Bu çalışma, Büyük Zorluklar İncelemeler Girişimi ve GM062958-01 ve 2R01EB002046 hibe yoluyla NIH tarafından hibe (OPP1015402) Bill ve Melinda Gates Vakfı tarafından finanse edildi. Bu çalışma Sözleşme DE-AC52-07NA27344 altında kısmen ABD Enerji Bakanlığı&#39;nın Lawrence Livermore Ulusal Laboratuvarı tarafından himayesi altında yapıldı.

1. Sahne Ayarı <ol><li> Biosearch Teknolojileri (Novato, CA) veya Midland Sertifikalı (Midland, TX) gibi özel bir oligonükleotid sentez şirketi, kimyasal olarak değiştirilmemiş ilgili prob DNA satın alın. Prob, 3&#39;-sonunda ek bir C6 tiyol ve 5&#39;-sonunda bir redoks aktif metilen mavisi sentezi sırasında güncellenmiştir. </li><li> Fosfat prob DNA çözülür 200 mcM bir konsantrasyon tamponlu salin pH 7.4 ve bir spektrofotometre ile 260 nm dalga boyunda absorbans ölçümü ile konsantrasyon doğrulamak. DNA prob metilen mavisi benzer parçaları nedeniyle çözüm görünür bir mavi tonu olmalıdır. </li><li> Taze distile, deiyonize su (DI-su), 10 mM tris (2-carboxyethyl) fosfin TCEP çözüm 1 mL hazırlamak. 4 ° C&#39;de karanlıkta saklandığında deneyimlerimiz, bu TCEP çözümleri, bir hafta süreyle taze kalır </li><li> Prob DNA çözümü mevcut olabilecek herhangi bir disülfür bağları azaltmak için, prob DNA stok solüsyonu 1 mcL TCEP çözüm 2 mcL ile birleştirmek ve bir pipet yardımıyla hafifçe karıştırın. Karışımı bir karanlık, buzdolabında bir kap içinde bir saat boyunca inkübe edin. TCEP geri dönüşümlü metilen mavisi azaltır başlangıçta mavi bir çözüm haline gelmelidir. Çözüm açık duruma değilse, oda sıcaklığında, büyük olasılıkla, taze bir TCEP çözümü kullanarak prosedürü tekrarlayın veya. </li><li> Bir saat sonra, 1 ml tampon ile azaltılmış DNA prob çözeltinin; 200nm bir konsantrasyon sulandırmak. Daha sonra, bu seyreltilmiş prob çözüm 200 mcL porsiyonlar halinde altın disk elektrotlar bir dizi inkübe olacaktır. </li><li> Taze 2mm mercaptohexanol en az 2 mL hazırlamak fosfat tamponlu salin. </li></ol> 2. Sensör Hazırlanması <ol><li> Ince bir polisaj bezi su ile 0.05 mikron alümina toz birleştirin. Elektrot başına yaklaşık üç dakika için sekiz desen altın yüzeyi ıslak bir bez içine sıkıca basarak, bir rakam taşıyarak bir dizi altın disk elektrotlar (CH Instruments, Austin, Teksas) Lehçe. </li><li> DI-su ile durulayın ve cilalı elektrotlar ile aynı dolu Eppendorf tüpleri içine batırmayın. Herhangi bir kalıntı alümina toz kaldırmak için beş dakika sonikasyon. </li><li> 0.5 M sülfürik asit çözeltisi içine elektrotlar yerleştirin, platin sayacı ve gümüş / gümüş klorür referans elektrot ile birlikte bir potansiyostat ekleyebilirsiniz ve voltamogramları okside azaltmak ve elektrokimyasal yüzeyleri temizlemek için bir dizi çalıştırın. Bu 0.01 M KCl çözeltisi 0,1 M sülfürik asit ikinci bir elektrokimyasal temizlik gerçekleştirmek ardından. Bu temizleme prosedürleri ince ayrıntıları Nature Protokolleri kağıt 1, ve bu video ekinde bulunabilir. </li><li> 2 ml Eppendorf