 14.6 ml / dk peristaltik pompa akış hızını ayarlayın. bir akım ama yavaş perfüzyon orada olduğundan emin olmak için akış hızı her zaman ayarlayın. tam kan dışarı atılırlar ama en azından 20 dk kadar doku serpmek. İyi perfusi olan alanlarda daha parlak hale doku gözlemlemeküzerinde. Not: Bazı durumlarda, plastik parçaları ile kanüller bir kelepçe gerekli olabilir ya da perfüzyon optimize etmek için, karaciğer kapsülünün karşı bir spatula ile hafifçe iterek bir alan iç basıncı artırmak için. açık kahverengimsi renkte açık sarı için tam bir renk değişikliği iyi perfüzyon gösterir. </li><li> Kollajenaz P (Tablo 1) içeren Sindirim-Çözüm perfüzyon sıvısını değiştirin. </li><li> Sindirim adımı için kurulum (Şekil 1A) yeniden düzenleyin. Bu nedenle, en fazla 15 dakika süreyle Şekil 1B uyarınca Sindirime Çözüm dairesel bir akış yapar. Not: karaciğer doku numunesi yeterince sindirilir zaman hemen perfüzyon durdurmak için kritik öneme sahiptir. İyi bir sindirim bir spatula ile itildiğinde, kapsül deformasyonların bakımı ile değerlendirilen doku elastikiyeti belirtisi gösterdiğinde, görülebilir. </li></ol> Hepatositlerin 4. izolasyonu (1 saat) <ol><li> Trahatsız peristaltik pompa urn bir cam tabak içinde karaciğer doku numuneyi. Buz Stop çözeltisi (Tablo 1), doku numunesi dışında yıkayın. karaciğer doku örneğinden kanüller çıkarın. kanüller bağlanmıştır alanının ortasında incising, karaciğer doku örneği açmak için bir neşter kullanın. Glisson&#39;s kapsül sağlam kalır dikkat tutun. </li><li> doku örneğinin içini durulayın ve sonra buz soğuk Dur-Çözüm ile tüm doku örneği kapsamaktadır. doku dışarı hücreleri serbest bırakmak için hafifçe doku sallayın. </li><li> hücre süspansiyonu toplamak ve 50 ml plastik tüplere bir bakış hunisi (gazlı kompres ile kaplı plastik huni) aracılığıyla filtre. 500 ml&#39;lik bir nihai hacim tüketilene kadar, karaciğer doku numunesi daha Stop çözeltisi ilave edilir. </li><li> 50 x g&#39;de, 5 dakika, 4 ° C &#39;de bir hücre süspansiyonu santrifüj. Daha sonra olmayan parankimal hücre izolasyonu için süpernatant toplayın. PBS (Şekil 2 hücre pelletini yıkayınA). </li><li> 50 x g&#39;de, 5 dakika, 4 ° C sıcaklıkta tekrar hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatant toplayın ve Hepatosit Kuluçka ortamı pelet (Tablo 2, Şekil 2B) yeniden askıya. </li><li> Tripan mavi boya ile elde edilen hücre süspansiyonu, hücre sayısı ve canlılığı belirler. Bir Neubauer sayım odasında canlı ve ölü hücreleri saymak. Aşağıdaki formüller kullanılarak PHH hücre sayısı, canlılığı ve verim hesaplayın. hücre süspansiyonu (ml) verimi (hücreler sayılır) = sayılan hücre x seyreltme faktörü x hacim 10.000 x Verim (hepatositler / (g karaciğer doku örneği)) = (hücre süspansiyonu (mi) verimi (hepatositler / (ml ortamı)) x hacim) / (karaciğer doku numunesinin ağırlığı (g)) canlılığı (%) =% 100 x (canlı hücre sayısı) / (toplam hücre sayısı) </li></ol> Hepatositlerin 5. saflaştırma (1 saat) Not: canlılığı, bu saflaştırma aşaması önerilir% 70 daha düşüktür. <ol><li> Buz üzerinde tüm adımları uygulayın. 