Yazarlar son birkaç yıl boyunca onun her zaman mükemmel teknik yardım için Bayan Meike Schaffrinski teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma ortak araştırma grubu 942 (FOR942) içinde Alman Araştırma Kurumu (DFG) aracılığıyla ve Tıp Fakültesi, Georg-August Üniversitesi Göttingen Araştırma Programı tarafından finanse edildi.

Steril insan AB serumu hazırlanması 1. <ol><li> Taze donmuş plazma (TDP) 4-5 çanta toplayın. -20 ° C&#39;de saklayın torbaları yeterince çanta toplanıncaya kadar. </li><li> Çanta çözülme ve tamamlayıcıyı inaktive ve fibrin çıkarmak için bir su banyosu içinde 56 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. </li><li> İyice torbaların dış dezenfekte ve 50 ml&#39;lik tüplere için plazma aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüje çökeltilerin ve artık trombositlerin kurtulmak için. </li><li> Tüm Süpernatantlar havuzu ve pelet atın. </li><li> Serum kısım 15 ml tüpler içinde, örnekler ve mağaza -20 ° C&#39;de ilave edildi. Not: Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen ısı ile inaktive edilmiş normal insan AB serumu kullanılabilir. </li></ol> Monositler 2. izolasyonu Santrifüj dengelenmesini sağlamak için, iki paralel ince beyaz kat işleme sokulması tavsiye edilmektedir. Bununla birlikte, ca almakhücrelerin karışımı her donör için farklı malzemeler kullanmak olup yeniden. Durumda, ince beyaz kat kolayca elde edilemez, heparinize edilmiş periferal kan 400 mi yerine kullanılabilir. <ol><li> Dikkatle buffy kat içeren plastik torba dezenfekte ve iki 50 ml&#39;lik tüplere her buffy coat içeriğini aktarmak. </li><li> Her buffy coat boyunca 15 ml Ficoll çözeltisi (1.077 g / ml) ile üç adet 50 ml tüpler doldurun. Ficoll hazırlanması için oda sıcaklığında olmalıdır. </li><li> Katman ilk yoğunluk gradyanı için Ficoll çözeltisinin üzerinde çok ince beyaz tabaka kan 30-35 mi. Her iki katmanları karıştırma önlemek için yavaş ve dikkatli bunu yapmak için dikkatli olun. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca fren yapmadan 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Her bir gradyan için bir 50 ml tüp plastik bir Pasteur pipeti ve transfer ile, iki faz arasında yer alan, periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), beyaz halka toplar. </li><li> Toplam 40 ml&#39;ye kadar PBS EDTA (1 mM) ile, her bir tüp doldurun. </li><li> Oda sıcaklığında frensiz 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Süpernatant aspire ve 40 ml PBS-EDTA (1 mM) ile, tekrar pelet yıkayın. </li><li> Her bir vericinin bir havuz için, fenol kırmızı +% 10 FCS olmaksızın, 20 ml RPMI-1640 içinde peletler. </li><li> İkinci yoğunluk gradyanı için izo-ozmotik bir Percoll çözeltisi hazırlayın: iki donör 23.13 mi Percoll çözeltisi karışımı için (yoğunluk: 1.131 g / ml), 50 ml bir tüp içinde 10 ml ile 1.87-kat PBS ile yıkandı. Sonra yeni bir 50 ml&#39;lik tüpe Bu çözeltinin 23 ml sevk ve% 46 izo-ozmotik bir Percoll çözeltisi elde etmek üzere fenol kırmızı +% 10 FCS ile 27 mi RPMI-1640 ekleyin. Percoll hazırlanması için oda sıcaklığında olmalıdır. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüpe hazırlanan Percoll çözeltisi her defasında 25 mi verici transferi için ve Percoll çözeltisi üzerine 2.9 hazırlanan çözelti PBMC) tabakası. Çok yavaş bir bunu yapmak için dikkatli olund dikkatle, her iki tabaka kolayca karıştırmak için eğilimindedir. Eğer doğru yapılırsa iki faz nedeniyle renk onların farkı ayırt edilebilir. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca fren yapmadan 550 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Her bir gradyan için bir 50 ml tüp plastik bir Pasteur pipeti ve transfer ile, iki faz arasında yer alan monositlerin beyaz halka toplar. </li><li> Toplam 50 ml&#39;ye kadar PBS EDTA (1 mM) ile, her bir tüp doldurun. </li><li> Oda sıcaklığında frensiz 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Süpernatan aspire ve fenol kırmızı +% 10 FCS, 20 ml RPMI-1640 içinde tekrar süspansiyon pelet. </li></ol> Makrofajlar monositlerin 3. Farklılaşma <ol><li> Tripan mavisi 1:10 seyreltme izole monosit sayısını belirler. Sadece monositlerdir büyük, genellikle düzensiz şekilli hücreler, saymak. Lebfositleridir küçük, yuvarlak şekilli hücreler sayılmaz. NOT: Monosit sayılar sadece hücrelerin farklılaşması için kullanılacak kaç FEP Teflon kaplı olan (küçük veya büyük) çantalar hakkında bir ipucu verir, çünkü çok doğru bir tespit gerekmez. </li><li> Bir donörden 1,0-1,5 8 x 10 monositler için, büyük bir FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torbaya hücreleri tohum. Her bir torba malzeme için 174 ml RPMI 1640 (Bölüm 1&#39;deki gibi hazırlanan),% 2 insan AB serumu,% 1 penisilin / streptomisin, ve 2.5 ng / ml M-CSF (180 mL toplam hacim) &#39;den oluşan bir kültür ortamı hazırlar. <ol><li> Bir donörden 3.0-5.0 x 10 7 monositler için, küçük bir Teflon kaplı bir hücre kültürü torbaya hücreleri tohum. Her bir torba için kültür ortamı, 28.5 mi RPMI-1640 (Bölüm 1&#39;deki gibi hazırlanan),% 2 insan AB serumu,% 1 penisilin / streptomisin, ve 2.5 ng / ml M-CSF (30 ml toplam hacim) &#39;den oluşan hazırlar. NOT: örneğin, 8.0 x 10 7 monositler elde edilirse, biz tw onları tohum tavsiye4.0 x 10 7 hücreleri her biri O küçük hacimli torba. Bunun yerine M-CSF, monositler alternatif olarak aynı konsantrasyonda (2.5 ng / ml), granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile ayırt edilebilir. </li></ol></li><li> Hazırlanmış ortamın hücre süspansiyonu (20 mi) ilave edin ve iyice karıştırın. Iki torba tek bir donörden alınmış ise, hücre süspansiyonu, 20 ml RPMI-1640 ekleyin ve daha sonra her bir orta hazırlanması süspansiyonun yansının eklenmesi. </li><li> İsteğe bağlı: monosit preparasyonu, steril kalırsa, belirlemek için, kan agar plakası üzerine, hücre süspansiyonunun bir damla gözyaşı ve 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe etmek. </li><li> FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torbanın tıpası üzerine şırınga Perfüzör 50 ml kılıfı Sıkma ve hazırlanan hücre süspansiyonu ile doldurun. </li><li> Şırınga çıkarın ve çanta dışarı kalan havayı itin. Bir kapanış koni ile çanta kapatın. </li><li> 37 ° C&#39;de 6-7 gün boyunca çanta inkübe76,% 5 CO2 ile soğutuldu. </li></ol> 4. Makrofaj Hasat <ol><li> Hücrelerin ayrılmasına (en fazla 3 saat mümkün bir enkübasyon) sağlamak için en az 1 saat boyunca buz üzerinde farklı makrofajları ile FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torba yerleştirin. Torbanın bütün yüzeyi buzla kaplı olduğundan emin olun. </li><li> Bir masa / kurulu kenarına minimal basınç 10x ile çanta çekin. </li><li> Dikkatlice torbanın dışında dezenfekte ve kapanış koni çıkarın. </li><li> Torbanın tıpa üzerindeki bir 50 ml şırınga Sıkma, hücre süspansiyonu çıkarın ve 50 ml&#39;lik tüplere aktarın. </li><li> Hücreleri yavaşlamalarını, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatan aspire ve toplam 10 ml RPMI-1640 +% 10 FCS içinde bir torba elde edilen taneler bir araya getirirler. </li><li> Bir hemositometrede hücre sayısını belirlemek (1: 4-1: tripan mavisi 10 seyreltme). Sadece büyük yuvarlak hücreleri saymak. Not: FEP teflonlanmış torbalarda makrofajları ayırt edilmesinden sonra, artık hücreler verici ve monosit izolasyon kalitesine bağlı olarak, lemfositler, örneğin olabilir. </li><li> FEP Teflon kaplı bir çanta tekrar kullanmak için, kalan hücrelerin çıkarılması için% 70 etanol ile iki kere yıkayın. 