tüpleri rafa bir dizi düzenleme ve 200 mcL prob DNA çözümü ile her doldurun. Bu çözüm prob DNA konsantrasyonu prob DNA&#39;lar paketi sensör yüzeyinde yoğunluk tanımlamak olacaktır. Algılayıcı performansını optimum yoğunluğuna sahip bir sensör mimarisi sonraki değişik prob yoğunluğuna kuvvetle bağlı Bu aşamada kullanılan prob konsantrasyon ve böylece her yeni tip sensör 2 için optimize edilmiş olmalıdır . Prob mimarileri için bugüne kadar araştıran, prob DNA konsantrasyonları tipik bir değeri olan 200 nM, bu adım aralığı 15 nM 2 mikron istihdam. </li><li> DI-su ile altın disk elektrotlar durulayın ve sonra bir saat için bir Eppendorf tüp ilgili prob DNA çözüm batırmayın. Bu noktada, prob DNA tiol-on altın kendini monte tek tabaka oluşumu yoluyla altın elektrot yüzeyine eklenecektir. </li><li> Elektrotlar DI-su ile durulayın, bir Eppendorf tüp 2mm mercaptohexanol onları batırmayın ve kendini monte monolayer oluşumunu sağlamak için oda sıcaklığında bir gecede 3 saat boyunca karanlık bir yerde saklayın. Bu adım, istikrarlı bir tek tabaka oluşumu sağlamak için karma bir tek tabaka parçası olarak mercaptohexanol içermektedir. Buharlaşmasını önlemek için parafilm Eppendorf tüp içine elektrod mühür isteyebilirsiniz. Sensörler, gerekirse birkaç gün boyunca bu çözüm saklanabilir. </li><li> Sensörü kullanmak için hazır olduğunuzda, DI-su ile yıkayın ve sonra en az on dakika boyunca tampon ıslatın. Antikor tespiti yönelik sensörler aynı zamanda son derece hızlı bir tampon ile durulayın takip kullanmadan önce ilgili tanıma iplikçik 100 nM çözüm dalmış olmalıdır. </li></ol> 3. Sensör Testi, DNA Algılama <ol><li> Bu protokol, 17 nükleotid prob iplikçik altın elektrot yapıştırılmıştır. 3&#39;-sonunda bir metilen mavisi redoks muhabiri (Şekil 1). Prob molekülü bir yakalama iplikçik hybridizes, sensör devre üzerinden akım azalır. </li><li> DI-su ile durulayın ve taze bir sensör boş bir daldırmayınörnek ürettiği arka plan sinyalini kaydetmek için hedef eksik. Bir potansiyostat çalışma elektrot kurşun sensörü takın. Platin elektrot ve çözelti içine bir gümüş / gümüş klorür referans elektrot yerleştirin. </li><li> 0 ile 25 mV bir genlik ve 1mV bir adım boyutu -0.6 V kare dalga ölçümü çalıştırın. Optimal kare dalga frekansı prob mimarisi 2,3 ayrıntılarını bağlıdır; prob mimarileri için 600 Hz - 60 aralığında genellikle optimal değerleri istihdam var. Yaklaşık -0.35 V, metilen mavisi redoks potansiyeli (pik potansiyeli test çözümü kesin pH bağlı olarak biraz değişebilir) yuvarlak bir tepe göreceksiniz. Bu tepe akımı başlangıçtan itibaren yüksekliği, metilen mavisi ve altın elektrot (Şekil 2) arasındaki verimliliği elektron transferi ile doğru orantılıdır. Bu arka plan ölçüm kaydedin. </li><li> Ilgi hedef DNA molekülü içeren bir çözüm için elektrotlar Taşı, dengelenmesi (5 ila 120 dakika target4 5, büyüklüğü, yapısı ve konsantrasyonuna bağlı) ve ikinci bir kare dalga voltammagram toplamak. Başlangıç, arka