5 mi yoğunluk gradyan çözeltisi ve yoğunluk dereceli santrifüj 15 ml PBS karıştırılarak% 25 yoğunluk gradient hazırlayın. </li><li> Her iki tabakada arasında net bir ayrım (Şekil 2C) elde edilmesini sağlamak için% 25 yoğunluk gradyan tabakanın üzerine dikkatli bir şekilde yavaş yavaş, hepatosit zengin hücre süspansiyonu üzerinden toplam 50 Milyon hücre fazla koyun. 1250 xg, 20 dakika, frensiz 4 ° C (Şekil 2B) de santrifüj ve santrifüj içine dikkatlice tüpleri koyun. </li><li> Kalan hücre süspansiyonu ve interfaz ölü hücreleri aspire. yağ içeriği biri bağlı da yoğunluk gradyan-çözüm aspire olabilir. Not: PHH düşük lipit içerikli yoğun pelet ve yoğunluk gradyan tamamen aspire edilebilir oluştururlar. yüksek lipit içerikli PHH pelet yukarıdaki yoğunluk gradyan çözeltisi içinde kalabilir, daha yaygın pelet ve canlı hücrelerin bir sürü oluşturur. </li><li>50 xg, 5 dakika, 4 ° C&#39;de tekrar PBS ve santrifüj ile hepatosit pelet yeniden askıya. pelet Havuz, PBS ile tekrar yıkayın ve Hepatosit Kuluçka ortamında saflaştırılmış PHH yeniden askıya. Adım 4.6 açıklandığı gibi hücre sayımını yapın. </li></ol> Hepatositlerin 6. Yetiştirme <ol><li> Örnek fare kuyruk kolajeni (kolajen tip I), bir hücre-dışı matris ile kaplanarak PhH tohumlanmasından hücre kültür kaplarına hazırlayın. Rajan ve arkadaşları tarafından kurulan protokole göre sıçan kuyruğu kollajen hazırlayın. 17 </li><li> sıçan kuyruğu kollajen stok solüsyonu 1 seyreltilir: 200 PBS içinde. Tüm yüzeyi kaplı kültür kaplarına transferi 100 ul / cm 2 sıçan kuyruğu kollajen çözüm, dikkat çekici. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hücre kültürü plastik inkübe edin. Kalan sıçan kuyruğu kollajen çözüm aspire. </li><li> Kültür dishe ilgili Hepatosit inkübasyon ortamı içinde tohum 15 x 10 4 hepatositler / cm2fare kuyruk kolajeni ile kaplanmış s. En az 4 saat süreyle 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde hücrelerin kültive edilmesi. 4 saat sonra hepatositler yapıştırılır ve orta değiştirilebilir. </li><li> deney düzeneği bağlı soruşturmaları gerçekleştirin. 48 saat bir kültür süresi hücreleri izolasyon sürecinden kurtarmak için izin önerilir. </li></ol> Sigara parankimal karaciğer hücrelerinin 7. izolasyonu (1.5-2 saat) <ol><li> Santrifüj 72 x g&#39;de, 5 dakika, 4 ° C &#39;de toplanan süpernatan (aşama 4,5 4.6) geri kalan eritrosit ve hepatositleri elemek için kullanılan. süpernatantlar havuzu ve iki hücre pelletleri elde etmek için iki kez santrifüj: 300 xg, 5 dk, HSC, LEC ve kısmen KC 650 xg, 7 dakika, kalan KC çökmesi için 4 ° C sedimantasyon 4 ° C. </li><li> Havuz topakları hem HBSS onları yeniden askıya. % 25 ve yoğunluk gradyan Santrifüj için karıştırma yoğunluk gradyan çözeltisi ve PBS tarafından% 50 yoğunlukta renk geçişlerini hazırlayınugation (% 25 yoğunluk gradyan çözeltisi: 5 mi yoğunluk gradyan çözeltisi ve 15 ml PBS,% 50 yoğunluk gradyan çözeltisi: 10 mi yoğunluk gradyan çözeltisi ve 10 ml PBS, bakınız Şekil 2). % 50 yoğunluk gradyan çözeltisi tabakanın üzerine dikkatli bir şekilde% 25 yoğunluk gradyan çözeltisi yerleştirin. </li><li> Her iki tabakada arasında net bir ayrım elde edilir şekilde% 25 yoğunluk gradyan çözeltisi tabakanın üzerine dikkatli bir şekilde yavaş yavaş NPC süspansiyon koyun. </li><li> Santrifüj 1800 xg, 20 dakika, frensiz 4 ° C (Şekil 2.2) yoğunluk gradyanı üzerinde hücre süspansiyonu. </li><li> Aspire ölü hücreler