Bu çalışma, NCI (R01-94160 ve R01-155086), IU Simon Kanser Merkezi ve Pediatrik Araştırma Wells Merkezi tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışma Tıp Indiana Üniversitesi de IACUC Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Doğru Genotiplerinin ile Fare oluşturun <ol><li> BCC bir fare modeli oluşturulması. R26-SmoM2 YFP fareler (Jackson laboratuvar stok numarası 005.130) (18) ile arkadaşı K14-CreER fareler (Jackson laboratuvar stok numarası 005.107) K14-Creer + ve R26-SmoM2 YFP + fareler üretmek için. </li><li> Genotiplendirme gerçekleştirin. 1 mg / ml proteinaz K ile directPCR kuyruk lizis çözeltisi içinde bırakın kuyruk örnekleri (0.5 cm uzunluğunda), 55 ° C de çalkalanarak gece boyunca karıştırıldı. Sonraki gün, (genotipleme için supernatant tutmak için), bir mikro-santrifüj en yüksek hızda santrifüj ile doku çöküntüsü ortadan kaldırmak. Satıcı tarafından tavsiye edilen primerler ve koşullar her PCR reaksiyonu için süpernatan 1 ul kullanımı. Doğru genotipler (3-6 hafta yaş, 0.05-0.1 de buprenorfin de mg / kg kuyruk kelepir sonra 2-3 gün SQ her 8-12 saat ile uygulanacaktır) fo ile farelerin seçinr adım 2. </li></ol> 2. Cilt Keratinositler içinde SmoM2 ifadesi neden , Bir beslenme iğnesi (20 çap kavisli), oral gavaj yoluyla 5 gün arka arkaya tamoksifen (her bir besleme bitkisel yağ, 50 ml 5 ug / kg vücut ağırlığı), oral yolla, keratinositlerde SmoM2 indüke. 3. Cilt Örnekler hazırlanması Genel olarak, fenotipleri K14creER/R26SmoM2 GFP farelerde kulak ve kuyruk daha şiddetli. Hücre analiz için hazırlamak için, öncelikle kurumsal Onaylanan prosedür (CO 2 artı servikal dislokasyon) ile hayvan kurban sonra fare deri hasat. 4. Epidermis izole <ol><li> Onaylanmış bir işlem (adım 3) ile kurban fareler sonra, bir düzenleyici kullanarak kürk çıkarın. 37 dispaz çözeltisi (% 10 FBS ile DMEM içinde 5 mg / ml), 1-2 ° saat (en az 8 haftalık ve 2 saat için farenin C&#39;de 1 saat boyunca daldırın deri örneği) 8 haftadan daha eski fareler için. </li><li> Ardından dispase tedavi, forseps ile dermis ayrı epidermis. </li></ol> 5. Tek Hücreler oluşturmak <ol><li> Tek bir hücre popülasyonu elde etmek için, bir 50 ml tüp içinde 37 ° C&#39;de 1-2 saat boyunca kollajenaz IV çözeltisi (% 10 FBS ile DMEM içinde, 1 mg / ml) içine daldırın ardından makas ile epidermis ve kıyma. Yavaşça girdap tüpler hücre disassociation yardımcı olmak için her 20 dakika çalışın. </li><li> Mikroskop altında hücre disassociation kontrol edin. Tek hücre kolajenaz ortam içinde tespit edilebilir, hücre verimi artırmak için ek bir 30 dakika boyunca numune inkübe edin. Genel olarak, bir fare, epidermis 7 hücreleri 10 kadar verim olabilir. </li><li> Tezgah üstü santrifüj ile 1500 rpm hücre süzgecinden (gözenek boyutu 70 mikron), spin hücreleri dokuya karışımı aşağı filtre ve PBS ile zaman bir kez yıkayın. </li></ol> 6. Etiket Hücreler ve Sitometrisi Analizleri yapın <ol><li> % 10 FBS içinde yeniden süspanse hücreleriPBS içinde 2.5 x 10 6 hücre / spesifik olmayan bağlanmasını bloke etme ml &#39;de (buz üzerinde 30 dakika süre ile) </li><li> Belirli bir antikor etiketlemesi için 1.5 ml&#39;lik mikrotüp içinde her bir hücre porsiyonunun al. 2 ug / ml &#39;lik bir son konsantrasyonda her bir tüp için farklı antikor ekleyin. Birkaç saniye boyunca hafif bir tepe noktası ile hücreleri ile antikor karıştırın ve 1 ml PBS ile yıkamak, ardından 30 dakika boyunca buz üzerinde bırakın. , Vimentin-FITC (fibroblast) (ayrıntılar için reaktif bakınız) CD11b-PE artı Gr1-APC (miyeloid hücreleri veya myeloid kökenli baskılayıcı hücreler): BCC örnekler için, aşağıdaki biyolojik için antikorlar kullanılır. </li><li> Hücre içi boyama için, bir kit kullanımı ve (ayrıntılar için Reaktifler bakınız) satıcının el izleyin. Biz hücre yüzey belirteçleri analiz etmek için taze hücreleri kullanır. Yüzey işaretleyici boyama sonra, hücreleri yıkayın ve PBS içinde onları tekrar süspansiyon. 1 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda hücre karışımı DAPI ekleyin. DAPI daha analizlerden kapılı çıkacak ölü hücreleri leke olacaktır. </li><li> Specifi verileri analizc yazılım. Biz ilk FSC vs SSC arsa dayalı tek hücreleri seçin, ve daha fazla analiz için DAPI negatif nüfus (canlı hücreler) kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Rogers, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+estimate+of+nonmelanoma+skin+cancer+in+the+United+States.">Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States.</a> Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).</li><li>Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas:+attack+of+the+hedgehog.">Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).</li><li>Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+hedgehog-signaling+pathway+in+human+cancer+and+the+clinical+implications.">Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications.</a> Oncogene. 29, 469-481 (2010).