50 mL% 70 etanol ile doldurun ve bir gece boyunca inkübe edilir. Çanta, steril PBS ile 3 kez sterilizasyon kağıdı sarılmasıdır, ve standart prosedürler kullanılarak bir otoklav içinde sterilize yıkayın. NOT: Hücre kültürü çanta makrofaj verimlerinde herhangi bir kayıp olmadan birkaç kez tekrar edilebilir. Ancak, biz onlar sızıntı başlamadan önce 10 kullandıktan sonra çanta atmak için karar verdi. </li><li> RPMI-1640 +% 10 FCS ve sonraki deneyler için kültür makrofajlar. Daha düşük serum konsantrasyonları gerekli olması halinde,% 1 FCS ile RPMI-1640 içinde kültür da mümkündür. Tohum ve 3-4 saat inkübe hücreleri. Bu dönemden sonra, hücre kültürü makrofajlar çanağının yüzeyine bağlamak dikkatHerhangi bir bulaşık hücreleri (örneğin eritrosit, lenfositler ve dendritik hücreler) süspansiyonu kalır. Yapışmayan hücreleri çıkarmak için PBS ile en az iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> Daha fazla deneyler için hücre kültürü çanak kültüre makrofajlar ayırmak için, yüzeyi dikkatlice onları kazıyın. Alternatif olarak, buz üzerinde 20 dakika süre ile inkübe yemekler kültür ortamı aspire, ve 1 ml enzimsiz hücre ayrışma tamponunu ilave edin. 37 ° C de 5 dakika inkübasyondan sonra, aşağı doğru en az 3 dakika boyunca 4 mL PBS ekleyin ve pipetleme hücreleri ayırmak ve. </li></ol>

<ol>
	<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496, 445-455 (2013).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Adaptive+Immunity+by+the+Innate+Immune+System.">Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).</li><li>Lionakis, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1-dependent+renal+macrophage+survival+promotes+Candida+control+and+host+survival.">CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival.</a> J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).</li><li>Blumenthal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wingless+homolog,+WNT5A+and+its+receptor+Frizzled-5+regulate+inflammatory+responses+of+human+mononuclear+cells+induced+by+microbial+stimulation.">The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation.</a> Blood. 108, 965-973 (2006).</li><li>Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome-derived+IL-1+beta+production+induces+nitric+oxide-mediated+resistance+to+Leishmania.">Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania.</a> Nat Med. 19, 909-915 (2013).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).</li><li>Subramanian, V., Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+inflammation,+and+macrophages.">Obesity, inflammation, and macrophages.</a> Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).</li><li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+atherosclerosis:+a+dynamic+balance.">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).</li><li>Pradere, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+macrophages+but+not+dendritic+cells+contribute+to+liver+fibrosis+by+promoting+the+survival+of+activated+hepatic+stellate+cells+in+mice.">Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice.</a> Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).</li><li>Danciger, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+large+scale+isolation,+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis,+cellular+adhesion+assays,+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation.">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).</li><li>Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria-induced+TNF-alpha+and+IL-10+formation+by+human+macrophages+is+differentially+regulated+at+the+level+of+mitogen-activated+protein+kinase+activity.">Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity.</a> J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).</li><li>Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cultures+of+Human+Blood-Borne+Macrophages+Grown+on+Hydrophobic+Teflon+Membranes.">Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes.</a> J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+bone+marrow+in+the+teflon+culture+bag:+identification+of+the+human+monoblast.">Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast.</a> Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+human+monocytes+cultured+in+the+Teflon+culture+bag.">Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag.</a> Immunology. 47, 617-625 (1982).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization:+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression.">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+macrophage+heterogeneity.">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).</li><li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10.">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li><li>Tushinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Mononuclear+Phagocytes+Depends+on+a+Lineage-Specific+Growth-Factor+That+the+Differentiated+Cells+Selectively+Destroy.">Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy.</a> Cell. 28, 71-81 (1982).</li><li>Rietkotter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+acid+inhibits+macrophage/microglia-assisted+breast+cancer+cell+invasion.">Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion.</a> Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).</li><li>Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Markers+that+Distinguish+Monocyte-Derived+Fibrocytes+from+Monocytes,+Macrophages,+and+Fibroblasts.">Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts.</a> Plos One. 4, E7475 (2009).</li><li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions.">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> Plos One. 7, e42656 (2012).</li><li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques.">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li><li>Chernykh, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+and+properties+of+human+M2-like+macrophages:+potential+candidates+for+CNS+repair?.">The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair?.</a> Cell Ther Transplant. 2, (2010).</li><li>Verreck, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IL-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+IL-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+(myco)bacteria.">Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+5a+signaling+is+critical+for+macrophage-induced+invasion+of+breast+cancer+cell+lines.">Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).</li><li>Hagemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+induce+invasiveness+of+epithelial+cancer+cells+via+NF-kappa+B+and+JNK.">Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK.</a> J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).</li><li>Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5A/CaMKII+signaling+contributes+to+the+inflammatory+response+of+macrophages+and+is+a+target+for+the+antiinflammatory+action+of+activated+protein+C+and+interleukin-10.">Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10.</a> Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması var gibi ifşa hiçbir şey yok.

Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir efektör hücrelerdir ve immün, antijen sunumu ve doku homeostazında önemli fonksiyonları gösterir. Nedeniyle olağanüstü plastiklikleri, onların fenotip değişiklikleri ile farklı uyaranlara yanıt edebiliyoruz. Makrofaj markerlerinin polarizasyon sadece yaklaşık% 50 doğrudan insan 16 fareden tercüme edilmesi için kullanıldığını gösteren raporlar mevcuttur Ancak, her ne makrofaj polarizasyon ilişkin verilerin kadar çok, fare sisteminde elde edilmiştir. Bu nedenle, pahalı bir malzeme, örneğin, MACS manyetik boncuk ya da karşı akım santrifüj sivili ayrıştırma cihazına gerek olmadan burada, yeterli sayıda ve saflıkta primer insan makrofajlarını elde etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Önerilen yöntem, PBMC monositlerin izolasyonu ve FEP-makrofajlar için kendi sonra gelen değişim göre, düşük Conce varlığında, hücre kültürü çanta Teflon kaplıM-CSF 11-13 ntrations. Monositler uyarılması üzerine, insanlarda en az 5, periferik kan lökosit% 10&#39;a kadar yapmak da onlar vücut dokularında makrofajlar ve