plan ölçüm -0.35 V tepe yüksekliği değişecektir. Bu değişimin büyüklüğü analit konsantrasyonu ile ilgilidir. Bu sensörün asıl çıkış verileri (Şekil 3). </li><li> Ölçüm bağıl sinyal değişikliği, yüzde azalma veya artış arka plan zirvesine göre sinyal, elektrot yüzey alanı varyasyonları için bu düzeltir, genellikle akım mutlak değişim ölçüm daha tekrarlanabilir. Bunu yapmak için, mevcut arka plan tepe tepe ve arka tepe akımı arasındaki fark ayrılır. </li></ol> 4. Sensör Yenilenme <ol><li> Ölçümler tamamlandıktan sonra, DI-su akışı ile 30 saniye 30 saniye DI-suyla dolu bir kabın içine sensör taşımak, veya fışkırtma Taze deiyonize su ile bu iki kez daha tekrarlayın. Not: bazı analitler Bu yaklaşıma dirençli; onları 6 M guanidin hidroklorür veya% 70 etanol durulama agresif denemek için. </li><li> Sensör ölçümleri yapılacaktır bir çözüm içine geri koyun. Bir dakika içinde, zirve yüksekliği özgün değerine geri olmalıdır. Bu sensörler genellikle ilk test ve yenilenme döngüsü sırasında biraz daha büyük sinyal değişikliği ve sonraki 6 döngüleri sırasında oldukça tutarlı sonuçlar sergilediği fazlalaştı. </li></ol> 5. Sensör Test, Antikor Algılama <ol><li> Bu protokol, bu sensörlerin kullanılan metilen mavisi ve tiyol modifiye DNA prob, &quot;çapa&quot; iplikçik 7 olarak hizmet vermektedir . Altın elektrot doğrudan bağlı. Bu daha sonra ilgili antijen (Şekil 4) kovalent konjuge olan ikinci bir &quot;tanıma&quot; DNA iplikçik melezleşmiştir. Biz gerekli olan DNA-antijen kimeralar sentezi için Biosearch Teknolojileri ve Panagene gibi ticari sentez evler, iyi bir şans oldu. 1 saat süreyle PBS içinde ilgili tanıma DNA zincirinde 100 nM içeren bir Eppendorf tüp içine prefabriklerin sensörü transfer hibridizasyon adım tarafından yürütülmektedir. </li><li> Ilgili boş çözüm sensörü yerleştirin. Bir potansiyostat çalışma elektrot kurşun takın ve çözüm içine bir platin elektrot ve gümüş / gümüş klorür referans elektrot yerleştirmek. </li><li> Yukarıda açıklandığı gibi kare dalga voltametri gerçekleştirin. Özel bir prob mimarisi için en uygun kare dalga frekansı 60 Hz burada istihdam var. -0.35 Etrafında yuvarlak bir tepe görmek V. Bu arka plan ölçüm kaydet gerekir. </li><li> 5 ila 60 dakika süreyle inkübe hedef analit içeren bir çözüm için elektrotlar aktarın ve ikinci bir kare dalga voltammagram toplamak. Hedef antikor varsa -0.35 V tepe azalacaktır. Bu değişimin büyüklüğü antikor konsantrasyonu ile ilgili. </li></ol> 6. Sensör Test, Küçük Molekül Algılama <ol><li> Bu durumda, sensör yüzeyinde prob molekül (in vitro hedefine analit 8,9 bağlayıcı üzerine (kıvrım) yapısı değişiklikleri belirli bir moleküler analit bağlamak için seçilmiş olan bir DNA veya RNA molekülü bir aptamer Şekil 5). Burada Stojanovic 10,11 laboratuvarı tarafından geliştirilen bir kokain bağlayıcı DNA aptamer istihdam etmektedir. </li><li> DI-su ile durulayın ve taze bir sensör ürettiği arka plan sinyalini kaydetmek için hedef