</li><li>Johnson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+homolog+of+patched,+a+candidate+gene+for+the+basal+cell+nevus+syndrome.">Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome.</a> Science. 272, 1668-1671 (1996).</li><li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+patched+homolog+is+expressed+in+target+tissues+of+sonic+hedgehog+and+maps+to+a+region+associated+with+developmental+abnormalities.">A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities.</a> J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).</li><li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+human+homolog+of+Drosophila+patched+in+the+nevoid+basal+cell+carcinoma+syndrome.">Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome.</a> Cell. 85, 841-851 (1996).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+Smoothened+mutations+in+sporadic+basal-cell+carcinoma.">Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma.</a> Nature. 391, 90-92 (1998).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+SMOH+in+sporadic+basal+cell+carcinomas+of+the+skin+and+primitive+neuroectodermal+tumors+of+the+central+nervous+system.">Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system.</a> Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).</li><li>Lam, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+frequent+activated+smoothened+mutation+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas.</a> Oncogene. 18, 833-836 (1999).</li><li>Nilsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+basal+cell+carcinomas+and+trichoepitheliomas+in+mice+overexpressing+GLI-1.">Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).</li><li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+oncogenic+potential+of+Gli2:+deletion+of+an+NH(2)-terminal+fragment+alters+skin+tumor+phenotype.">Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype.</a> Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+the+PTCH,+SMOH,+SUFUH+and+TP53+genes+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas.</a> Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).</li><li>Guha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+inhibitor+gets+landmark+skin+cancer+approval,+but+questions+remain+for+wider+potential.">Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).</li><li>Sekulic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+vismodegib+in+advanced+basal-cell+carcinoma.">Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).</li><li>Tang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+the+hedgehog+pathway+in+patients+with+the+basal-cell+nevus+syndrome.">Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).</li><li>Aszterbaum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+and+ionizing+radiation+enhance+the+growth+of+BCCs+and+trichoblastomas+in+patched+heterozygous+knockout+mice.">Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice.</a> Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).</li><li>Pazzaglia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+patched-associated+susceptibility+to+radiation+induced+tumorigenesis+by+genetic+background.">Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background.</a> Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).</li><li>Athar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+smoothened+signaling+prevents+ultraviolet+B-induced+basal+cell+carcinomas+through+regulation+of+Fas+expression+and+apoptosis.">Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis.</a> Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).</li><li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinoma+and+its+development:+insights+from+radiation-induced+tumors+in+Ptch1-deficient+mice.">Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice.</a> Cancer Res. 64, 934-941 (2004).</li><li>Ellis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patched+1+conditional+null+allele+in+mice.">Patched 1 conditional null allele in mice.</a> Genesis. 36, 158-161 (2003).</li><li>Mao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+somatic+mouse+model+to+survey+tumorigenic+potential+applied+to+the+Hedgehog+pathway.">A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway.</a> Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).</li><li>Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas+arise+from+hair+follicle+stem+cells+in+Ptch1(+/-)+mice.">Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice.</a> Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).</li><li>Grachtchouk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas+in+mice+arise+from+hair+follicle+stem+cells+and+multiple+epithelial+progenitor+populations.">Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations.</a> J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).</li><li>Kasper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+enhances+epidermal+tumorigenesis+by+recruiting+hair+follicle+keratinocytes.">Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).