Biz Wistar Enstitüsü Hayvan Tesisi, Mikroskopi Tesis, Histotechnology Tesis ve Araştırma Kaynağı Merkezi teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Sağlık CA 076.674 Enstitüleri, CA 098.101, 025.874 CA ve CA 10815 hibe kısmen finanse edildi.

1. Üç Boyutlu İnsan Cilt Modeli Yeniden İnşa: <ol><li> Acellular tabakasının Hazırlanışı: 0.59 ml 10X EMEM, 50 ul 200mm L-glutamin, 0.6 ml FBS, 120 ul% 7.5 Sodyum bikarbonat ve 4.6 mL sığır kollajen I. 1 ml: 50 ml tüp içinde buz üzerinde aşağıdaki reaktifler karıştırın doku kültürü tepsileri her ekleme içine karışımı. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ve jel katılaşmaya izin. Saman-sarı karışımı rengi pembe olmalıdır. </li><li> DMEM nötralize etmek için% 10 FBS içeren eklemek için,% 0.25 &#39;lik tripsin / EDTA ile kültür şişeler insan fibroblastlar Trypsinize. % 10 FBS ile 1,5 mL DMEM santrifüj ve tekrar süspansiyon 0.45 x 10 6 hücre hücre toplayın. Dermal kök hücreler için küreler, santrifüj ayırmak için balon dokunarak 6600 dermal küreler (dermal kök hücreler kök hücre ortamda büyür, onlar neurospheres benzer bir şekilde küre formunda) toplamak. </li><li> Hücre tabakasının Hazırlanışı: 50 ml tüp içinde buz üzerinde aşağıdaki karıştırın: 1.65 ml 10X EMEM, 150 ul 200 mM L-glutamin, 1.85 ml FBS, 350 ul% 7.5 Sodyum bikarbonat, 14 mL sığır kollajen I ve 1.5 mL fibroblastlar süspansiyon Adım 2 (alternatif olarak, 1.5 mL cildin dermal kök hücre yeniden yapılandırır için orta yeniden 0.45 x 10 6 fibroblastlar ve 6600 dermal küreler kombinasyonunu kullanabilirsiniz), iyice karıştırın. Her acellular tabaka kaplı eklemek için 3 ml karışımı ekleyin. , 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 doku kültürü inkübatör 45 dakika inkübe edin . Karışımın rengi pembe sarı saman olmalıdır. Sonra jel katılaşır, DMEM% 10 FBS (içinde 2 ml ve 10 ml dışında cilt yeniden tepsileri her bir kuyunun eklemek) içeren ekleyin. 4 gün boyunca inkübe ve jel sözleşmeleri emin olun. </li><li> Içinde ve dışında her ekleme orta aspire. Düzenli serum yıkayın için eklemek dışında iç ve 10 ml (% 1 diyaliz FBS ile HBSS) 2 ml orta yıkama ekleyin. 37 1 saat inkübe ° C </li><li> Cildin hazırlanması yeniden orta: <ol><li> Normal melanosit ve dermal kök hücre için yeniden yapılandırır: temel, orta (500 ml) yapmak için, aşağıdaki reaktifler karışımı: 490 ml serum serbest keratinosit orta, 1.8 ml sığır hipofiz ekstresi, 10 ml diyaliz fetal sığır serumu, 10 mikrogram / 500 ul ml SCF, 562,5 4 mcg / mL bFGF ve 264 mikrogram / mL ET-3, 500 ul ul. Orta I: 10 ul 100 mg / ml 100 ml temel orta EGF ekleyin. Orta II: 2 ul EGF 100 ml temel orta ekleyin. Orta III: 720 ul CaCl 2 1 M 300 ml temel orta ekleyin. </li><li> Melanom cilt için yeniden: Orta I (100 ml), aşağıdaki reaktifler karışımı yapmak: DMEM, 72.5 ml, F12 24 ml (HAM Kullanıcı), 2 mL 200 mM L-glutamin, 269 g / ml, 200 200 ul hidrokortizon 500X ul ITES 0.05 200 ul O-phosphorylethanolamine M, 90 mM 200 ul adenin, 2 nM 200 ul Progesteron, 1 240 ul CaCl 2 M 10 nM 200 ul Siteye girmekle bu şartları ve chelexed yeni doğan buzağı serum 100 ul (100 ml serum Chelex 100 3 g çözülür 1.5 saat karıştırın 4 ° C, sterilize). Orta II (100 ml) yapmak için, aşağıdaki reaktifler karışımı: DMEM, 72.5 ml, F12 24 ml (HAM Kullanıcı), 2 mL 200 mM L-glutamin, 269 g / ml, 500X, 200 ul ITES 200 ul hidrokortizon, 200 ul 0.05 &#39;O-phosphorylethanolamine M, 200 mM 90 ul adenin, 2 nM 200 ul Progesteron, 1 M 240 ul CaCl2, 10 nM ve 100 ul yeni doğmuş buzağı serumu 200 ul Siteye girmekle bu şartları. Orta III (300ml) yapmak için, aşağıdaki reaktifler karışımı: DMEM, 142,5 ml, F12 142,5 ml (HAM Kullanıcı), 