dendritik hücreler 17 için ayırt periferik bölgelerine kişi etüde dahil edilir. Sitokin M-CSF monosit hayatta kalması için önemli olduğu ve makrofajlar 18,19 kendi farklılaşma sürer. Şimdiye kadar, monosit farklılaşması için seçilen M-CSF konsantrasyonu ancak, protokolde sadece 2.5 ng / ml bir 12 M-CSF konsantrasyonu ile olgun makrofajlara yeterli sayıda elde edilmesi mümkün, 100 ng / ml kadar olan erim , 20. Buna ek olarak, hücreler, makrofajların dekolmanı ve belirli hücre sayıları ve bunların daha sonradan ekim kolaylaştırmak FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torba kültürlenmiştir. Çanta birkaç kez tekrar edilebilir için bu daha da izolasyon işlemi için maliyetlerini azaltmaktadır. Bu prosedür ile elde edilen makrofajlarCD45, CD14, CD11b, CD11c&#39;nin için son derece olumlu ve saf, olgun makrofaj 21,22 nüfus için savunuyor mannoz reseptör CD206 ifadesini göstermektedir. Özellikle yüksek bir CD14 ekspresyonu M-CSF 23 varlığında farklılık makrofajlar için tipiktir. Diğer bir kızarmış yumurta fenotip sergileyen ise, hücrelerin, tohumlamadan sonra, bunlar tipik bir mil benzeri morfoloji gösteren bazı hücrelerde, plastik yüzeyler için hızlı bir yapışma göstermezler. Bu Diğer yazarlar 18,22,24 gelen gözlemlerle uyumludur. Daha sonra M-CSF varlığında monosit farklılaşma, M2-polarize makrofajlar 16,25 neden olduğu bildirilmiştir. Ancak, protokol ile izole edilmiş makrofajlar oldukları programlarını ve indüksiyon ile tepkimeye yine tümör hücreleri 26,27 veya LPS&#39;ye maruz kalan tümör hücresi türevli microvesicles ve ko-kültür maruz de dahil olmak üzere çok geniş bir uyarı aralığına cevap verebilmektedir , IL-1 &amp; gibi inflamatuar genlerin946. ;, TNFa, Wnt5a, veya M1-polarize makrofajlar 3,5,28 için tipik sayılan çeşitli matris metaloproteinaz. Sonuç olarak, teknik olarak zor veya pahalı prosedürler için gerek kalmadan çifte yoğunluk gradyanı ile santrifüjleme ve makrofaj yüksek sayıda FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torba sonuçlar makrofaj yönelik sonra gelen değişim ile monositlerin izolasyonu. Elde edilen makrofajlar tümör hücreleri ile birlikte-kültür, LPS birlikte klasik aktivasyonu arasında değişen bir sonraki analiz için kullanılabilir.

Makrofajlar - - monositik soy ve terminal olarak farklılaşmış hücreler türevi, gelişme, doku tamiri ve bağışıklık 1 gibi çeşitli süreçlerinde yer yol biyolojik işlevi açısından çarpıcı bir plastisite sergiler. Ikincisi kendi fagositik ve doğal ve adaptif immün yanıtı 2 arasındaki kavşakta makrofajlar yerleştirir antijen sunan yeteneği nedeniyle. Ancak, özelliği sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri, diğer sinyal molekülleri ve salgılamak için 1, bağışıklık-modüle edici bir fonksiyonu artmakta, fakat aynı zamanda ek işlevler için bir temel olarak hizmet etmekle kalmamakta,. M1 ve M2 kategoride 3 sonuçlanmıştır non-mikrobiyal kaynaklı durumların bağlamında, bu çeşitli etkinleştirme adımlarını ayna dener. Bu sınıflandırma tam değil iken, makrofaj biyolojisinde temel bir anlaşılmasına olanak vermektedir. Bu çok yönlü yetenekleri nedeniyle bu makrofajlar bir şekilde doku değişiklikleri veya inflamasyon dahil pek çok koşul ile ilişkili olması sürpriz olarak gelir. Işgalci patojenlere 4-6 tanınması ve temizlik onların temel rolünün yanında, makrofajlar giderek ateroskleroz, fibrozis, obezite ve kanser 7-10 odak haline gelmiş. Insan makrofaj üretimi için bir yöntem, yeniden üretilebilir, bu patolojilerin anlaşılması için çok önemlidir. Burada, daha önce tarif edildiği gibi 11, çift yoğunluk gradyan santrifüj yöntemi ile sağlıklı donörün periferal kanından insan monositlerinde izolasyonu dayanan bir yöntem sunulmaktadır. Makrofaj farklılaşması doğru kolaylaştırmak için, izole edilmiş monositik hücreler, M-CSF ve 12 normal insan serumu düşük konsantrasyonlarının varlığında inkübe edilir. Kullanımı daha da kolaylaştırmak