This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) sentezi Not: dfTAT iki aşamada üretilir: dfTAT oluşturmak için disülfid bağı dimerizasyonu, katı faz peptid sentezi ile, monomer fTAT sentezini. <ol><li> 1 saat süre ile standart bir 50 ml SPPS kabı içinde dimetilformamid (DMF) içinde Rink Amide MBHA reçinesinin 500 mg kabarma. </li><li> .% 20&#39;lik bir piperidin çözeltisi (DMF içinde% 20 piperidin, 10 ml (0.30 mmol) Fmoc korumalı reçine inkübe edilerek Fmoc korumasının kaldırılması gerçekleştir (1 x 5 dakika ve yıkama aşaması ile birlikte 1 x 15 dak) ile iki kez koruma kaldırma adımları tekrarlayın DMF (yıkama aşaması DMF, yaklaşık 150 ml&#39;lik bir toplam hacim reçineye birden çok kez durulama ve vakumla süzme ile çözücünün çıkarılması dahil olmak üzere) reaksiyonları arasında. </li><li> Alani amid MBHA reçinesi üzerinde CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) sentez. Kullanım Fmoc korumalı amino asitleri aşağıdaki gibidir: Fmoc-Lys (Mtt) -OH (sadece N terminaline), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, Fmoc-Cys ve (Trt) -OH. Reaksiyonu kışkırtmak N 2 (20 PSI) ile reaksiyonu yürütmek. Oda sıcaklığında bütün reaksiyonlar gerçekleştirin. <ol><li> 4 saat süre ile, her bir amino asit birleştirme reaksiyonunu yürütmek. Her bir bağlantı için, Fmoc korumalı amino asit (1.2 mmol), N, N, N &#39;, N&#39; tetrametilsiklopentadienil O- (1H-benzotriazol-1-il) üronyum hekzaflorofosfat (HBTU) (0.44 g, 1.1 mmol korumalı kullanımı DMF içinde çözülmüş), ve diizopropiletilamin (DIEA) (0.51 mi, 3.0 mmol) eklenmiştir. 4 saat Kenetleme yapıldıktan sonra DMF ile reçinenin yıkanması ve aşama 1.2&#39;de tarif edildiği gibi Fmoc korumasının kaldırılması adımı gerçekleştirmek. </li><li> (: CKRKKRRQRRRG no TMR Lineer peptid zinciri) sentezlendi fTAT doğrusal peptit zinciri kadar tekrarlayın. </li><li> Daha sonra iyice birinci DMF kullanılarak ve diklorometan (DCM) ile takip eden reçine yıkayın. DMF veya DCM, yaklaşık 150 ml&#39;lik bir toplam hacim reçineye birden çok kez yıkayın ve vakum süzme ile ayrılması için kullanılabilir. </li><li> Use MALDI-TOF Elde edilen peptid, doğru moleküler ağırlığa sahip olduğu teyit etmek için. <ol><li> Su çözeltisi içinde% 0.01 TFA, 50 ul asetonitril, 50 ul oluşan bir çözeltiye matris 1 mg ekleyerek bir matris karışımı yapın. </li><li> Lineer peptit zinciri kütlesi teyit etmek için, α-siyano-4-hidroksisinamik asit kullanın. Ham peptid analitik HPLC çalıştırın ve saf tepe üstünden 50 ul toplamak. </li><li> MALDI plaka plaka numunesinin hazırlanması için: Kuru veya 37 ° C ısıya plaka üzerinde yayınlamak için MALDI plaka üzerinde matris solüsyon ve yer 2 ul peptidin 8 ul ekleyin. Not: Arginin SPPS&#39;si çiftin zor olan bir amino asit olduğu bilinmektedir. Başarılı birleştirme Kaiser testi 14 (örneğin, ninhidrin testi) yapılarak oluşturulur. Bu test reçine Kuplajsız kalabilir serbest aminlerin tespiti için izin verir. Durumda, sabit bir mavi renk (serbest aminler varlığının göstergesidir) tespit edilir, birleştirme sTeps&#39;in tekrar edilir. </li></ol></li></ol></li><li> CK için (= NH-TMR) TATG (fTAT),% 1 trifluoroasetik asit (TFA) ve% 2 triizopropilsilan oluşan bir çözelti ile CK Lys-amino grubunda (-NH-Mtt) TATG Mtt koruma grubunun yanlması DCM (TBS). <ol><li> MTT koruma grubunun çıkarılması, sarı bir rengin ortaya çıkması ile sonuçlanabilir ki gibi, 5 dakika boyunca, yukarıda çözeltisi 20 ml reçine inkübe sarı renk elde edilinceye kadar, bu tekrarlayın. Arasında, DCM ve DMF reçine yıkanır. TIS MTT temizlemek olan bir çöpçü Ayrıca, çünkü bir kez sarı renkli MTT mevcudiyetinde çözelti içinde görüntülenir. </li><li> Daha MTT sağlamak için reçineye, DCM içinde% 1 TFA (herhangi bir TBS) ile ilave bir solüsyonu ilave çıkarılır