ve üst tabakadan hücre enkaz. NPC% 25 ve% 50 yoğunluk gradyan tabaka (Şekil 2) arasında arayüz içinde yer almaktadır. HBSS ve santrifüj ile yukarıda açıklanan çift santrifüj adımı uygulayarak hücre süspansiyonu yıkayın, NPC toplayın (adım 7.2.). </li></ol> Kupffer hücrelerinin 8. Ayırma (bağlılıkAyırma Aşaması) (1 saat) <ol><li> Adım 4.6 açıklandığı gibi NPC fraksiyonu KC için bir hücre sayımı gerçekleştirin. (Süspansiyon KC&#39;nin görünüm için Şekil 3B). Santrifüj, yukarıda tarif edilen çift santrifüj leme, aşama (aşama 7.2) NPC Kupffer hücre ekim ortamı (Tablo 2) yeniden askıya NPC fraksiyonu. </li><li> 5 x 10 5 KC / cm2 &#39;lik bir yoğunlukta plastik hücre kültür kaplarına KC içeren fraksiyonu tohumu. 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 20 dakika için KC kültürleri inkübe,% 5 CO2. İlköğretim KC kısa bir süre (Şekil 2.3) içinde hücre kültürü plastik üzerine yapışır. </li><li> başta LEC ve HSC oluşan değil yapıştırılır NPC içeren süpernatant toplayın. LEC sonraki ayrılması için süpernatantlar Havuz (bölüm 9) ve HSC (bakınız bölüm 10). HBSS ile yapışık KC yıkayın ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO de Kupffer hücre kültür aracı maddesi (Tablo 2) &#39;de onları yetiştirmekNemli bir kuluçka makinesi içinde 2. </li></ol> Endotel Hücreleri 9. Ayırma (1.5 saat) <ol><li> Santrifüj 300 x g&#39;de 5 dakika, 4 ° C &#39;de toplanan süpernatan (aşama 8,5).. PBS ile pelet yıkayın. 300 x g&#39;de 5 dakika, 4 ° C Stellat hücre / endotel hücre ayırma ortamı hücrelerin yeniden askıya ve adım 4.6 de tarif edildiği gibi geri kalan hücreler için bir hücre sayımı gerçekleştirmek santrifüjlemeden sonra. </li><li> Immunolabeling için Mac-kitinden bloke etme çözeltisi 20 ul ve CD31 Micro Beads 20 ul, 1 ml Stellat hücre / endotel hücre ayırma ortamı içinde, 1 x 10 7 Mio hücrelerin yeniden askıya ve 4 ° C&#39;de 15 dakika için sonuçtaki süspansiyon inkübe ° C sıcaklık (Şekil 2.4). </li><li> Manyetik aktif hücre sıralama sistemi MACS (Şekil 2.5) için imalatçının protokol açıklandığı gibi HSC ayırın LEC. manyetik muhafaza CD31-pozitif LEC Zehir ve Stellate C askıyaell / endotel hücre kültür ortamı (Tablo 2). </li><li> Adım 4.6 açıklandığı gibi LEC için sayma hücre gerçekleştirin. 1.25 x 10 5 hücre fare kuyruk kolajeni ile kaplanmış hücre kültürü damarlarda / cm2 yoğunluğunda Tohum LEC (adım 6.1). Nemli bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 de hücrelerin kültive edilmesi. </li></ol> Stellat Hücreleri 10. Ayırma (0.5 saat) <ol><li> Etiketsiz HSC MACS işlemi sırasında ayırma sütunu geçmektedir. HSC fraksiyonu (Şekil 2.5 adım 9.5) toplayın. Adım 4.6 açıklandığı gibi hücre sayımını yapın. </li><li> Fare kuyruk kolajeni ile kaplanmış hücre kültür kaplarında 5 x 10 4 hücre / cm2&#39;lik bir yoğunlukla tohum HSC Stellat hücre / endotel hücre kültür ortamında (Tablo 2) (aşama 6.1) ve 37 ° C&#39;de,% 5 onları yetiştirmek nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde CO2. </li></ol><img alt= &quot;Tablo 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53069 / 53069table1.jpg&quot; /&gt; Tablo 1: Perfüzyon ve izolasyon çözümü. <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" /> Tablo 2: Kültür ve izolasyon ortamı.