ve hücre hasat etmek için, gaz geçirgen bir farklılaşma FEP içinde gerçekleştirilmektedirHidrofobik bir yüzeyde 12-15 teflonlanmış hücre kültürü torba. Yine de ya bir M1 veya M2-benzeri bir şekilde yanıt yeteneğine sahip olarak elde edilen dinlenme makrofajlar deneyleri geniş tabi tutulabilir. Manyetik aktive hücre sıralama (MACS) veya santrifüj elutrasyonun (CCE) karşı akışlı olarak monosit izolasyonu ve sonraki farklılaşma alternatif yöntemler gerekli verimi, maliyet ve zaman açısından bazı sınırlamalar var. Burada tarif edilen protokolü özel reaktifler (örneğin, manyetik boncuklar Mac) ya da aygıtları (örneğin, CCE cihazı) için gerek kalmadan standart laboratuar ekipmanı ile gerçekleştirilir ve hücrelerin büyük miktarlarda işleme izin verir edilebilmesi avantajını sunar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibodies for immunophenotyping</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BioLegends</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein-AM</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>89201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>combi-stopper closing cones</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4495101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td>for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084211000</td>
			<td>prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll (density 1.077g/ml)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse FITC</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from E.coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8274</td>
			<td>final conc: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1,131g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusor syringe 50ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Pasteur Pipettes</td>
			<td>LVL technologies</td>
			<td>2655181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh M-CSF</td>
			<td>ImmunoTools</td>
			<td>11343117</td>
			<td>Resuspend in 500&#181;l sterile H2O (c = 100 ng/&#181;l), aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilization paper</td>
			<td>VP group</td>
			<td>3KFKFS230116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0,4% w/v)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, small</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>72-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, large</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>197-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags

İnsan makrofajlar bulaşıcı hastalıklardan kansere kadar değişen patolojik süreçlerin bir bolluk katılmaktadırlar. Böylece bu hastalıkların altında yatan mekanizmaları anlamak için değerli bir araç oluşturmaktadır. Bu nedenle, yüksek makrofaj ürün veren bir farklılaşma olarak hazırlandı buffy kat insan monositleri, izolasyonu için basit bir protokol mevcut. Tekniği yaygın olarak bulunan laboratuar ekipmanları çoğunlukla dayanır ve böylece insan makrofaj büyük miktarlarda elde etmek için bir maliyet ve zaman etkin bir yol sağlar. Kısaca, sağlıklı kan vericilerden ince beyaz kat periferal kandan hasat monositleri bir çifte yoğunluk dereceli bir santrifüj işlemine tabi tutulur. Bu monositler, makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) varlığında, flor ile birleştirilmiş etilen propilen (FEP), teflonlanmış hücre kültürü poşetlerde kültürlenir. Farklılaşmış makrofajlar kolaylıkla hasat ve ileri çalışmalar ve fonksiyonel için kullanılabilirdiyor. Kalite kontrol ve izolasyon ve farklılaşma adımları doğrulama için önemli yöntemler protokol çerçevesinde vurgulanır. Özet olarak, burada açıklanan protokol rutin ve tekrar edilebilir maliyet yoğun bir araca ihtiyaç olmaksızın, insan makrofajlarını izole etmek için bilim adamları sağlar. Ayrıca, hastalık modelleri sıçangil makrofaj kullanımını engellemeyi genden insan sistemi içinde ileri incelenebilir.