200 mM L-glutamin 6 ml, 269 g / ml, 500X, 600 ul ITES 600 ul hidrokortizon 0.05, 600 ul O-phosphorylethanolamine M, 600 mM 90 ul adenin, 2 nM 600 ul Progesteron, 1 720 ul CaCl 2 M, 10 nM ve 6 ml yeni doğmuş buzağı serumu 600 ul Siteye girmekle bu şartları. </li></ol></li><li> 0.05% tripsin / EDTA ile kültür şişeler insan keratinositler Trypsinize soya fasulyesi tripsin inhibitörü (250 mg / L 1x fosfat tamponlu salin) ile nötralize tripsin, aşağı dönmeye yeniden orta deride 4,17 x10 6 hücre / ml hücre pelletini tekrar süspansiyon I. </li><li> Cilt x10 6 hücre / mL orta I. yeniden aşağı döndürmek 0.83 hücre pelletini tekrar süspansiyon, soya fasulyesi tripsin inhibitörü nötralize tripsin ile,% 0.05 tripsin / EDTA ile insan melanosit veya melanom hücrelerinin kültür şişeler Trypsinize </li><li> Her ekleme hem de iç ve dış yıkama, orta çıkarın. </li><li> Cildin orta (iç ve dışında her ekleme 10 ml 1.5 ml) yeniden ekleyin. </li><li> Keratinosit ve melanosit veya melanom hücrelerinin 600 ul hücre süspansiyonu 600 ul hücre süspansiyonu atın iyice karıştırın. Her ucun içine damla 200 ul karışık hücre süspansiyonu damla koyun. Dermal kök hücre yeniden, sadece keratinosit süspansiyon 100 ul kullanın. 37 az 2 gün boyunca inkübe ° C. </li><li> Aspire cilt orta yenideniçinde ve her ucun dışında. Cilt orta II (içerden ve dışarıdan 10 ml 2 ml) yeniden ekleyin. 37 başka bir 2 gün boyunca inkübe ° C. </li><li> Aspire cilt içine orta II yeniden ve her ucun dışında, 7.5 ml deri sadece dışarıdan orta III yeniden ekleyin. Bu noktadan itibaren, yüzey havaya maruz kalma başlar yeniden yapılandırır. Orta III 18 gün kadar her gün değiştirin. </li><li> Hasat gün 18 cilt yeniden: <ol><li> Medya içinde ve dışında ekler aspire. </li><li> Forseps ile ekler tepsiden çıkarın. </li><li> Neşter bir bıçak ile bir daire kenarına yakın izleme (polikarbonat filtre dahil) yeniden Kes. </li><li> Yarısında sert bir yüzey üzerinde yeniden ve filtre kesin. </li></ol></li><li> Parafin bölümler için: 2 siyah TBS biyopsi makaleleri arasında bir histoloji kaset yeniden ve en fazla 4 saat süreyle% 10 formalin içinde tüm kaset emmek bir buçuk yerleştirin. Ardından% 70 etanol içinde kaset yeri ve 4 saklayın ° C parafine gömme için yeniden işlemek için hazır olana kadar. </li><li> Frozen için: <ol><li> Diğer yarısını yerleştirin 4% 50 sakaroz yeniden ° C, 1-2 saat, daha sonra 2M sakaroz değiştirmek ve başka bir 1-2 saat 4 ° C sıcaklıkta saklayın. </li><li> Teknenin yaklaşık% 50 doldurur, böylece tek bir baz kalıp içine optimum kesim sıcaklık donma medya (OCT) koyun. OCT kabarcıkları kaçının. </li><li> Forseps ile yeniden kenarına alın ve sakaroz yeniden kaldırmak. Kimwipes sakaroz absorbe kadar Kimwipes yerleştirin. </li><li> Forseps ve spatula kullanarak, OCT üstüne baz kalıp içine yeniden aktarın. Baz kalıp tamamen dolu olduğu kadar daha fazla OCT ile yeniden üst kapağı. Zor kesim yapacak OCT kabarcıkları zorunda değilsiniz emin olun. </li><li> Baz kalıp ezilmiş kuru buz üzerinde eşit olarak yerleştirin ve OCT tamamen dondurmak için izin. </li><li> Kalay folyo ile sarın ve temel kalıp -70 saklayın ° C ile bir Kriyostat kesmek için hazır olana kadar. </li></ol></li><li> Greft bir deri bir fare üzerinde yeniden: <ol><li> 5 ml DMEM (dondurma ve buz çözme fare cilt için) 50 ml şahin tüp hazırlayın. </li><li> 6 hafta etrafında bir kadın SCID tüysüz outbred fare kullanın. </li><li> Fare izofluran (EZ anestezi sistemi) ile anestezi: İlk anestezi 4 izofluran (% fare cerrahi yatağa taşındı önce) ve korumak anestezi ile işlem sırasında bir roket ucu konisi havalandırma yoluyla indüksiyon odasında yapılır (izofluran% 1.5-2 .) Hipotermi ve anestezi sırasında göz yaralanmasını önlemek için uygulanan steril oftalmik yağ önlemek için ısıtılmış bir yastık ısı desteği. </li><li> Bir beher içinde 600 ml su koyun ve 40 arasında su sıcaklığı tutmak için sıcak bir plaka üstüne bırakın - 60 ° C. </li><li> Bileşik benzoin tentürü ve alkol hazırlık bezlerden fare cilt temizleyin. </li><li> Fare sırt üstünde bir çizgi, daha sonra dikilmesi için aynı pozisyonda tutmak için işaretleyin. </li><li> Iris makas ve forseps kullanarak fare sırtın üst kısmında 1.2 cm çapında yuvarlak bir yara kesin. , Steril gazlı bez sünger ile yara yatak örtüsü. Tamamen donmuş kadar DMEM 5 ml yuvarlak fare cilt koyun, sonra sıvı azot kabı bırakmak. Defrost sıcak bir plaka üstüne sıcak su tüp tamamen çözülmüş kadar. 3 kez tekrarlayın. </li><li> Cilt cerrahi bıçak kullanarak transwell yeniden ve çok dikkatli bir şekilde membran kaldırmak Ayır, deride yara üstüne yeniden aktarmak (kadar epidermis tarafında). </li><li> Cilt yeniden üstüne farenin deri (epidermis kadar tarafı) yerleştirin. </li><li> Önceden etiketli marker ilk dikiş, fare derisi düzeltmek için iki tarafta sütürler daha sonra, alt tarafındaki ikinci olun. </li><li> Aşılama sonrası Temizlik fare cilt. Roket ucu konisi çıkarın ve uyanık ve ayaktan kadar ısıtılmış pad üzerinde fare tutmak. </li><li> Yeni bir kafesin içine fare koyun. </li><li> Ameliyattan hemen sonra deri altı enjeksiyon, ameliyat sonrası 24 saat ve 48 saat Meloksikam (1 mg / kg): operatif analjezi gönderin. </li></ol></li></ol> 2. Temsilcisi Sonuçlar: Cilt Normal melanositler ve dermal kök hücreleri ile yeniden yapılandırır Cilt, ekleriyle birlikte özel bir 6 kuyu tepsi kültüre yeniden yapılandırır. Dermal bölmesi (Şekil 1A), ilk dört gün için% 10 FBS ile DMEM kültür. Cilt yeniden orta keratinositler melanosit veya melanom hücrelerinin (Şekil 1B) numaralı seribaşı zaman kullanılır. Epidermis 9 gün havaya maruz kalan ve bu keratinositler (Şekil 1C) ayırt etmek için izin verir. 18 gün, cildin epidermis tabakalı keratinosit katmanlardan oluşmaktadır yeniden yapılandırır. Farklılaşmamış sırayla farklılaşmış bazal tabaka ve katmanları dikey odaklı (Şekil 1D). Lekemelanositik işaretleyici S100 ile yeniden yapılandırır bölümünde ing bu melanositlerin bazal tabakası olan epidermis ve iletişim dendrit uzantıları (Şekil 1E) yoluyla birden fazla keratinositler hizalanır gösterir. Dermal bölmesi bir kollajen tip I matriks içinde gömülü fibroblastlar içerir. Tevdi kollajen IV epidermis, dermis (Şekil 1F) ayıran bazal membran gösterir. Dermal kök hücreler (GFP lentiviral vektör ile etiketlenen) fibroblastlar kollajen ben matris gömülü ettiklerinde, epidermisin göç ve melanosit (1), (Şekil 2) farklılaşırlar. Epidermisin keratinositlerin çoklu katmanlar geliştirilmiştir. Cilt melanom tümörleri, yeniden yapılandırır Klinikopatolojik çalışmalar göstermektedir ki melanomlar kademeli bir şekilde ilerleme: sık görülen edinsel nevus, displastik nevüs, ALP (radyal büyüme fazı) melanomlar, VGP melanomlar (dikey büyüme fazı) ve metastatik melanomlar (7). Melanom hücre hatları farklı aşamalarında 2-GE kültürü (Şekil 3A-D) birbirlerine morfolojik olarak benzer ancak cildi yeniden yapılandırır dahil olduğunda, hücrelerin davranışını in vivo özellikleri yansıtır . Konumu ve normal melanosit büyüme hızı, sıkı deri (Şekil 3E) yeniden yapılandırır kontrol edilir. VGP melanomlar WM793 dermis (Şekil 3G) invaziv büyümeye ise ALP primer melanomlar WM35, epidermis (Şekil 3F) ağırlıklı olarak çoğalırlar. Metastatik melanomlar 1205Lu agresif derin dermis (Şekil 3H) işgal etti. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig1.jpg" /> Şekil 1. Cilt Normal melanositler ile yeniden yapılandırır. Cildin brüt görünümü AC gösterilir yeniden yapılandırır. A. Fibroblastlar kollajen ile karışık% 10 içeren DMEM FBS ve form dermal bölmesi yetiştirilmektedir. B. Keratinositler ve melanosit dermisin üst numaralı seribaşı ve yeniden orta deride gelişir. C. Epidermis 9 gün havaya maruz kalmaktadır. D. H &amp; E-lekeli cilt yeniden dikey olarak oluşan Epidermis, bazal tabaka odaklı, ve sırayla farklılaşmış tabakalı hücre tabakaları sunar. Dermis kollajen tip I matris gömülü fibroblastlar içerir. E. S100-pozitif melanosit (siyah ok), bazal membran ve iletişim birden fazla keratinositler ile hizalanır. F. Kollajen IV-boyama, epidermis, dermis ayıran bazal membran, gösterir. DF tüm renklendirmeler formalin ile fikse, parafine gömülü bölümler yapıldı. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig2.jpg" /> Şekil 2. Ciltte dermal kök hücreleri, epidermisin göç ve melanosit içine ayırt yeniden yapılandırır. Tohumlama keratinositler At 5 gün sonra, tek GFP pozitif hücreler (yeşil) kürelerden göç başlar . Epidermis, hala tek bir katman oluşur. 8 gün, birkaç hücre epidermis-dermis arabirimi ulaşır. 10. günde, GFP pozitif hücreler bazal membran pozisyonda sıkıca hizalanır. Göç, GFP pozitif hücreler epidermisin ifade melanositik işaretleyici HMB45 (kırmızı, beyaz oklarla gösterildiği gibi). Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Epidermis çoklu katmanlar olarak geliştirilmiştir. Bazal membran beyaz noktalı çizgiler ile gösterilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig3.jpg" /> Şekil 3. Cilt melanomlar farklı aşamalarında yeniden yapılandırır: AD. Normal melanositler ve melanom hücrelerinin 2D kültürlerde büyüdü. A. sünnet derisi Melanositler. B. ALP WM35 hücreleri. C. VGP WM793 hücreleri. D. metastatik melanom 1205Lu hücreleri. E. Normal melanositler bazal membran bulunmaktadır. F. ALP melanom WM35 hücreler epidermiste hücre kümeleri olarak büyür. G. VGP melanom WM793 hücreler bazal membran ile dermis içine işgal etti. H. metastatik melanom 1205Lu hücreleri agresif dermis derinliklerine işgal etti. Sorun Giderme <table border="1"><tbody><tr><td> Sorun </td><td> Sorun Giderme </td></tr><tr><td> Kollajen karışım katılaşmaya değildir </td><td> Kollajen karışımı rengi pembe saman sarı olmalıdır, aksi takdirde pH yanlış ve kollajen jel olmayabilir. Sarı rengi parlak, daha fazla sodyum bikarbonat damla damla ilave edilmelidir. </td></tr><tr><td> Kollajen erken mixuture içinde çökeltileri </td><td> Tüm bileşenleri kollajen karışımı yerleştirin üzerine yerleştirilir kadar buz tutunuz </td></tr><tr><td> Sözleşmeli kolajen (bir tarafı diğer tarafı daha kalın) bile değildir </td><td> Kalibre raf kuluçka </td></tr><tr><td> Epidermis en az üç keratinosit katmanları ile oluşur. </td><td> Alt geçişleri farklılaşmamış keratinositler kullanın </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents.">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+isn't+flat:+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).</li><li>Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+3D+cell+culture+system+for+investigating+cell+interactions+with+electrospun+fibers.">Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers.</a> Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).</li><li>Kremer, M., Lang, E., Berger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+engineering+of+differentiated+composite-skin+equivalents+of+human+keratinocytes+in+a+collagen-GAG+matrix+(INTEGRA+Artificial+Skin)+in+a+perfusion+culture+system.">Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system.