Bu protokolde sağlanan ayrıntı, genellikle teknik olarak zorlayıcı olan insan derisi eşdeğeri üretimi ele alıyor. Vaskülat ve hacimsel görüntüleme gibi yeni insan derisi eşdeğeri protokol elemanları dahildir. Teknik, hastalıkların, yaşlanmanın ve kişiselleştirilmiş tıbbın incelenmesi için in-vivo doku ile daha yakından eşleşen bir cilt modelinin basit bir şekilde inşasını sağlar.
Bu protokolün en zorlu kısmı, dalgıçlık ve hava sıvısı arayüzü arasındaki bir geçiştir. Tutarlı sonuçlar için zamanlama ve medya seviyelerini optimize etmek için muhtemelen birkaç deneme yapılacaktır. Başlamak için, soğuk kaplı bir tüpe 516 mikrolitre ortam ekleyin ve hemen 1000 mikrolitre pozitif deplasman pipetini kullanarak 375 mikrolitre soğuk kollajen ekleyin.
Boş pipet ucunu çıkarın ve karıştırmak için hazırlanan 250 mikroliter pozitif deplasmanlı pipete geçin. Aşırı kabarcık oluşumunu önlemek için hızlı, ancak hafifçe karıştırın. Ucu çözeltide tutarak, çözelti tipik olarak yaklaşık beş pipet döngüsü veya 10 saniye süren homojen renkte olana kadar tüpün farklı konumlarından düzgün bir şekilde karıştırın.
12 kuyulu kültür kesici ucunun zarına hemen 125 mikrolitre hücresel kollajen dağıtın. Düzgün kapsama alanı sağlamak için plakayı eğin ve kollajeni hafifçe etrafa yayarak zarı boyamak için pipet ucunu kullanın. 12 kuyu plakasını hemen 37 derecelik bir santigrat hücre kültürü inkübatörüne taşıyarak en az 20 dakika jel hale getirmek için hareket ettirin.
Jelleşme döneminden sonra, 12 kuyulu kollajen plakasını inkübatörden alın. 1,7 mililitrelik kapaklı tüpü ıslak buzdan çıkarın, ardından stok kolajenini soğutmadan çıkarın ve kapağı açık ıslak buza yerleştirin. Soğuk kapaklı tüpe 516 mikrolitre soğutulmuş hücre süspansiyonu ekleyin.
1000 mikrolitre pipet kullanarak 375 mikrolitre soğuk kollajen çözeltisini doğrudan kapaklı tüpün içindeki çözeltiye hemen pipetledi. Tüm kollajenleri pipetten tüpe atın ve pozitif deplasman pipet ucunu atın. Hemen 250 mikrolitre pipete geçin ve kollajen çözeltisini karıştırın Karıştırılınca, 250 mikrolitre hücresel kollajen çözeltisini 12 kuyulu kültür kesici uçtaki hücresel kollajen desteklerine aktarın, ardından 12 kuyu plakasını 37 santigrat derece hücre kültürü inkübatörüne taşıyın.
30 dakikalık jel süresinden sonra, jeli değerlendirmek ve kolajenin katılaşmış olduğundan emin olmak için plakayı hafifçe eğin. Kesici ucun üst odasına ve alt odasına sırasıyla 500 mikrolitre ve 1000 mikrolitre karışım ortamı ekleyin. Gerekirse daha fazla ortam ekleyerek kollajen jelinin suya batırıldığından emin olun.
Kuyu plakasını gece kuluçka için hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Yedinci submersion gününde, her yapının alt ve üst odasındaki medyayı toplamak ve atmak için manuel bir pipet kullanın. Geçirgen membranın doğrudan altına sıkışmış medyayı toplamak için pipet ucunu zarın altına yerleştirin ve kesici ucu geçici olarak yerinden atın.
Her kuyunun alt odasına bir mililitre insan derisi eşdeğeri veya %5 FPS ile desteklenmiş İsG ortamı ve her kuyunun üst odasına 200 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Keratinositleri doğrudan dermal yapı yüzeyine tohumlayın ve inkübatörde iki saat yerleşmelerini sağlar. Keratinositlerin tohumlanlarından iki saat sonra, her yapının üst odasına% 5 FPS ile desteklenmiş 300 mikrolitre HSE ortamı dikkatlice ekleyin.
Ortamı yükledikten sonra, yapıyı inkübatöre geri yerleştirin. Manuel pipet kullanarak, her yapıyı yalnızca üst bölmeden medya atıklarını kaldırarak hava sıvısı arayüzüne veya ALI'ye kaldırın. Epidermal tabakaya dokunmadan veya zarar vermeden mümkün olduğunca yaklaşmaya çalışın.