</li><li>Youssef, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cell+lineage+at+the+origin+of+basal+cell+carcinoma.">Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma.</a> Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).</li><li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoothened+mutation+confers+resistance+to+a+Hedgehog+pathway+inhibitor+in+medulloblastoma.">Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma.</a> Science. 326, 572-574 (2009).</li><li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma.">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).</li><li>Dijkgraaf, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+GDC-0449+refractory+smoothened+mutants+and+downstream+mechanisms+of+drug+resistance.">Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance.</a> Cancer Res. 71, 435-444 (2011).</li><li>Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+epithelial+stem+cells+from+human+skin.">Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin.</a> J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).</li><li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+human+skin+reconstruct+model:+a+tool+to+study+normal+skin+and+melanoma+progression.">The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression.</a> J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).</li><li>Anacker, D., Moody, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+organotypic+raft+cultures+from+primary+human+keratinocytes.">Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes.</a> J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Biz BCC hücre nüfusu analizi için bir yöntem tanımlanmıştır. Tümör dokusu birçok hücre tipleri tutarlı ve her hücre tipi in vitro koşullarda en iyi altında bile yeniden ele geçirmek için çok zor olan, kanser belirli bir zamanda farklı davranır. Bu protokol kullanarak, bazal hücreli karsinom gelişimi epidermal kök hücrelerin genişlemesi hem de miyeloid hücrelerin işe eşlik gösterdi. Immünohistokimya veya immünofloresan analiz ile karşılaştırıldığında, hücre popülasyonunu analiz hücre tipleri, çeşitli antikorlar mevcut olduğu için spesifik hücre popülasyonunun değişikliklerin daha nicel bir değerlendirme vermek mevcuttur. Gen indüksiyon gelen fenotipik değişim zaman gerektirir, çünkü bu protokolü için, 10 hafta çalışma tamamlamak için ihtiyaç vardır. Bu vaktinden deneme planı bu nedenle önemlidir. Hücre izolasyonu ve analizler için, iki tam gün gerekli olabilir. Canlı hücrelerin analizi çalışan kullanıldığı içines, vaktinden önce bir FACSCalibur rezerv önemlidir. Bu protokol (bkz. aşağıda) ile çalışırken biz de ortak sorunları listeledik. Bizim tecrübelerimize göre, aşağıda karşılaştığımız ortak sorunları şunlardır: <ol><li> Epidermisin Poor ayrılması: Bu eksik dispase tedavi (diapase tedavi süresini artırmak Lütfen) veya yetersiz dispase çözüm (cilt tamamen dispase çözüm dalmış gereken) neden olabilir. Biz bir fare dispaz çözeltisinin en az 5 ml kullanın. Hacim cilt boyutuna göre değişebilir. </li><li> Kollajenaz IV eksik sindirim nedeniyle bu olabilir: hücre sayısı düşük verim. Ilk onay kollajenaz konsantrasyon veya son kullanma tarihi olun. Bu, aynı zamanda el epidermis yetersiz miktarda neden olabilir. Ayrıca, enzim sindirimi ° C (sindirim gerçekleştirmeden önce sıcaklığını ayarlamak lütfen) sallayarak ile 37 için yapılmalıdır. </li><li> Hücre kümeleri: Bu (cilt hücreleri için pipet hücreleri çok yaygındırbirkaç kez süzgeç (santrifüj önce), veya Mg 2 varlığı geçtikten sonra + ve Ca 2 + çözüm (Mg 2 kullanın hücre yıkama için + ve Ca 2 + ücretsiz PBS). </li><li> Çok fazla ölü hücreleri: Bu (taze dokular kullanın) bozulmuş dokuların bir sonucu olabilir, ya da olabilir aşırı sindirim (dispase ve kollajenaz IV ile uzun kuluçka kaçının). </li></ol> Bu protokol, kemik iliği transplantasyonu ve hücre kökenli incelemek için doku nakli ile kombine edilebilir. Örneğin, bir organ nakli GFP-ifade ölümcül ışınlanmış farenin Kemik iliği hücreleri bize tümörle ilişkili fibroblastlar ve miyeloid hücreler, kemik iliği hücrelerinin katkısını incelemek için izin verir. Benzer şekilde, deri tümörleri tümör-konak etkileşimleri incelemek için yeni bir fare ev sahibi naklediliyor olabilir. Karsinogenezis sırasında hücre popülasyonu değişiklikleri incelemek ek olarak, bu protokol aynı zamanda araştırmacılar incelemek sağlayacaktümör ortamında hücrelere ilaç tedavilerinin etkilerini. Bu protokol cilt sırasında hücre popülasyonu analiz için kullanmak için tasarlanmış olsa da kanser, küçük değişiklikler diğer kanser türleri için yapılabilir. Özet olarak, cilt kanseri fare modellerinde hücre popülasyonu analizler neoplastik dönüşüm hücre biyolojisi daha iyi bir anlayış yol açan kanser sırasında dinamik hücresel değişiklikler ve dönüşüm sürecinde farklı hücresel olayları verebilir.