Ficoll kullanılarak birinci yoğunluk gradyan santrifüj PBMC (Şekil 1A), yani lenfositler ve monositler içeren beyaz interfazda verir. Bu, Mayıs Gruenwald boyama (lenfosit tipik) yüksek bir çekirdek / sitoplazma oranı, her iki gösterir toplanan hücreleri (Şekil 1B, C) ​​yoluyla teyit (monositler, tipik özelliği) fasulyesi ya da halka biçimli çekirdekler edilebilir. Bu hücreler daha sonra Percoll kullanarak ikinci bir yoğunluk gradyanı üzerine yüklendiğinde, monositler lemfositler daha ileri ölçüde ayrılabilir ve yeniden beyaz ara faz (Şekil 1D-F) gibi görünebilir. Her Buffy kat için tanımlanan çift yoğunluklu gradyan santrifüj rutin Buffy kat başına 70 ± 30 x 10 6 makrofajlar (Şekil 2) ayırt edilebilir 150 ± 40 x 10 6 monositlere verir. Gelen ortalama makrofaj verim20 bağımsız hazırlıkları toplam izole monositlerin 47 ±% 14 idi. Percoll Santrifüjle çevrilmenin ardından yine kan verici hem de izolasyon işleminin doğruluğu bağlıdır hazırlanması için mevcut bir miktar artık olmayan monositik hücreler olabilir. Bununla birlikte, 6-7 günlük farklılaşma aşamasından sonra, preparat esas olarak daha nedeniyle plastik yüzeylere bir biçimde bağlı, rasgele kirletici hücreleri tarafından paylaşılmayan bir özellik (Şekil 4A ile zenginleştirilebilir olgun makrofajları (Şekil 3) oluşmaktadır ve B). Bir gergin iğ benzeri fenotip (Şekil 4C ve D) ile hücreleri de varken kez makrofajların çoğunluğu klasik bir &quot;kızarmış yumurta&quot; morfolojisini, kaplama. Bu sitoplazma ve yapışma kümeler içindeki F-aktin dağılımı ile yansıtılır. Farklılaşmış hücrelerolgun makrofajları (Şekil 5) için tipik işaretleri olan CD45, CD14, CD16, CD206 (mannoz reseptörü), CD11b, CD11c ifadesi ve karakterize edilir. CD11b varlığı hücreleri, dendritik hücre işaretleyici CD209 (DC-SIGN) için negatif olduğu gerçeğiyle desteklenmektedir, ağırlıklı olarak dendritik farklılaşma karşı çıkar. Farklılaşma, sonra, hücreler fonksiyonel ve PM boyama ve tümör hücrelerine dökülen hücre dışı veziküller almak yetilerini kalsein ile görülebilir olarak yaklaşık 5-7 gün (Şekil 6), metabolik olarak aktif kalır. Ek olarak, hücreler hala çeşitli pro-enflamatuar genin (Şekil 7) &#39;nin sentezlenmesi ile sonuçlanmaktadır lipopolisakarit (LPS) ile uyarılması için, örneğin, gösterildiği gibi aktive edilebilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ files / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Çifte yoğunluk gradyanı ile santrifüjleme sonrası Şekil 1. Görüntü ve PBMC- bileşimi ve monosit-tabakası. Izo-ozmotik bir Percoll santrifüje edilmesinden sonra Ficoll gradyan ve (D) monosit-aşamasından sonra, (A), PBMC bant gösteren fotoğrafını çekin. Sitospin (B, C) ​​PBMC fraksiyonu hazırlıkları ve kalan (E, F) monositler içinde Mayıs-Gruenwald boyamaları. 200 B ve E mikron, C ve F 50 mikron = = Ölçek çubuğu <img alt="Şekil 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Monositler ve makrofajlar Şekil 2. Verim. Temsilcisi hücre izole monositlerin sayım ve 20 beyaz tabaka pr makrofajlareparations. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil 3. ve Mikrograflan (A) ve (B) görünüşü makrofaj farklılaşması önce monositler ve makrofajlar. Monositik hücre süspansiyonu, faz kontrast mikroskopisi hücre boyutu ölçümleri. Monositler (C) ve makrofajlar (D) hücre boyutuna histogramlarını gelir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Şekil 4. Morfoloji ve yapışık makrofajlar iskeletinin organizasyonu. (A) önce yapışık makrofajlar Faz kontrast mikroskobu ve non-adheren sonrası (B) çıkarmaT hücreleri. Yapışkan, uyarılmamış makrofajlar