ve çözelti, açık kalır. </li></ol></li><li> DMF (() mg reçine miktarına göre 4, 3.9 ve 10 denklik) Carboxytetramethylrhodamine (TMR), HBTU ve DIEA ve bu karışımı ekleyin: üç bileşeni çözülürreçine ve reaksiyon O yürütmek / N karıştırma sağlamak için kuru N 2 kullanarak. </li><li> Fmoc-korumasının giderilmesinden ve amino asit Konjügasyondan sonra DCM ile reçinenin yıkanması ve kurutun. Peptidin reçineden komple klevajından için, 92.5% TFA,% 2.5 ihtiva eden bir çözelti ilave H2O,% 2.5, TIS, ve 3 peptidil-reçineye% 2.5 etanditiol (EDT) (toplam hacim = 4 mi) oda sıcaklığında saat reçineden genel koruma açma ve klevajını elde etmek mümkündü. <ol><li> Et 2 O 40 ml adım 1.6 çözeltinin boşaltılması soğuk susuz etil eter (Et 2 O) kullanılarak ham peptid ürünü Çökelti, 4 ° C&#39;de, bu aşağı doğru döner ve 20 için 4000 xg - 25 dak. Soğuk susuz Et 2 O. ile çökelti yıkama izin vermek için bu adımı tekrarlayın </li><li> Su (5 ml ya da çökelti tamamen eriyene kadar) ve liyofilize çökeltilerin yeniden süspanse edin. Daha sonra% 0.1 sulu TFA / asetonitril içinde elde edilen ürünler yeniden süspanse edin. </li></ol></li> &lt;li&gt; analitik C18 kolonu (5 um, 4 x 150 mm) her peptid analiz HPLC analizi yapın. 214 nm ve 550 nm &#39;de bir akış 1 ml / dakika hızını ve algılama kullanın. </li><li> Peptit saflaştırılması için bir C18, 10 x 250 mm sütun üzerinde, yarı-preparatif HPLC gerçekleştirin. 214 nm ve 550 nm &#39;de bir akış 4 ml / dk&#39;lık bir oranı ve algılama kullanın. Tüm işlemler için,% 0.1 sulu TFA (solvent A) ve% 90 asetonitril,% 9.9 su ve% 0.1 TFA (solvent B) doğrusal gradyanlar kullanımı. </li><li> FTAT, beklenen kütle: 2,041.17, gözlemlenen kütle: 2040.66, üreticinin protokolüne uygun olarak MALDI-TOF ile peptidlerin, doğru kimliğini teyit edin. Kütle beklenen DEAC-K9: 1,415.59: 1,412.97, kütle görülmüştür. MALDI-TOF için α- siyano-4-hidroksisinamik asit matris kullanın. </li></ol> 2. Oksidasyon reaksiyonu: dfTAT Üretimi <ol><li> 1 saat (aşağıdaki reaksiyon için, en az 5 mi), fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4 havalandırın. </li><li> AER bölgesindeki fTAT (0.3 mg, 1.5 x 10 -4 mmol) çözülürated PBS pH 7.4 (5 mi). Peptidin ilavesinden sonra 7.5 - pH 7.0 arasında olduğundan emin olun. Sodyum hidroksit ilave değilse (küçük artışlarla 1 M, 1-5 ul) geri 7.4 kadar pH değeri getirmek için. </li><li> Not: PBS içinde çözülmüş oksijen fTAT tiol grupları oksitleyerek, bir disülfid bağ oluşturmak üzere hareket eder. </li><li> Reaksiyon O Nutate / N tamamlanmadan (HPLC analizine göre% 100 verim) kadar reaksiyona girmesine izin vermek. Ters faz HPLC ile ürünün saflaştırmak ve adım 1.9 olarak kütle spektrometrisi (MALDI-TOF) ile analiz edilmiştir. Beklenen kütle: 4,084.21: 4,080.34, kütle görülmüştür. </li><li> 200 ul su içinde Lyophilize saf dfTAT (0.71 x 10 -4 mmol) ve tekrar süspansiyon (konsantrasyon saf dfTAT = 356,3 uM). </li></ol> 3. dfTAT Konsantrasyon ölçüm <ol><li> 50 mM TCEP solüsyon 149 ul saflaştırılmış dfTAT (saflaştırılmış peptid miktarına bağlı olarak, tipik olarak 1 ul), bir kısım yeniden süspanse edin. </li><li> Not: Bu adımda dfTAT kendi mo indirgenirnomer muadili fTAT nedeniyle dfTAT bölgesindeki TMR fluorofor yakın bir yerde (in dfTAT TMR ekstinksiyon katsayısı ε indirgenmiş fTAT bölgesindeki TMR nin s kıyasla azaltılır) oluşur absorbans su verme ortadan kaldırmak için. </li><li> Örnek yaklaşık 20 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verir (analitik HPLC fTAT oluşumu teyit etmek için kullanılabilir). </li><li> Kuvars küvetine tüm çözüm ekleyin ve 556 nm&#39;de absorbansı ölçün. </li><li> Beer Kanunu Kullanma (A = εcl: ε = 91500 M -1 cm -1), fTAT konsantrasyonunu hesaplamak dfTAT konsantrasyonunu belirlemek ve iki tarafından [fTAT] bölmek