Insan kanserinin en yaygın türü olarak, bazal hücreli karsinom (BHK) 1 yıl başına yaklaşık 2 milyon Amerikalı etkiler. Biriken deliller kirpi (Hh) sinyal bu anormal aktivasyonu göstermektedir BCC geliştirme (2,3 yorum) altında yatan itici güçtür. BCC içinde sinyal Hh içinde değişiklikler inaktive PTCH1 4-6 mutasyonlar, SMO 7-9 kazanç fonksiyon-mutasyonlar ve Hh yol transkripsiyon faktörleri GLI1 10 ve GLI2 11 veya negatif regülatörü Su nadir inaktive mutasyonlar (Fu sapkın ifade içerir ) 12. Tüm bu ve diğer çalışmalar sayesinde, Federal İlaç İdaresi (FDA) son zamanlarda BCC 13-15 metastatik ve lokal ileri tedavi etmek için Hh sinyal inhibitörü Vismodegib en kullanımını onayladı. Tüm bu başarıları 16 rağmen, biz hala Hh sinyalizasyon carc sürücüler hangi moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamıyoruminogenesis. Hh sinyal doku-spesifik aktivasyon kullanarak hayvan modelleri kurulması bu çalışmalar için ve ilaç direnci anlayışımız için hala önemlidir. Farelerde, wild-tip farelerden bile, kanserojen UV veya iyonlaştırıcı radyasyon ağır dozda altında, BCC gelişmez. Bunun aksine, Ptch1 + / - farenin BCC gelişimi 17,18 duyarlıdır. Normal şartlar altında muhafaza edilmesi durumunda fareler nadiren anaç BCC geliştirmek - Ptch1 içinde BCC gelişme penetranslı + / - Ptch1 + / rağmen fareler% 50 üzerinde 18,19 olduğunu. Ptch1 embriyonik öldürücülüğü bağlı olarak - / -, PTCH1 doku spesifik nakavt Çalışmada, genel olarak 20 için kullanılır. Buna ek olarak, onkojenik SmoM2 YFP (KRT14-Creer: R26-SmoM2 YFP veya KRT14-CRE: R26-SmoM2 YFP) koşullu cilt özgü ifade için kolay genetik test sağlayan, çok erken yaşta birden fazla mikroskobik BCC oluşumuna yol açar Hh sinyalizasyon yapmakSMO 21 wnstream. BCC biyoloji bilgimiz üç büyük sorunlar vardır. İlk olarak, BCC ve hücresel kökeni tam olarak belli değil. Bazı çalışmalarda kök hücre sitesi 22-24 olarak saç folikülünün ödün desteği ise, Youssef ve ark. 25 saç kökü olarak, arası foliküler epidermis bölgesinde olduğu deri Hh odaklı tümörlerin kökenli fare hücre değil lokalize , bir ROSA26 odaklı transgenik mutant SMO ifade etkinleştirmek için hücre spesifik Cre kullanarak. BCC gelişimi sırasında İkincisi, hücresel etkileşimleri iyi anlaşılmış değildir. Bu aktif Hh sinyal ile keratinositlerin BCC oluşumuna yol açabilir bilinmektedir, ancak diğer hücresel değişiklikler well-anlaşılamamıştır. Ayrıca, farelerde SMO antagonistlerinin tedavi ilaç direnci 26-28 yol açabilir. BCC için böylece yeni hedefler büyük ölçüde ihtiyaç vardır. Bu üç konu anlamak Carcinog sırasında farelerde hücresel değişikliklerin analizleri gerektirirEnesis. Çeşitli yöntemler keratinosit kültürü, akım sitometri ve cilt kök hücre izolasyonu 29-31 için yayınlanmış olsa da, fare BCC hücre analizi için kapsamlı bir prosedürler bulunamamıştır. BCC fare modeli, epidermis ayrılması, doku ve hücre analizlerden tek hücre üretimi için yöntemleri birleştirerek, BCC gelişimi sırasında hücre sinyal, hücresel ve moleküler etkileşimleri çalışmak için prosedürlerin bir dizi ile okuyucuların sağlayacaktır. Bu protokol okuyucular her bir işlem gerçekleştirilir nasıl görmek için izin inanıyoruz. Ayrıca, sonuçlar nasıl olması gerektiğini göstermek için bazı veriler elde ve okuyucular bu işlemler yerine sırasında zorlukların üstesinden gelmek için yardımcı olmak için sorun giderme.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagents</td>
 <td> Company</td>
 <td> Cat#</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>directPCR lysis reagent (tail) </td>
 <td>Viagen Biotech </td>
 <td>102-T </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>proteinase K </td>
 <td> Sigma </td>
 <td>P2308 </td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ApliTag 360 taq polymerase </td>
 <td>Applied biosystems </td>
 <td>N8080155 </td>
 <td> store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tamoxifen </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T5648 </td>
 <td> store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Feeding needle (20 gauge) </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>01-290-9B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase </td>
 <td>Roche Diagnostic </td>
 <td>04942078001</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase IV </td>
 <td>Worthington </td>
 <td>LS004189</td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell strainer </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>08-771-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-CD11b-PE </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 12-0112-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Gr1-APC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 17-5931-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-vimentin-FITC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>11-9897-80 </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