</a> Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).</li><li>Esc&#225;mez, M. J., Garc&#237;, M., Larcher, F., Meana, A., Mu&#241;oz, E., Jorcano, J. L., Del R&#237;o, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+wound+healing+in+genetically+modified+skin-humanized+mice.">An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice.</a> J Invest Dermatol. 123, 1182-1191 (2004).</li><li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dermal+stem+cells+differentiate+into+functional+epidermal+melanocytes.">Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes.</a> J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).</li><li>Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M. Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D. E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T. M., Donatien, P., Crombleholme, T. M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF.</a> Am J Pathol. 156, 193-200 (2000).</li><li>Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S. M., Elder, D. E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K. L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+BRAF+mutation+and+p53+inactivation+during+transformation+of+a+subpopulation+of+primary+human+melanocytes.">The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes.</a> Am J Pathol. 174, 2367-2377 (2009).</li><li>Lee, J. T., Li, L., Brafford, P. A., van den Eijnden, M., Halloran, M. B., Sproesser, K., Haass, N. K., Smalley, K. S., Tsai, J., Bollag, G., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLX4032,+a+potent+inhibitor+of+the+B-Raf+V600E+oncogene,+selectively+inhibits+V600E-positive+melanomas.">PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 23, 820-827 (2010).</li><li>Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+inhibitor+of+oncogenic+B-Raf+kinase+with+potent+antimelanoma+activity.">Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz 3D cilt üreten normal insan melanosit, deri kök hücreleri ve melanom hücreleri ile yeniden yapılandırır tarif var. Tek tabakalı kültür yetiştirilen, melanositik hücreler, benzer bir morfoloji (basık, mil veya dendritik şekilli daha) klinik evre kökenlerine bakılmaksızın sunar. Buna karşılık, 3D cilt, melanom hücrelerinin aşamalı özgü özellikleri özetlemek yeniden yapılandırır. Normal insan melanosit tek bir hücre olarak epidermal ve dermal katmanlar arasındaki bazal membran bulunur. Daha agresif VGP melanom hücrelerinin bazal membran dermis içine kırarak büyük kümeler olarak büyümeye ise ALP primer melanom hücrelerinin bazal membran boyunca küçük küme olarak büyür. Metastatik melanom hücrelerinin tüm yönlerde büyümeye ve tek hücre veya kümeler gibi dermis derinliklerine işgal. Kantitatif analizler, invazyon derinliği ve yayılması ölçüde ölçerek bu model üzerinde yapılabilir. Yanı sıra, normal ve malign melanositik hücrelerin karakterizasyonu, model kullanarak doğrudan (E-kaderin upregülasyonu yoluyla keratinositler iyi niyetli iletişim kurmak epidermisin bazal tabaka ev ve olgunlaştı melanosit dermal kök hücrelerin farklılaşma, uyarabilir 6). Viral vektörler kullanarak, ya da etkinleştirmek veya melanosit dönüşüm mekanizmaları sadece çalışma için verimli bir model olmayı vaat ediyor dinamikleri ve her hücre türüne göre cilt genlerin fonksiyonel önemi daha iyi bir anlayış yeniden yapılandırır, gen fonksiyonu etkisiz hale değil, aynı zamanda ilerlemesini melanom (8). Hücre fenotipleri Uzun vadeli gözlem cilt bağışık yetmezliği olan hayvanların yeniden yapılandırır, aşılama ile mümkün olmuştur. Böyle bir insan-fare cilt chimera melanomagenesis ve melanom metastazı çalışma için mükemmel bir araştırma aracı. Cilt ilaç değerlendirilmesi için yararlı bir platform da olabilir yeniden yapılandırır. 