yoksun boş bir örnek batırmayın. Bir potansiyostat çalışma elektrot kurşun sensörü takın. , Platin sayacı ve gümüş / gümüş klorür referans çözelti içine yerleştirin. </li><li> Yukarıda açıklandığı gibi kare dalga voltametri gerçekleştirin. Biz burada istihdam prob mimarisi için en uygun kare dalga frekansı (200HzAma 60 Hz) çalışır. -0.35 Etrafında yuvarlak bir tepe görmek V. Bu arka plan ölçüm kaydet gerekir. </li><li> Hedef analit içeren bir çözüm için elektrotlar Transferi, yaklaşık 5 dakika boyunca inkübe ve ikinci bir kare dalga voltammagram toplamak. -0.35 V tepe yüksekliği değişecektir. Bu değişimin büyüklüğü hedef analit konsantrasyonu ile ilgili. Örnek bir kokain, prokain elde edemiyorsanız, düzensiz olduğu kullanımı, bir yedek olarak kullanılabilir olabilir. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Ilk mimarisini kullanarak DNA tespit etmek için kullanılan, sinyal en az% 60 azalma 200 nM hedef az dengelenmiş. Deiyonize su üç kısa durular sonra, sinyal özgün değerine çok yakın (% 0,1-5 içinde) dönmelidir. Antikor sensörleri 40 ila% 80 arasında bir sinyal azalma yapılmalıdır. Kokain tespit Aptamer tabanlı sensörler faaliyet hangi frekansta ve yüzey kapsama bağlı olarak% 200 kadar bir sinyal artışı gösterirler. Kokain sensörü için, düşük yüzey kapsama en iyi 3. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 bir elektrokimyasal DNA biyosensör ile DNA tespiti. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 kare dalga voltametri sırasında E-DNA biyosensör tarafından üretilen sinyal gösteren ekran görüntüsü. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 kare dalga voltametri sırasında E-DNA biyosensör tarafından üretilen sinyalleri gösteren bir analit ile hibridizasyon öncesi ve sonrası ekran görüntüsü. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 bir iskele biyosensör antikorların tespiti. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5, bir elektrokimyasal aptamer biyosensör ile kokain ya da prokain Algılama . <table border="1"><tbody><tr><td> Özel Oligo </td><td> Dizi </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Lineer Prob DNA (LP17) </td><td> 5&#39;-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 &#39; </td><td> HPLC Saflaştırılmış, SS ile sipariş edilebilir </td></tr><tr><td> Hedef analit DNA </td><td> AATAAAACGCCGATCCA </td><td> Değiştirilmemiş </td></tr><tr><td> Tanıma Strand </td><td> 5&#39;-Antijen-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 &#39; </td><td></td></tr><tr><td> İskele Anchor </td><td> 5&#39;-HS (CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC (CH 2) 7 MB </td><td> HPLC Saflaştırılmış, SS ile sipariş edilebilir </td></tr><tr><td> A4 Kokain Aptamer </td><td> 5&#39;-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG MethyleneBlue-3 &#39; </td><td> HPLC Saflaştırılmış, SS ile sipariş edilebilir </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Probe ve Hedef DNA dizileri.