cell population analyses during skin carcinogenesis

Kanser gelişimi kanser öncüsü hücreler, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri gibi birçok hücre tipleri içeren bir çok adımlı bir işlemdir. Hücrelerin her tür kanser sırasında sinyalizasyon ve fonksiyonel değişikliklere uğrar. Birçok kanser araştırmacılar için geçerli zorluk in vivo çoklu adım süreci sırasında her bir hücre tipi bu değişiklikleri incelemek için. Son birkaç yıldır, yazarlar K14creER/R26-SmoM2 YFP fareler kullanarak deri kanseri gelişimi sırasında farklı hücre popülasyonlarının izole etmek için prosedürlerin bir dizi geliştirdik. Izole) 4, fare deri biyopsisi hazırlamak 3), fare deri 2) uyaran SmoM2 YFP ifade; çalışma için uygun fareler (K14creER + ve R26-SmoM2 YFP + Bu protokolde fareler) üreten) 1: Prosedür 6 bölüme ayrılmıştır deriden epidermis, 5) epidermis gelen tek hücre hazırlamak; 6) akım sitometri analizi için tek hücre popülasyonlarının etiketleme.Doğru genotip ile farelerin yeterli sayıda üretimi iki ay kadar sürebilir bu protokolde sınırlayıcı adımdır. Adım geri kalanı birkaç gün için birkaç saat sürebilir. Bu protokol kapsamında, biz de sorun giderme için bir bölüm içerir. Biz deri kanseri odaklanmak rağmen, bu protokolün insan hastalıklarının diğer hayvan modellerinde için başvuruda değiştirilebilir.

Bu farenin Hh sinyal aktivasyon haricinde bazal hücreli karsinom, gelişmez bilinmektedir. Şekil 1, düzeltilir onkojenik arasında uyarılan ekspresyonu, aşağıdaki cilt fenotipi SmoM2 YFP. Şekil 2, normal ve Tümör taşıyan farelerde miyeloid hücrelerin analizini gösterir gösterir. CD11b + Gr1 + hücreler miyeloid hücrelerden elde edilir, ve bazıları elde baskılayıcı hücreler miyeloid vardır. Normal durumda, CD11b + Gr1 + hücre popülasyonu pek saptanabilir, ancak iltihap veya tümör gelişimine yanıt olarak artacaktır. Biz CD11b + Gr1 + hücrelerinde bir artışa deri sonuçlarında SmoM2YFP bu uyarılan ekspresyonu gösterdi. Şu anda, BCC bu değişimin altında yatan moleküler mekanizma tam olarak bilinmemektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig1.jpg" /> Şekil 1. Morphologicafare deri SmoM2YFP indüksiyon sonrası L değişir. iyi fare genotip bir şematik görüntüsünü gösterir. Orta panel: tamoksifen ile tedavi K14creER + ve R26,-SmoM2 YFP ve fare H &amp; E bölümünde ağır deride anormallik (sağ) yanı sıra deri tümörleri (sol) göstermiştir. Alt panel: fare SmoM2YFP indüksiyon olmadan normal görünümlü bir cilt (sağda) ve H &amp; E bölümü (solda) herhangi bir anormal morfoloji gösterdi. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50311/50311fig2.jpg" /> Şekil 2. CD11b + Gr1 + hücrelerin Akış analizi. Cilt kanseri gelişimi sırasında CD11b + Gr1 + hücrelerinin değişimi incelemek için, CD11b ve Gr1 için floresan etiketli antikorlar ile tek hücre ve lekeli izole. FlowJo ile analiz sonra, tamoksifen ile tedavi edilen farelerden alınan cilt dokusunda Bu hücre popülasyonunun bir artış olduğunu fark.