2D kültür koşullarda kanser hücrelerini yok Birçok ilaç genellikle deneysel ve klinik uygulamalarda çok az etkisi var. Görüldüğü gibi in vivo tümör, 3D kültürlerde melanom hücrelerinin mikroçevresinin melanom sinyal yolları modüle düşündüren, 2D kültürlerde hücrelere yanıt ilaçlara dirençli. Başarılı bir ilaç keşfi için, 3D cilt yeniden modeli, in vivo bileşikler (9,10) etkileri tahmin etmek için ideal bir preklinik bir araçtır. Özetle, deri modelleri, in vitro ve in vivo çalışmalar arasında köprü yeniden . Onlar bu dönüşüme katkıda bulunan genler dönüşüm ve kök hücre nasıl yer aldığı daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> 10x EMEM </td><td> Bio Whittaker </td><td> 12-684F </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Hyclone </td><td> SH-30.071,02 </td></tr><tr><td> Sığır Tendon Asit-Çıkarılan Kollajen </td><td> Organogenez </td><td> 200/50 </td></tr><tr><td> Doku Kültürü ekler ile 6-iyi Tepsiler </td><td> Organogenez </td><td> 9285 </td></tr><tr><td> Keratinosit Serum Ücretsiz Orta </td><td> Gibco </td><td> 17005042 </td></tr><tr><td> Diyaliz Fötal Buzağı Serumu </td><td> Hyclone </td><td> SH-30.079,03 </td></tr><tr><td> Rekombinant İnsan Kök Hücre Faktörü </td><td> Fitzgerald Sektörler </td><td> RDI-307-255X </td></tr><tr><td> Temel FGF </td><td> Fitzgerald Sektörler </td><td> 30R-AF015 </td></tr><tr><td> Endotelin-3, insan </td><td> Amerikan Peptid A.Ş. </td><td> 88-5-10 </td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür </td><td> Sigma </td><td> C-7902 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> JRH biyoloji </td><td> 56.430-10L </td></tr><tr><td> F12 (HAM Kullanıcı) </td><td> Gibco </td><td> 11765-54 </td></tr><tr><td> Hidrokortizon </td><td> Sigma </td><td> H-0888 </td></tr><tr><td> İnsülin, transferrin, etanolamin, Selenyum (ITES) </td><td> BioWhittaker </td><td> 17839Z </td></tr><tr><td> O-Phosphorylethanolamine </td><td> Sigma </td><td> P0503 </td></tr><tr><td> Adenin </td><td> Sigma </td><td> A9795 </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> Sigma </td><td> P-8783 </td></tr><tr><td> Triiyodotironin </td><td> Sigma </td><td> T-5516 </td></tr><tr><td> Yenidoğan buzağı serumu </td><td> Hyclone </td><td> SH3011802 </td></tr><tr><td> 10% formalin tampon </td><td> Surgipath </td><td> 00600 </td></tr><tr><td> Optimal kesme sıcaklığı donma medya (OCT) </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Çok kasetleri </td><td> Surgipath </td><td> 02.293-BX </td></tr><tr><td> TBS biyopsi kağıtları </td><td> Üçgen Biyomedikal Bilimleri </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> TBS biyopsi kağıtları </td><td> Üçgen Biyomedikal Bilimleri </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> Tek kullanımlık Base Kalıplar </td><td> Balıkçı </td><td> 15-182-501C </td></tr><tr><td> Bileşik benzoin tentürü </td><td> Profesyonel Tek, Inc. </td><td> S42450 </td></tr><tr><td> Alkol Hazırlık Swablar </td><td> CVS eczane </td><td></td></tr><tr><td> İpek Siyah Örgülü 5-0 </td><td> Ethicon </td><td> 682G </td></tr><tr><td> Tül süngerler (steril) </td><td> CVS eczane </td><td></td></tr><tr><td> Forseps </td><td> Roboz </td><td> RS5070 </td></tr><tr><td> İris makası </td><td> Roboz </td><td> RS5913 </td></tr><tr><td> Cerrahi bıçaklar </td><td> Tüy </td><td> 2976 </td></tr><tr><td> EZ anestezi </td><td> Euthanex Corp. </td><td></td></tr><tr><td> SCID tüysüz outbred fare </td><td> Charles nehir </td><td></td></tr></tbody></table>