<ol>
	<li>Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+electrode-immobilized,+redox-modified+oligonucleotides+for+electrochemical+DNA+and+aptamer-based+sensing.">Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing.</a> Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).</li><li>Ricci, F., Lai, R. Y., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Sumner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Molecular+Crowding+on+the+Response+of+an+Electrochemical+DNA+Sensor.">Effect of Molecular Crowding on the Response of an Electrochemical DNA Sensor.</a> Langmuir. 23, 6827-6834 (2007).</li><li>White, R. J., Phares, N., Lubin, A. A., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensors+via+Optimization+of+Probe+Packing+Density+and+Surface+Chemistry.">Optimization of Electrochemical Aptamer-Based Sensors via Optimization of Probe Packing Density and Surface Chemistry.</a> Langmuir. 24, 10513-10518 (2008).</li><li>Lubin, A. A., Vander Stoep Hunt, B., White, R. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Probe+Length,+Probe+Geometry,+and+Redox-Tag+Placement+on+the+Performance+of+the+Electrochemical+E-DNA+Sensor.">Effects of Probe Length, Probe Geometry, and Redox-Tag Placement on the Performance of the Electrochemical E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 2150-2158 (2009).</li><li>Lubin, A. A., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding-Based+Electrochemical+Biosensors:+The+Case+for+Responsive+Nucleic+Acid+Architectures.">Folding-Based Electrochemical Biosensors: The Case for Responsive Nucleic Acid Architectures.</a> Accounts of Chemical Research. 43, 496-505 (2010).</li><li>Lubin, A. A., Lai, R. Y., Baker, B. R., Heeger, A. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-Specific,+Electronic+Detection+of+Oligonucleotides+in+Blood,+Soil,+and+Foodstuffs+with+the+Reagentless,+Reusable+E-DNA+Sensor.">Sequence-Specific, Electronic Detection of Oligonucleotides in Blood, Soil, and Foodstuffs with the Reagentless, Reusable E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 78, 5671-5677 (2006).</li><li>Cash, K. J., Ricci, F., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Sensor+for+the+Detection+of+Protein?Small+Molecule+Interactions+Directly+in+Serum+and+Other+Complex+Matrices.">An Electrochemical Sensor for the Detection of Protein?Small Molecule Interactions Directly in Serum and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6955-6957 (2009).</li><li>Baker, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electronic,+Aptamer-Based+Small-Molecule+Sensor+for+the+Rapid,+Label-Free+Detection+of+Cocaine+in+Adulterated+Samples+and+Biological+Fluids.">An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 3138-3139 (2006).</li><li>Ferapontova, E. E., Olsen, E. M., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+Aptamer-Based+Electrochemical+Biosensor+for+Detection+of+Theophylline+in+Serum.">An RNA Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Detection of Theophylline in Serum.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 4256-4258 (2008).</li><li>Stojanovic, M. N., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Based+Colorimetric+Probe+for+Cocaine.">Aptamer-Based Colorimetric Probe for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 124, 9678-9679 (2002).</li><li>Stojanovic, M. N., Prada, P. d. e., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Based+Folding+Fluorescent+Sensor+for+Cocaine.">Aptamer-Based Folding Fluorescent Sensor for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4928-4931 (2001).</li><li>Cash, K. J., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+Reusable,+DNA+Pseudoknot-Based+Electrochemical+Sensor+for+Sequence-Specific+DNA+Detection+in+Blood+Serum.">Optimization of a Reusable, DNA Pseudoknot-Based Electrochemical Sensor for Sequence-Specific DNA Detection in Blood Serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 656-661 (2009).</li><li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Sensor+for+Single+Nucleotide+Polymorphism+Detection+in+Serum+Based+on+a+Triple-Stem+DNA+Probe.">An Electrochemical Sensor for Single Nucleotide Polymorphism Detection in Serum Based on a Triple-Stem DNA Probe.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 15311-15316 (2009).</li><li>Zuo, X., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Specificity,+Electrochemical+Sandwich+Assays+Based+on+Single+Aptamer+Sequences+and+Suitable+for+the+Direct+Detection+of+Small-Molecule+Targets+in+Blood+and+Other+Complex+Matrices.">High Specificity, Electrochemical Sandwich Assays Based on Single Aptamer Sequences and Suitable for the Direct Detection of Small-Molecule Targets in Blood and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6944-6945 (2009).</li><li>Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Supersandwich+Assay+for+Sensitive+and+Selective+DNA+Detection+in+Complex+Matrices.">An Electrochemical Supersandwich Assay for Sensitive and Selective DNA Detection in Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 14346-14348 (2010).</li><li>Patterson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Triplex-Forming+Oligonucleotide+Probes+for+the+Reagentless,+Electrochemical+Detection+of+Double-Stranded+DNA.">Using Triplex-Forming Oligonucleotide Probes for the Reagentless, Electrochemical Detection of Double-Stranded DNA.</a> Analytical Chemistry. 82, 9109-9115 (2010).</li><li>Ferguson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Microfluidic+Electrochemical+DNA+Sensor.">Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).</li><li>Swensen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous,+Real-Time+Monitoring+of+Cocaine+in+Undiluted+Blood+Serum+via+a+Microfluidic,+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensor.">Continuous, Real-Time Monitoring of Cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4262-4266 (2009).</li></ol>