Ortamı toplamak için plakaları farklı açılarda hafifçe eğin, ardından tutarlı nemi korumak için plakadaki çevredeki kuyulara yaklaşık iki mililitre steril su ekleyin. Keratinositlerin hala ALI'de olduğundan emin olmak için birkaç saat sonra plakayı kontrol edin. Her kuyudan ne kadar ortam çıkarıldığını takip ederek üst bölmedeki herhangi bir ortamı kaldırın.
Epidermal katmanlar kuru değil, nemli görünmelidir, ancak yapının üstünde birikmiş ortam olmamalıdır. Yapıyı immünoresan lekelenmeye hazırlamak için, bir kesici ucu ters çevirin ve kuyu plakasının üzerine yerleştirin. Membran çevresinin yaklaşık yarısını kesmek için ince uçlu önps veya hassas bir bıçak kullanırken kesici ucu tek elle sabitleyin.
Plastik muhafazaya mümkün olduğunca yakın kesin. İnce uçlu asaları kullanarak, kesilmiş membran kapağının kenarını tutun ve gözenekli zarı kesici ucun yanı sıra VHSE yapısından hafifçe soyun. Yapı odanın kenarına sıkışırsa, kuyuya taşımak için ince uçlu uzun uçluları veya küçük bir kepçeyi kullanın.
VHSE kuyuya girdikten sonra, kesici uç zarının kalan parçalarını atın ve boyama sırasında VHSE'leri batık bir konumda tutmak için kültürün her kuyuda muhafazasını tutun. Görüntülemeden iki gün önce polidimetilsiloksina veya PDMS hazırlayın. Herhangi bir temiz karıştırma kabını tartım terazisine yerleştirin ve tartıyı daralayın.
Tabanı ekleyin, sonra çapraz bağlantıyı ekleyin. Çözeltiyi en az dört dakika boyunca kuvvetlice karıştırın ve küçük kabarcıklar oluşturun. Yeterli karıştırmadan sonra, PDMS'yi 90 veya 100 milimetrelik bir Petri kabına dökün.
Tüm kabarcıklar kaybolana ve PDMS temizlenine kadar PDMS'yi vakum odasında gazdan arındırın. Vakumun yavaşça serbest bırakılması ve PDMS'nin çıkarılması. Yemeği, PDMS'nin eşit şekilde tedavi etmesi için düz oturduğundan emin olarak, 50 ila 60 santigrat derecede bir gecede kürleme için bir fırına yerleştirin.
Görüntülemeden bir gün önce, VHSE yapısıyla aynı boyutta, PDMS sayfasından dairesel bir kuyuyu delmek veya kesmek için çelik bir zımba veya el tipi hassas bıçak kullanın. Tek bir PDMS kuyusu oluşturmak için dairesel kuyunun etrafına kare bir yama kesin. PDMS ile benzer boyutta bir cam kapak kayması kullanarak PDMS'nin alt yüzeyine siyanoakrilat tutkal ekleyin ve tek kullanımlık pipet ucuyla eşit şekilde sürün.
Camı ortalayın ve delikli daire içinde açık bir cam pencere bırakırken PDMS'ye iyi bastırın. Kullanmadan önce tutkalın gece boyunca kurumasına izin verin. Epidermisin ve dermisin karakterizasyonu VHSE yapılarında insan cildi için uygun immünofluoresan belirteçleri gösterir.
Sitokeratin 10, genellikle cilt eşdeğerlerindeki tüm suprabasal katmanları işaretleyen erken farklılaşma keratinosit belirtecidir. involucrin ve filaggrin keratinositlerde geç farklılaşma belirteçleridir ve cilt eşdeğerlerinde en üst en suprabasal tabakaları işaretler. VHSE'nin temizlenmesi, tek bir ayarda basit görüntülemeye izin verdi ve dermis ve epidermisi ayrı ayrı görüntülemek için yapıyı yeniden yönlendirme ihtiyacını ortadan kaldırdı.
Hacimsel görüntüler, her yapı boyunca vaskülat haritalamak için 3D renderlar oluşturmayı mümkün klar. Görüntü yığınları hesaplama yazılımına yüklendi ve 3D işleme ve niceleme için özel bir algoritma kullanıldı. İskeletleşme, kollajen IV işaretli her damarın kesin merkezini belirledi ve elde edilen veriler damar çapının yanı sıra vasküler fraksiyonu hesaplamak için kullanıldı.
Bu işlemi takiben, vaskülatürün özellikle epidermal olgunlaşma ve stabiliteyi nasıl etkilediğini anlamak için bariyer analizi, tarama elektron mikroskopisi, lipit profilleri ve diğerleri gibi karakterizasyon yöntemleri yapılabilir. Bu protokol, damarlı bir cilt modelinde doku ile ilgili ve hücre tipine özgü çalışmalara olanak sağlar. Özellikle yaşlanma ve kişiselleştirilmiş tıp araştırmaları için uygundur.