<ol>
	<li>Pfeiffer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+cultivation+of+human+hepatocytes+and+non-parenchymal+liver+cells.">Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells.</a> Exp Biol Med. , (2014).</li><li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+and+development+of+the+liver.">Organogenesis and development of the liver.</a> Dev Cell. 18 (2), 175-189 (2010).</li><li>Alpini, G., Phillips, J. O., Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+isolation+of+liver+cells.">Recent advances in the isolation of liver cells.</a> Hepatology. 20 (2), 494-514 (1994).</li><li>Godoy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+2D+and+3D+in+vitro+systems+using+primary+hepatocytes,+alternative+hepatocyte+sources+and+non-parenchymal+liver+cells+and+their+use+in+investigating+mechanisms+of+hepatotoxicity,+cell+signaling+and+ADME.">Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1315-1530 (2013).</li><li>G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., Castell, J. V., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocytes--the+choice+to+investigate+drug+metabolism+and+toxicity+in+man:+in+vitro+variability+as+a+reflection+of+in+vivo.">Hepatocytes--the choice to investigate drug metabolism and toxicity in man: in vitro variability as a reflection of in vivo.</a> Chem Biol Interact. 168 (1), 30-50 (2007).</li><li>Ginai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+bioreactors+as+in+vitro+models+in+pharmaceutical+research.">The use of bioreactors as in vitro models in pharmaceutical research.</a> Drug Discov Today. 18 (19-20), 922-935 (2013).</li><li>Schyschka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+3D+cultures+but+not+2D+cultures+preserve+specific+transporter+activity+for+acetaminophen-induced+hepatotoxicity.">Hepatic 3D cultures but not 2D cultures preserve specific transporter activity for acetaminophen-induced hepatotoxicity.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1581-1593 (2013).</li><li>Kostadinova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+three+dimensional+liver+co-culture+system+for+improved+prediction+of+clinically+relevant+drug-induced+hepatotoxicity.">A long-term three dimensional liver co-culture system for improved prediction of clinically relevant drug-induced hepatotoxicity.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 268 (1), 1-16 (2013).</li><li>Messner, S., Agarkova, I., Moritz, W., Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-cell+type+human+liver+microtissues+for+hepatotoxicity+testing.">Multi-cell type human liver microtissues for hepatotoxicity testing.</a> Arch Toxicol. 87 (1), 209-213 (2013).</li><li>Nussler, A. K., Nussler, N. C., Merk, V., Brulport, M., Schormann, W., Yao, P., Hengstler, J. G., Santin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Holy+Grail+of+Hepatocyte+Culturing+and+Therapeutic+Use.">The Holy Grail of Hepatocyte Culturing and Therapeutic Use.</a> Strategies in Regenerative Medicine. , 1-38 (2009).</li><li>Friedman, S. L., Roll, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hepatic+lipocytes,+Kupffer+cells,+and+sinusoidal+endothelial+cells+by+density+gradient+centrifugation+with+Stractan.">Isolation and culture of hepatic lipocytes, Kupffer cells, and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan.</a> Anal Biochem. 161 (1), 207-218 (1987).</li><li>Knook, D. L., Blansjaar, N., Sleyster, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Kupffer+and+endothelial+cells+from+the+rat+liver.">Isolation and characterization of Kupffer and endothelial cells from the rat liver.</a> Exp Cell Res. 109 (2), 317-329 (1977).</li><li>Alabraba, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+isolation+and+culture+of+human+Kupffer+cells.">A new approach to isolation and culture of human Kupffer cells.</a> J Immunol Methods. 326 (1-2), 139-144 (2007).</li><li>Friedman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+hepatic+lipocytes+and+Kupffer+cells+from+normal+human+liver:+morphological+and+functional+characteristics+in+primary+culture.">Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional characteristics in primary culture.</a> Hepatology. 15 (2), 234-243 (1992).</li><li>Lalor, P. F., Lai, W. K., Curbishley, S. M., Shetty, S., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+can+be+distinguished+by+expression+of+phenotypic+markers+related+to+their+specialised+functions+in+vivo.">Human hepatic sinusoidal endothelial cells can be distinguished by expression of phenotypic markers related to their specialised functions in vivo.</a> World J Gastroenterol. 12 (34), 5429-5439 (2006).</li><li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure.">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cot&#233;, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li><li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells+from+mouse+liver.">Isolation and culture of hepatic stellate cells from mouse liver.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 46 (4), 291-298 (2014).</li><li>Zeng, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+to+isolate+and+culture+rat+kupffer+cells.">A new method to isolate and culture rat kupffer cells.</a> PLoS One. 8 (8), e70832 (2013).</li><li>Tokairin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+isolation+of+rat+sinusoidal+endothelial+cells+by+the+immunomagnetic+bead+method+using+SE-1+monoclonal+antibody.">A highly specific isolation of rat sinusoidal endothelial cells by the immunomagnetic bead method using SE-1 monoclonal antibody.</a> J Hepatol. 36 (6), 725-733 (2002).</li><li>Damm, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cell+isolation,+culture+and+characterization.">Human parenchymal and non-parenchymal liver cell isolation, culture and characterization.</a> Hepatology International. 7, 915-958 (2013).</li><li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+from+livers+rejected+for+liver+transplantation+on+a+national+basis:+results+of+a+2-year+experience.">Isolation of human hepatocytes from livers rejected for liver transplantation on a national basis: results of a 2-year experience.</a> Liver Transpl. 9 (5), 506-512 (2003).</li><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li><li>Gerlach, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+isolation+of+sinusoidal+endothelial+cells+from+pig+and+human+liver.">Large-scale isolation of sinusoidal endothelial cells from pig and human liver.</a> J Surg Res. 100 (1), 39-45 (2001).</li></ol>