Önemli bir not bu elektrotlar düzgün bir şekilde temizlenir sürece yukarıda açıklanan deneyler hiçbiri düzgün çalışması. Burada, bizim elektrokimyasal temizleme prosedürü için bir rehber. CH Instruments potentiostats ile çalışırken, bir dizi üç makro programları kullanarak bu temizleme adımları çalıştırın. Faz Sıfır (E temiz O) 0.5MH 2 SO 4 elektrotlar bırakın ve bir potansiyostat çalışma elektrotlara bağlayın. Ayrıca bir Ag / AgCl referans ve platin elektrot takın ve bırakın. Sonra bir oksidasyon adım (5 saniye 2 V) ve bir azalma adım (10 s için 0,35 V) ile başlayın. Phase One (E-temiz 1) 0,35 ila 1,5 V (20 tarama hızı az dört tarama takip 4 V / s tarama hızı 0.01 V tarar ve bir örnekleme aralığı, aynı asidik şartlar altında (0.5MH 2 SO 4), oksidasyon ve redüksiyon taramaları başlatın 0,1 V / s ve 0.01 V bir örnek aralığı). Aşama (E-temiz 2) Dört farklı potansiyel aralıkları (0.1 V s 1 tarama hızı ve 0.01 V örnek aralığı 10 segmentleri için yapılan kapsayan asidik şartlar altında (0,01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4) elektrokimyasal oksidasyon ve redüksiyon taramaları başka bir set Davranış ): (i) 0.2 ila 0.75 V potansiyel aralığı, (ii) 0.2 ila 1.0 V potansiyel aralığı, (iii) 0.2 &#39;den 1.25 V potansiyel aralığı, 0.2 ila 1.5 (iv) potansiyel aralık V. Birçok altın elektrot tipleri, bu deneyler için kullanılabilir. Burada istihdam edilenler gibi altın disk elektrotlar ek olarak, biz microfabricated altın yüzeyler, altın tel, baskılı devre kartları üzerinde yer alan altın ve başarılı oldu. Bu yazıda anlatılan sensörleri ile birlikte, diğer pek çok elektrokimyasal DNA biyosensör mimarileri bildirilmiştir. Bu pseudoknot 12 ile sensörler, üçlü iplikçik 13, sandviç 14, süper sandviç 15 veya tripleks 16 mimarisi içerir. Gelecekte, biz bu sensörler bakım tıbbi teşhis noktası olacağını bekliyoruz. Onlar birkaç mikroakışkan cihazlar 17,18 içine başarıyla entegre optik analit algılama sistemleri üzerinden pek çok avantajı sunan edilmiştir. Özellikle, bu sensörlerin optik yoğun ve yüksek oto-floresan örnekleri, bulanık işlev görebilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Altın Disk Elektrotları </td><td> CH Aletleri </td><td> CHI101 </td><td> Yeniden kullanılabilir </td></tr><tr><td> Sentetik koruyucu Probe DNA </td><td> Biosearch Teknolojileri </td><td> Özel </td><td></td></tr><tr><td> Sentetik Hedef DNA </td><td> Sigma Genosys </td><td> Özel </td><td></td></tr><tr><td> Mercaptohexanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 725.226-1G </td><td> Serin karanlık bir yerde saklayın </td></tr><tr><td> Platin Elektrot </td><td> Basi </td><td> MW-1032 </td><td> Yeniden kullanılabilir </td></tr><tr><td> Ag / AgCl Referans </td><td> Basi </td><td> MF-2052 </td><td> Yeniden kullanılabilir </td></tr><tr><td> Kumaş Parlatma </td><td> Buehler </td><td> 40-7212 </td><td></td></tr><tr><td> Alümina Lehçe </td><td> Buehler </td><td> 40-6325-016 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat tamponlu salin Tampon, pH 7.4 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P7059-1L </td><td></td></tr><tr><td> CH Aletleri 605A </td><td> CH Aletleri </td><td> 605A </td><td> Herhangi bir potansiyostat kullanın. </td></tr><tr><td> Yenidoğan Buzağı Serumu </td><td> Sigma Aldrich </td><td> N4637-500ML </td><td> Dondurularak saklanmalıdır </td></tr><tr><td> NanoDrop </td><td> Fisher Scientific </td><td> ND-2000 </td><td> UV-Vis kullanın </td></tr><tr><td> PCR Mix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td> Dondurularak saklanmalıdır </td></tr><tr><td> Kokain </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C5776 </td><td> Gerekli DEA Lisans </td></tr><tr><td> Prokain </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9879 </td><td> Kokain yerine </td></tr><tr><td> Anti-Bayrak Antikor </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F1804-1mg </td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of electrochemical-dna biosensors for the reagentless detection of nucleic acids, proteins and small molecules