için. </li></ol> 4. Hücresel Gönderme Deneyler <ol><li> % 90 (örn 8-kuyu veya 24 kuyu çanak) - 80 konfluansa bir tabak hücreler (. HeLa, HDF, vs.) Tohum. Bir 37 ° C% 90 konfluent - uygun bir ortam içinde hücreler büyümek 80 kadar (örneğin, DMEM,% 10 FBS ve Pen / Strep ile takviye edilmiş)% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş atmosfer. </li><li> (Üç kez çıkarılması daha sonra PBS içinde 200 ul ilave edilerek) hücreler üç kere PBS ile (3X) yıkayın. </li><li> (8 de toplam hacim 200 ul olmalıdır çanak için) NRL-15 ortamı (su içinde) dfTAT bir stok seyreltilmesiyle dfTAT bir 5 uM çalışma konsantrasyonu yapın. 5 uM dfTAT bir konsantrasyon olarak etkili taşınmasında, tarih (Şekil 3) test edilen pek çok hücre tipinde (bir tabak içinde bulunan hücrelerin% 90&#39;ından fazlası sitozolik teslimat yüksek düzeyde) neden olur. Bununla birlikte, daha düşük ya da daha yüksek konsantrasyonlarda nüfuz etmesi için yüksek ya da düşük eğilimi olan hücre türleri için daha uygun olabilir. MEDYA Not: dfTAT disülfid bağı azaltabilecek sistein içermediği NRL-15 dfTAT verilmesi için kullanılır. Ancak, veri hem normal L-15 (sistein ile) ve DMEM dağıtım ortamı olarak kullanılabileceğini göstermektedir. L-15 indirgeme amino asit sistein, ancak sistein presumab içerirly (DMEM sistin ile formüle edilmiştir) sistin oluşturulması için medya okside. dfTAT dolayısıyla bu ortam içinde bozulmadan kalır ve dağıtım nrL15 ile elde edilen ile aynı etkinlikte çalışır. </li><li> Ya da yük olmadan dfTAT (5 uM) (örn.,, EGFP (10 uM)) kuluçkaya bırakılır ve (kuluçkalama süresi azaltılabilir, ancak dfTAT tipik olarak endozomal sızıntı uyarılması için yaklaşık 30 ila 45 dakika gerektiren 1 saat süre ile 37 ° C &#39;de devam ). </li><li> (3 yıkama tavsiye edilir), hücrelerin plazma zarına bağlanmış dfTAT kaldırmak için L-15 heparin (1 mg / ml) ile hücrelerin yıkayın. </li><li> Uygun cep geçirmeyen Nükleer soya, kuluçkaya bırakılır, örneğin., Sytox Mavi, Sytox Yeşil (NRL, 15-2 uM), hücrelerin plazma zarı tehlikeye olup olmadığını belirlemek için (canlı hücreler olmaz ise ölü hücreler boyanmış olacaktır) Üreticinin protokolü. </li><li> Bir floresan mikroskop (100X immersiyon yağı veya 20X objektif) kullanarak görüntü hücreleri. Bir RFP filtre kullanarak Görüntü dfTAT (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm). Not: başarılı dağıtım hücre boyunca dfTAT yayılmış bir floresan (uygulamaya bağlı olacaktır proteinin veya ilgili peptidin teslim değerlendirilmesi) yol açar. FTAT (sitosolik girişi üzerine dfTAT azaltılmış ürünü) ile nukleoli boyanması tespit floresans hücre içi olduğuna dair bir gösterge olarak kullanılabilir. fTAT birkaç saat içinde düşer. Bu noktada, parçalanma fragmanları floresan punktat olarak görünür. Bu dfTAT başarısız (dfTAT bir konsantrasyon çok düşük de varsa bu olur) endozomlardan içinde sıkışıp kalırsa da görülür noktasal dağıtımı için karışık olmamalıdır. </li></ol> Teslim İçişleri Bakanlığı 5. denetimden geçmiş Konsantrasyon <ol><li> Kullanılan hücre tipinde dfTAT verimli sitozolik serbest ulaşmak için gerekli &quot;optimal dağıtım&quot; konsantrasyonunu belirleyin. Increasin ile kuluçkaya hücreler üzerinde floresan mikroskobu gerçekleştirindfTAT g konsantrasyonları. Optimal dfTAT konsantrasyonu sitosolik temizlemek için neden minimum konsantrasyon olarak tanımlanan bir kültür içindeki hücrelerin yaklaşık% 100 TMR floresan &quot;yaygın&quot;. </li><li> (DfTAT optimal dağıtım konsantrasyonu kullanılarak, örneğin) dfTAT sabiti konsantrasyonunu tutarken İçişleri Bakanlığı konsantrasyon eş kuluçka protokolünde kullanılan Vary. Az 1 saat inkübasyon süresi değiştirilmesi İçişleri Bakanlığı teslim miktarını değiştirmek için bir seçenek olabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+as+a+transmembrane+carrier+of+fluorescently+labeled+proteins+and+antibodies.">Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies.</a> Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+Rapid+Cytosolic+Delivery+Using+Cell-Penetrating+Peptides+Mediated+by+Pyrenebutyrate.">Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate.</a> ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).</li><li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells.">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+somatic+cells+via+TAT-mediated+protein+transduction+of+recombinant+factors.">Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors.</a> Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+protein+and+peptide+therapeutics.">Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics.</a> Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).</li><li>Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+molecules+into+cells+using+carbon+nanoparticles+activated+by+femtosecond+laser+pulses.">Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses.</a> Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).</li><li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles.">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).</li><li>Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+using+HIV-1+TAT+recombinant+proteins+OCT4,+SOX2,+KLF4+and+c-MYC.">Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC.</a> Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).</li><li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Membrane+Lipid+Rafts+Mediate+Caveolar+Endocytosis+of+HIV-1+Tat+Fusion+Proteins.">Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins.</a> J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).</li><li>Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+macromolecules+into+live+cells+by+simple+co-incubation+with+a+peptide.">Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide.</a> Chembiochem. 11, 325-330 (2010).</li><li>Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endosomolytic+reagents+by+branching+of+cell-penetrating+peptides:+tools+for+the+delivery+of+bioactive+compounds+to+live+cells+in+cis+or+trans.">Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans.</a> Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Erazo-Oliveras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+live+cells+by+incubation+with+an+endosomolytic+agent.">Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent.</a> Nat methods. 11, 861-867 (2014).</li><li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides.">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT-mediated+photochemical+internalization+results+in+cell+killing+by+causing+the+release+of+calcium+into+the+cytosol+of+cells.">TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells.</a> Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).</li><li>Lautwein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+lymphoblastoid+cells+contain+distinct+patterns+of+cathepsin+activity+in+endocytic+compartments+and+regulate+MHC+class+II+transport+in+a+cathepsin+S-independent+manner.">Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner.</a> J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Çünkü bu aşırı konfluent olmamalıdır dfTAT teslimat için kullanılan hücreler (&gt;% 90 konflüans) verme etkinliğini etkileyebilir. Hücreler de sağlıklı olması gerekir: kültürdeki ölü hücreler dfTAT (bozulmuş çekirdekten örneğin DNA) etkileşim hangi ile apoptotik parçaları serbest bırakabilirsiniz. Bu da bu uygulama randımanına ve görüntüleme kalitesini engelleyebilir. Hücreler dfTAT eklemeden önce FBS kaldırmak için iyice yıkanmalıdır. FBS içinde BSA bulunan dfTAT ba?...