the three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal  skin and melanoma progression

Biriken hücreler farklı davranırlar 3D ekstra-hücresel matrisi içinde yetiştirilen ve aynı zamanda diğer hücreleri ile (1-5) etkileşim içinde olduğunu gösterir iken Çoğu in vitro çalışmalarda deneysel cilt biyoloji, 2-boyutlu (2D) monokültürler yapılmıştır var . Fare modelleri geniş in vivo doku morfolojilerinden incelemek için kullanılmıştır. Ancak fare ve insan deri, hücre mimarisi ve fizyolojisi, zor insanlar için fare çalışmalar yapmamızı da yapar önemli farklılıklar var. Fare deride melanosit çoğunlukla saç köklerinin lokalize olduğundan, onlar, epidermisin bazal tabaka öncelikle bulmak insanların bu farklı biyolojik özellikleri var. 3D insan derisinin son gelişme modelleri, hücre-matriks ve hücre-hücre etkileşimleri farklı hücre türleri arasındaki araştırmak için alanında sağladı yeniden. Gömülü fibroblastlar kollajen I matrisi, tabakalı, farklılaştırılmış keratinositler ve fonksiyonel bir bazal membran, dermis epidermis ayıran oluşan bir &quot;Epidermis&quot;, bir &quot;dermis&quot; oluşur yeniden yapılandırır. Kollajen, iskele, besin teslimat ve hücre-hücre etkileşimi için potansiyeli sağlar. Melanositik hücreler, insan derisinde melanosit homeostazı ve melanom ilerlemesi doğal özellikleri özetlemek içeren 3D deri modelleri. In vivo olarak, yeniden inşa deride melanosit, bazal tabaka keratinositler serpiştirilmiş bazal membran lokalize . Melanom hücreleri, in vivo olarak orijinal tümör evresi (ALP, VGP ve metastatik melanom hücrelerinin) yansıtan aynı özellikleri gösterirler . Son zamanlarda, dermal kök hücreler, insan dermis (6) tespit edilmiştir. Bu çok güçlü kök hücreleri epidermisin göç ve melanosit ayırt etmek için kullanılır.