Tıp şu an uygulandığı şekliyle, doktorlar örneklerin test etmek için bir merkez laboratuara göndermek ve böylece sonuç almak için saat veya gün beklemeniz gerekir. Birçok hasta, daha iyi, hızlı, başucu testleri ile hizmet olacaktır. Bu amaçla laboratuar ve diğerleri, nükleik asitler (DNA, RNA), proteinler (antikorlar dahil) ve küçük moleküller analitler doğrudan işlenmemiş klinik ve çevre örneklerinde kantitatif, reagentless, elektrokimyasal algılama destekleyen çok yönlü, reagentless bir biyosensör platformu geliştirdi. Bu video, biz, bu &quot;E-DNA&quot; sınıfı birkaç biyosensörler hazırlanması ve kullanımını göstermek. Özellikle, biz imal ve polimeraz zincir reaksiyon karışımının bir HIV spesifik antikor ve uyuşturucu kokain bir hedef DNA dizisi tespiti için sensörler göstermek. Hazırlık prosedürü hakkında uygulamalı bir gecelik inkübasyon tarafından takip çaba sadece üç saat gerektirir ve bunların kullanımı, sadece birkaç dakika gerektirir.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules at JoVE.com

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

&quot;E-DNA&quot; sensörleri, reagentless, kan ve diğer karmaşık matrisler doğrudan meydan bile iyi bir performans elektrokimyasal biyosensörler, nükleik asit, protein ve küçük molekül analitler geniş bir algılama için adapte edilmiştir. Burada bu tür sensörlerin üretimi ve kullanımı için genel bir prosedür mevcut.

Nükleik Asitler, Proteinler ve Küçük Moleküller Reagentless Algılama Elektrokimyasal DNA Biyosensörler Fabrikasyon

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

fabrication-electrochemical-dna-biosensors-for-reagentless-detection

Research

JoVE Journal

Bioengineering

33.0K Görüntüleme.  University Of California Santa Barbara. "E-DNA" sensörleri, reagentless, kan ve diğer karmaşık matrisler doğrudan meydan bile iyi bir performans elektrokimyasal biyosensörler, nükleik asit, protein ve küçük molekül analitler geniş bir algılama için adapte edilmiştir. Burada bu tür sensörlerin üretimi ve kullanımı için genel bir prosedür mevcut.

Video: Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

İyonların ayrılması ve Nükleik Asit Saflaştırılması için on-chip Isotachophoresis

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Biyomühendislik

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optik Algılama<em&gt; E. coli</emMezopor Silikon Biyosensörlerin tarafından&gt; Bakteri

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Gıda kaynaklı patojen tespit etmek için bir elektrokimyasal DNA biyoalgılayıcı gelişimi

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

İpucu büyüyen bitki hücreleri son derece küçük alanlarda uzama yeteneğini çalışmaya mikrosıvısal cihazların geliştirme

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

Organik Çözücü Karışımlarında Gama Modifiye Peptit Nükleik Asitlerin Kompleks Nanoyapılara Kendi Kendine Montajı

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

Sürekli akışlı, permeabilizasyon algılamalı mikro-elektroporasyon sisteminin imalatı ve işletilmesi

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft biomaterials and cells. This approach has gained a central role in the fields of mechanobiology, biomaterials design&#160;and tissue engineering, to obtain a proper mechanical characterization of soft materials with a resolution comparable to the size of single cells (&#956;m). The most popular strategy to acquire such experimental data is to employ an atomic force microscope (AFM); while this instrument offers an unprecedented resolution in force (down to pN) and space (sub-nm), its usability is often limited by its complexity that prevents routine measurements of integral indicators of mechanical properties, such as Young&#39;s Modulus (E). A new generation of nanoindenters, such as those based on optical fiber sensing technology, has recently gained popularity for its ease of integration while allowing to apply sub-nN forces with &#181;m spatial resolution, therefore being suitable to probe local mechanical properties of hydrogels and cells.
In this protocol, a step-by-step guide detailing the experimental procedure to acquire nanoindentation data on hydrogels and cells using a commercially available ferrule-top optical fiber sensing nanoindenter is presented. Whereas some steps are specific to the instrument used herein, the proposed protocol can be taken as a guide for other nanoindentation devices, granted some steps are adapted according to the manufacturer&#39;s guidelines. Further, a new open-source Python software equipped with a user-friendly graphical user interface for the analysis of nanoindentation data is presented, which allows for screening of incorrectly acquired curves, data filtering, computation of the contact point through different numerical procedures, the conventional computation of E, as well as a more advanced analysis particularly suited for single-cell nanoindentation data.

The protocol presents a complete workflow for soft material nanoindentation experiments, including hydrogels and cells. First, the experimental steps to acquire force spectroscopy data are detailed; then, the analysis of such data is detailed through a newly developed open-source Python software, which is free to download from GitHub.

Yumuşak Madde Nanoindentasyonu için Deneysel ve Veri Analizi İş Akışı

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...