Canlı hücrelere proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük molekül iletilmesi pek çok biyolojik veya biyoteknolojik uygulamalar (hücresel görüntüleme işlevsel deneyler, hücre yeniden programlama, vb.) 1-4 genellikle arzu edilen bir durumdur. Birçok dağıtım yaklaşımlar önce mikroenjeksiyon, elektroporasyon veya taşıyıcı maddelerin kullanımı da dahil olmak üzere, rapor edilmiştir (örn., Örneğin TAT hücre nüfuz peptidler, lipidler) 5-7. Her teknik genellikle belirli uygulamalar için değil, başkaları için bu yaklaşımlar yeterli hale getirebileceğini belirli artıları ve eksileri vardır. Sık karşılaşılan sorunlar birkaç hücrelerde değil bütün bir halkın ve / veya eksikliği 8,9 teslim edilir ne kadar malzeme kontrolü, toksisite veya zararlı fizyolojik etkisi 10,11, zamansal kontrol eksikliği, teslimat kötü teslimat verimliliği (dahil örn., mikroenjeksiyon) 12 ve karmaşık kimyasal çekimi veya formülasyon şemaları 11. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Son zamanlarda, biz bu sınırlamaları ortadan bir roman teslim strateji geliştirdik. Bu strateji dfTAT adında bir peptid (dimer floresan TAT) 13 dayanır. dfTAT iyi bilinen hücre nüfuz peptid (CPP) TAT türetilmiştir. dfTAT fluorofor tetrametilrodamin ile etiketlenmiş TAT iki disülfür bağlı bir kopyasını içerir. Onların benzerliklere rağmen, TAT ve dfTAT aktivitesinde önemli ölçüde farklıdır. TAT tipik endositoz ile hücre içine yerleştirilebilir. Bu CPP Ancak çoğunlukla (floresan mikroskobu ile incelendiğinde bu genellikle hücrelerin içinde peptid bir noktalı dağılımına yol) endozomlardan içinde sıkışıp kalır. TAT gibi, dfTAT verimli hücreler tarafından endocytosed edilir. Ancak, dfTAT endozomlardan içinde sıkışıp kalmıyor. Bunun yerine, son derece verimli bir şekilde endozomal sızıntı aracılık eder. DfTAT ve endosomolitik aktivitesi daha sonra basit bir kuluçka testi ile makromoleküllerin teslim için kullanılabilir. şöyle ntent &quot;&gt; dağıtım işleminin mevcut anlayış. dfTAT makropinositoz neden olur. Sonuç olarak, dfTAT kuluçkaya hücreler sıvı faz ortam içinde mevcut olan çözünür protein, peptid, veya küçük molekülleri (ilgili moleküller, MOI) sürebilir endositoz (Şekil 1). dfTAT ve İçişleri arasındaki etkileşimler birlikte endositik yolunun içinde hem de kurumlar trafik sürece gerekli değildir. dfTAT endositik organellerin lümeni içinde belirli bir eşiğe ulaştığında, onun endozomal kaçak aktivitesini (moleküler ayrıntıları ifade dfTAT, çünkü bu yaklaşım Ayrıca. Bu nedenle MOI konjugasyon veya formülasyon düzenleri gerekli olduğu gibi çok uygundur.). tam olarak karakterize olması sızıntılı organellerin lümenin içeriğini kalır ve bu nedenle, İB, daha sonra hücrelerden salınan hücre içi taşıyıcı ulaşıldıktan sonra doğrudan MOI değiştirerek değil, aynı zamanda MOIS işlevine müdahale etmemelidir. Buna ek olarak, konsantrasyondfTAT dağıtım medyada MOI bu bağımsız kullanılır. Örneğin, dfTAT konsantrasyonu endozomal kaçağı tekrarlanabilir verim sağlamak için farklı deneyler arasında sabit tutulabilir. Bunun aksine, ortam içinde MOI konsantrasyonu giderek MOI sitozol içinde teslim istenen seviyelerinin elde edilmesi için değiştirilebilir. DfTAT ile elde yüksek endozomal kaçak verimliliği bugüne kadar test edilen hücrelerin birçok dikkat çekici zararsız olduğunu. Endositik organelleri hücre önemli bir bileşenidir ve bir dfTAT aracılık dramatik kaçak zararlı hücresel yanıtları eşlik edeceğini beklenir, çünkü bu bir sürpriz oldu. Bununla birlikte, tedavi edilen hücreler, tedavi edilmemiş hücrelere aynı hızda çoğalır ve transcriptome önemli bir değişiklik göstermez. Ayrıca, dağıtım hücreleri kaybetmeden teslim sürecinden tahammül ya kurtarabilirsiniz ya belirten tekrarlanabilir dağıtım verimliliği ile birkaç dakika içinde tekrar edilebilirendositoz veya endozomal sızıntı onların kapasitesi. Ince hücresel yanıtları dfTAT teslimat ve bu yanıtların keşfedilmeyi beklemektedir ne olabileceğini moleküler ayrıntıları sırasında yer alabilir. Ancak, yüksek verim, protokollerin kolaylık ve toksisite eksikliği birleştirerek, bu teslim yaklaşımı birçok hücre tabanlı uygulamalarda hemen kullanışlı ispatlamak zorundadır. Burada sunulan protokolleri araştırma topluluğuna bu teknoloji erişilebilir hale getirmeyi amaçlamaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAS 9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nrL15 L-15 (&#8211;) cysteine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td>Special order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected Amino acids</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dfTAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>model IXB1</td>
			<td>equipped with a heating stage maintained at 37 &#176;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C humidified, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