Watch this Scientific Journal Video about The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression at JoVE.com

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Bu raporda, üç boyutlu bir cilt, mimari ve kompozisyon insan deri taklit modeli yeniden açıklar. Melanosit fizyolojisi, melanom ilerlemesi ve dermal kök hücre kaderi cilt modeli yeniden kullanarak incelenmiştir. Model preklinik ilaç değerlendirilmesi için bir araç olarak da yararlıdır.

Üç Boyutlu İnsan Cilt Model Yeniden İnşa: Aracı Normal Cilt ve Melanom İlerleme Eğitim

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

the-three-dimensional-human-skin-reconstruct-model-tool-to-study

Research

JoVE Journal

Bioengineering

49.2K Görüntüleme.  The Wistar Institute. Bu raporda, üç boyutlu bir cilt, mimari ve kompozisyon insan deri taklit modeli yeniden açıklar. Melanosit fizyolojisi, melanom ilerlemesi ve dermal kök hücre kaderi cilt modeli yeniden kullanarak incelenmiştir. Model preklinik ilaç değerlendirilmesi için bir araç olarak da yararlıdır.

Video: The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

İletken Mürekkepler düzlemsel ve Üç Boyutlu Baskı

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Biyomühendislik

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Cilt Tip I Kolajen hazırlanması için geliştirilmiş bir yöntem

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Model Vocal Fold Polip'in Neden Olduğu Üç Boyutlu Akış Ayrımının Araştırılması

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Üç boyutlu Mürekkep Püskürtmeli Baskı Teknolojisi Kullanımı İnsan Kıkırdak Doku Fabrikasyon

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

A Tam Cilt Hata Modeli Biyomateryallerin vaskülarizasyonunu değerlendirin<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

İnsan bağırsak mukozasının bir Multisellüler Üç boyutlu Organotipik Modelinin Geliştirilmesi yerçekimi Yetiştirilen

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

Makromoleküler Kalabalık Kullanılarak İnsan Kutanöz Hipertrofik YaraNın In Vitro Modeli

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Büyük Ölçekte Üç Boyutlu Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi Yetiştirmek

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Kendi Kendine Monte Edilmiş Vaskülerleştirilmiş İnsan Derisi Eşdeğerlerinin Üretimi

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...