içinde filamentli aktin&#39;in (C, D) Phalloidin-TRITC boyama. Ölçek çubuğu AC = 100 mikron, D. 20 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil farklılaştırılmış makrofaj 5. immunfenotipine. FEP Teflon kaplı hücre kültür çantaları farklılaşma 6 gün sonra makrofaj Flow sitometri analizi (kırmızı ile gösterilmiştir). İlgili izotip kontrolleri gri gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Makrofajlar tarafından tümör hücresi microvesicles Şekil 6. Alımı. PKH26-etiketli (kırmızı flüoresan) Tümör hücre türevli microvesicles maruz bıraktıktan sonra yapışkan makrofaj Mikrografikleridir. Görüntüler canlılığı boya kalsein AM ile ilgili (A), aydınlık veya (B) sitosolik lekelenmeye karşı yerleştirilmiştir edilir. Ölçek çubukları 100 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Şekil 7, IL-1 β upregülasyonu, Wnt5a, TNFa, IL-6, MMP-2, MMP-7 ve MT1-MMP stimu sonra24 sa. Gen ekspresyonu için LPS&#39;nin (100 ng / ml) ile makrofaj lasyon toplam RNA örnekleri (A) ve HPRT1 ve GNB2L1 ifade normalize kantitatif RT-PCR ile ölçülmüştür. Belirtilen değerler muamele edilmemiş kontrol ile karşılaştırıldığında kat değişiklikler (n, ortalama ± SD = 5 * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** P &lt;0.001). LPS stimülasyon altında TNFa ve IL-6 indüksiyon ayrıca (SD ± yollarla * p &lt;0.05) ELISA (B) tarafından teyit edildi.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags at JoVE.com

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

isolation-human-monocytes-double-gradient-centrifugation-their

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

69.4K Görüntüleme.  University Medical Center Göttingen.  İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır. 

Video: Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila Dış Zar veziküller: İzolasyon ve Makrofajlar Onların Pro-inflamatuar Potansiyeli Analizi

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Cevabı İnsan İlköğretim nötrofiller ve monositler tarafından Antifungal Faaliyet Canlı Görüntüleme<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where immune cells reside and therefore contribute to mucosal immunity in the intestine. A complete understanding of how M cells differentiate in the intestine as well as the molecular mechanisms of antigen uptake by M cells is lacking. This is because M cells are a rare population of cells in the intestine and because in vitro models for M cells are not robust. The discovery of a self-renewing stem cell culture system of the intestine, termed enteroids, has provided new possibilities for culturing M cells. Enteroids are advantageous over standard cultured cell lines because they can be differentiated into several major cell types found in the intestine, including goblet cells, Paneth cells, enteroendocrine cells and enterocytes. The cytokine RANKL is essential in M cell development, and addition of RANKL and TNF-&#945; to culture media promotes a subset of cells from ileal enteroids to differentiate into M cells. The following protocol describes a method for the differentiation of M cells in a transwell epithelial polarized monolayer system of the intestine using human ileal enteroids. This method can be applied to the study of M cell development and function.

This protocol describes how to induce the differentiation of M cells in human stem cell-derived ileal monolayers and methods to assess their development.

Insan kök hücresinde M hücre benzeri hücrelerin kaynaklı farklılaşma-türev ıleal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...