Makromoleküler teslim stratejileri genellikle hücresel bir giriş yolu olarak endositik yolu kullanmaktadır. Ancak, endozomal tuzak ciddi hücrelerin sitozolik alan nüfuz makromoleküller hangi ile verimliliği sınırlar. Son zamanlarda, biz reaktif dfTAT, fluorofor tetrametilrodamin etiketli peptid TAT bir disülfit bağ dimer belirleyerek bu sorunu hile var. Bu, canlı hücreleri nüfuz eder ve özellikle yüksek bir verimlilik ile hücrelerin sitosolik alan ulaşır prototip hücre nüfuz peptid (CPP) TAT, dfTAT, bir floresan etiketli dimer yarattı. DfTAT bölgesinin Sitosolik dağıtım birincil hücreler de dahil olmak üzere birden fazla hücre çizgileri elde edilir. Ayrıca, dağıtım belirgin hücre canlılığı, proliferasyonu veya gen ekspresyonunu etkilememektedir. dfTAT küçük moleküller, peptitler, antikorlar, enzimler ve biyolojik olarak aktif bir transkripsiyon faktörünü sağlayabilir. Bu raporda, dfTA katılan protokol tarifT sentezi ve hücresel teslimat. Eser hücre dışı İlaç olarak verilen proteinin miktarının değiştirilmesiyle hücre sitosolik alan teslim proteinin miktarının kontrolü açıklamaktadır. Son olarak, bu yeni teknoloji ve teslimat doğrulayarak katılan adımların güncel sınırlamalar tartışılmıştır. Tarif edilen protokoller, hücre bazlı deneyler hem de hücrelerinin ex vivo, manipülasyon ve yeniden programlama için çok yararlı olacaktır.