The authors declare that they have no competing interests.

yayınlanan protokol aynı zamanda insan karaciğer dokusunda aynı örnekten yüksek kalitede ve saflıkta, saf PHH ve NPC, yani KC, HSC ve LEC izole etmek için bir yöntem açıklanır. Karaciğer hücre izolasyonları ile ilgili yayınlar çoğunluğu sadece insan dokusu ile gerçekleştirildi, bu hücre popülasyonu 18-20 ve izolasyon prosedürlerinin biri 21 (Damm ve ark., Tarafından) nadirdir kapsamaktadır. İnsan karaciğer hayvan dokusu (örneğin, sıçan karaciğer) i...

İnsan karaciğer dokusu son derece karmaşık ve iki farklı hücre varlıklar, parankimal hücreler ve non-parankimal hücreler (NPC) oluşur. Parenkimal karaciğer hücreleri hepatositleri ve cholangiocytes bulunmaktadır. Hepatositler toplam karaciğer hücrelerinin 60 70% temsil eden ve metabolik karaciğer fonksiyonlarının çoğu için hesap, örneğin, safra asidi ve faktör sentezi, metabolizma ve enerji metabolizmasını 2,3 tamamlayacak. Daha küçük NPC fraksiyonu toplam karaciğer hücrelerinin% 30-40 oluşturmaktadır. NPC farklı hücre popülasyonlarının, yani Kupffer hücreleri (KC), karaciğer endotel hücrelerini (LEC) ve hepatik stellat hücreler (HSC) içerir. Bu heterojen hücre fraksiyonu karaciğer fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar. Buna ek olarak, NPC örneğin ilaç kaynaklı karaciğer hasarı (Dili) ve kronik karaciğer yaralanması, siroz 4 gibi akut karaciğer hasarı, aracılık katılabilir. Son yıllarda, Human karaciğer hücreleri karaciğer hastalıklarında daha önemli araştırma ve ilaç testleri, ilaç geliştirme ve yeni bir biyokimyasal yolların belirlenmesi gelişiminde olmuştur. İn vitro testler için PHH monokültürleri, hala &quot;altın standart&quot; olarak kabul edilmektedir 5. Mevcut homotipik karaciğer modellerinde ana sınırlama birkaç gün 4 içinde farksızlaşma ve hepatositler fonksiyon kaybıdır. 3 boyutlu (3D) kültür teknikleri saptanması, bu sınırlama 4,6 telafi edilebilir olduğunu göstermiştir. Ancak, hatta modern 3D kültür teknikleri eylemlerin 7&#39;nin tüm hepatotoksik modlarını görüntülemek mümkün değildir. Mevcut in vitro modellerde eksik NPC popülasyonları in vivo duruma Bu farklılığın olası bir nedeni olarak tartışılmıştır. Aynı zamanda pathophy farklı karaciğer hücre popülasyonları arasında hücre-hücre iletişim fizyolojik homeostazında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştirsiologic 8 işler. Bu nedenle bilimsel ilgi NPC ve hücre-hücre etkileşimleri üzerinde daha fazla duruluyor. Ko-kültür ve doku mühendisliği sistemlerindeki maksatlı kullanım mümkün olduğunca in vivo duruma kadar yakın, in vitro karaciğer modellerinin 8,9 yüksek talep için bir çözüm olabilir. Şu anda temel zorluk PHH ve NPC açıkça tanımlanmış bölümlerini içeren standart bir insan karaciğeri ko-kültür modeli, geliştirilmesidir. Sonuç olarak, çok heterojen karaciğer hücreleri için izolasyon teknikleri gerekli ve bu saf hücre popülasyonlarının kazanmak için optimize edilmiş olması vardır. PHH izolasyonu için standart protokoller 10 varken, insan NPC standartlaştırılmış izolasyon hala geliştirilme aşamasındadır. En yayınlanan NPC izolasyon protokolleri olmayan insan hücreleri 11,12 ile deneylere dayanmaktadır. Sadece birkaç yayınlar insan NPC izolasyon işlemini açıklar ve çoğu sadece kapakTek bir hücrenin izole edilmesi için yöntemler 11-16 yazın. Hücre ayrılması için kullanıldı edilmiştir en önemli hücre özelliklerinin boyutu, yoğunluğu, bağlanma davranışı ve yüzey proteinleri ifadesidir. Bu özellikleri temelinde biz Deneysel Biyoloji ve Tıp 1 daha önce yayımlanan PHH, KC, LEC ve HSC, izole etmek basitleştirilmiş bir protokol geliştirmiştir. Çünkü bu teknikle geniş ilgi, bu makalenin amacı daha kolay tekniği üreten sağlayacak bir videoda da dahil olmak üzere karaciğer hücre izolasyon işlemi için daha ayrıntılı bir protokol sağlamak oldu. Protokol de verim ve canlılığının değerlendirilmesi için ve belirli immunostainings kullanılarak kimlik ve saflık değerlendirmesi için bir kalite kontrol yöntemleri içerir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="886">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">General Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:293px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PIPETBOY</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CO2-incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamin Air</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge Varifuge 3.0R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urine Beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>2041101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">perfusor syringe 50 ml</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>12F0482022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bottle Top Filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>1058787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Culture plate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>533047</td>