FTAT ve dfTAT arasındaki farkı değerlendirmek için, HeLa hücreleri, hücresel lokalizasyon farkını belirlemek için her peptit ile 1 saat süre ile inkübe edilir. İki CPP en içselleştirilmesi floresan mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. FTAT (20 mcM) bir noktasal dağılımı lokalize 2 gösterileri Şekil. Peptid endozomlardan içinde sıkışan kalan bu dağılım tutarlıdır. Bunun aksine, dfTAT (5 uM) floresans sinyali sitosol ve nükleus içinde homojen bir dağ?...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT at JoVE.com

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Görüntüleme.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 

Video: Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Nükleik Asitler, Proteinler ve Küçük Moleküller Reagentless Algılama Elektrokimyasal DNA Biyosensörler Fabrikasyon

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Biyomühendislik

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Optik cımbız ile Tek RNA Moleküllerin Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Düşük Bolluk Proteinler saptamak için plazma veya idrar hidrojel Nanoparçacık Hasat

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

Bir Sıçan Kan beyin bariyeri karşısında FITC yüklü ferritinin İn Vitro Geçirgenlik: Bir Model Nanoformulated Moleküllerin Teslim Eğitim için

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

İpucu büyüyen bitki hücreleri son derece küçük alanlarda uzama yeteneğini çalışmaya mikrosıvısal cihazların geliştirme

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different infectious diseases. In this article we demonstrate a method to produce a SAPN core containing a six-helix bundle (SHB) assembly that is capable of presenting antigens in a trimeric conformation. We describe the expression of the SHB-SAPN in an E. coli system, as well as the necessary protein purification steps. We included an isopropanol wash step to reduce the residual bacterial lipopolysaccharide. As an indication of the protein identity and purity, the protein reacted with known monoclonal antibodies in Western blot analyses. After refolding, the size of the particles fell in the expected range (20 to 100 nm), which was confirmed by dynamic light scattering, nanoparticle tracking analysis, and transmission electron microscopy. The methodology described here is optimized for the SHB-SAPN, however, with only slight modifications it can be applied to other SAPN constructs. This method is also easily transferable to large scale production for GMP manufacturing for human vaccines.

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

A detailed method is provided here describing the purification, refolding, and characterization of self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) for use in vaccine development.

Trimerik Epitop Sunumu Gerektiren Aşılar için E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nano tanecikleri Üretimi

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...