			<td>24 well</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">serological pipettes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>357525, 357551, 357543</td>
			<td>25 ml, 10 ml, 5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pipette tips</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td>
			<td>100 &#181;l, 200 &#181;l, 1000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isolation Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">water bath</td>
			<td>Lauda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">peristaltic pump</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">circulation thermostat</td>
			<td>Lauda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter</td>
			<td>Schott</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fine scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B&#252;chner funnel</td>
			<td>Haldenwanger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">plastic funnel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">silicone tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cannulae with olive tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glass dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>12068760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>Optic Labor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cell lifter</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Drape</td>
			<td>Charit&#233; Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td>A2013027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">compress</td>
			<td>Fuhrmann</td>
			<td>40013331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sterile surgical gloves</td>
			<td>Gammex PF</td>
			<td>1203441104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue glue</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glass bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td>Roche</td>
			<td>13349524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll Separating Solution</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L6145</td>
			<td>Density 1.124 g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s BSS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H00911-3938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#8217;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15 - 002</td>
			<td>without Mg/Ca</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampuwa</td>
			<td>Plastipur&#160;</td>
			<td>13CKP151&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,064,041,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>49,361,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes Pufferan&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>133196836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Media Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-005</td>
			<td>Low Glucose (1 g/l) (without L-Glutamine)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>1135546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM NEAA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15 - 039</td>
			<td>without L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>1137663</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">William&#8217;s E&#160;&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>32551-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">with GlutaMAX&#8482;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03780-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fortecortin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>49367</td>
			<td>8 mg/2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human-Insulin</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td>100 I.E./ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipment for Immunostainings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD 68</td>
			<td>R&#38;D Systems, USA</td>
			<td></td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK 19</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>D2309</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK18</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>K2105</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td></td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GFAP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>23.472-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse IgG1-PE</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>C0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-rabbit IgG-FITC</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>L0412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1104509006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 4%</td>
			<td>Herbeta Arzneimittel</td>
			<td>200-001-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells

paren-kimal hepatositlerden yanında, karaciğer dışı parankimal hücreler (NPC), yani Kupffer hücreleri (KC), karaciğer endotel hücreleri (LEC) ve hepatik yıldız şeklinde hücreler (HSC) oluşur. Birincil insan hepatosit (PHH) iki boyutlu (2D) kültürü hala ilaç metabolizması ve hepatotoksisite in vitro test için &quot;altın standart&quot; olarak kabul edilmektedir. Bu PHH 2D monokültür, farklılaşmadan ve fonksiyon kaybına uğrar çok iyi bilinmektedir. Son zamanlarda karaciğer NPC karaciğer (pato-) fizyoloji merkezi bir rol ve PHH fonksiyonları bakım oynadığı gösterilmiştir. Mevcut araştırma 2D monokültürlere sınırlamaları aşmak için 3B ve ko-kültür modellerinde in vivo doku mimarisinin yeniden odaklanır. Daha önce insan karaciğer hücreleri izole etmek için bir yöntem yayınlanmıştır ve Deneysel Biyoloji ve Tıp 1 hücre kültürlerinde kullanımları için bu hücrelerin uygunluğunu incelenmiştir. Bu te geniş ilgi dayalıBu yazının amacı chnique bu tekniğin kolay bir üreme sağlayacak bir videoda da dahil olmak üzere karaciğer hücre izolasyon işlemi için daha ayrıntılı bir protokol sağlamak oldu. Insan karaciğer hücreleri, iki aşamalı bir EGTA / kolajenaz P perfüzyon tekniği ile cerrahi müdahalelerin insan karaciğer doku örneklerinden izole edilmiştir. PHH 50 x g bir ilk santrifüj ile NPC ayrılmıştır. Yoğunluk gradyan santrifüj adımları ölü hücrelerin çıkarılması için kullanılmıştır. Bağımsız karaciğer hücre popülasyonları özel hücre özellikleri ve hücre sıralama prosedürleri kullanarak zenginleştirilmiş NPC fraksiyondan izole edilmiştir. PHH izolasyon yanında biz daha fazla ekimi için KC, LEC ve HSC ayırmak için başardık. Birlikte ele alındığında, sunulan protokol bir donör doku örneğinden yüksek kalite ve miktar PHH ve NPC izolasyonu sağlar. Saflaştırılmış karaciğer hücre popülasyonlarının erişim insan li gibi in vivo oluşturulmasına izin verebilirver modelleri.

yapışma özellikleri ve MACS kullanımı ile birlikte temizlik prosedürü olarak yoğunluk gradyan santrifüj kullanarak bir parankimal ve non-parankimal fraksiyonu içine ayrılık, başarılı PHH ve NPC izolasyona yol açar. PHH ve NPC yüksek kalite ve miktarda izole edilebilir. 1 karaciğer perfüzyon ve sindirim için ekipman temsilcisi kurulumunu göstermektedir. proteazlar proteolitik aktivitesini azaltmak ve karşılığında kolajenaz p akti...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells at JoVE.com

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

protocol-for-isolation-primary-human-hepatocytes-corresponding-major

Research

JoVE Journal

Biology

36.8K Görüntüleme.  Charité University Medicine Berlin. A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Video: Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

Nötrofil İzolasyon Protokolü

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Biyoloji

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Klonal Genişleme CD133 + Karaciğer Kök Hücre İzolasyonu

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Primer Sıçan Hepatositlerinin Çok Parametreli Perfüzyon Kontrolü ile İzolasyonu

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

In vitro Hastalık Modellemesi için İnsan Primer Kapak Hücrelerinin İzolasyonu

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...