Watch this Scientific Journal Video about Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis at JoVE.com

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Karsinojenez kanser hücrelerinin ve kanser mikro arasındaki etkileşimi içeren bir süreçtir. Moleküler olayları incelemek için, bir kanser gelişimi boyunca farklı aşamalarda farklı hücre popülasyonu izole etmek gerekmektedir. Bazal hücreli karsinom için bir fare modeli kullanarak, kanser sırasında hücre analizleri için bir protokol açıklar.

Hücre Nüfus Analizler Cilt Karsinojenez sırasında

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

cell-population-analyses-during-skin-carcinogenesis

Research

JoVE Journal

Medicine

12.3K Görüntüleme.  Indiana University. Karsinojenez kanser hücrelerinin ve kanser mikro arasındaki etkileşimi içeren bir süreçtir. Moleküler olayları incelemek için, bir kanser gelişimi boyunca farklı aşamalarda farklı hücre popülasyonu izole etmek gerekmektedir. Bazal hücreli karsinom için bir fare modeli kullanarak, kanser sırasında hücre analizleri için bir protokol açıklar.

Video: Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

Tam Kan Stimülasyon Testi kullanarak Pro-inflamatuar sitokin IL-1β Doğru ve Basit Ölçme

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Tıp

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

Prostat Karsinogenezde ve İyi Huylu Prostat Büyümesi ve Değerlendirilmesi için böbrek Kapsül Xenografting ve Derialtı Pelet İmplantasyonu

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

Sağlık Biyomarkörler Kan Toplama Noktası Nüfus Etütleri Katılımını özdeyiş Kurutulmuş

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murin için Endoskop<em&gt; In Vivo</em&gt; Karsinojenez ve bağırsak Değerlendirilmesi Multimodaller Görüntüleme Yara İyileşmesi ve İltihap

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Scarless Yara Repair Fare Fetal Cilt Modeli

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Demonstration of the Rat Ischemic Skin Wound Model

The propensity for chronic wounds in humans increases with ageing, disease conditions such as diabetes and impaired cardiovascular function, and unrelieved pressure due to immobility. Animal models have been developed that attempt to mimic these conditions for the purpose of furthering our understanding of the complexity of chronic wounds. The model described herein is a rat ischemic skin flap model that permits a prolonged reduction of blood flow resulting in wounds that become ischemic and resemble a chronic wound phenotype (reduced vascularization, increased inflammation and delayed wound closure). It consists of a bipedicled dorsal flap with 2 ischemic wounds placed centrally and 2 non-ischemic wounds lateral to the flap as controls. A novel addition to this ischemic skin flap model is the placement of a silicone sheet beneath the flap that functions as a barrier and a splint to prevent revascularization and reduce contraction as the wounds heal. Despite the debate of using rats for wound healing studies due to their quite distinct anatomic and physiologic differences compared to humans (i.e., the presence of a panniculus carnosus muscle, short life-span, increased number of hair follicles, and their ability to heal infected wounds) the modifications employed in this model make it a valuable alternative to previously developed ischemic skin flap models.

The rat, due to its size, availability, and rather docile behavior, has been utilized as a research model for many years. The goal of this protocol is to utilize the rat as an ischemic skin wound healing model to provide valuable insight into the pathophysiology of chronic wounds.

Sıçan İskemik Cilt Yara Modeli Gösteri

The propensity for chronic wounds in humans increases with ageing, disease conditions such as diabetes and impaired cardiovascular function, and ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Prostat Kanseri Klinik Dokularındaki miRNA İfade Analizleri

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

A Method of Trigonometric Modelling of Seasonal Variation Demonstrated with Multiple Sclerosis Relapse Data

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to 55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 clinical centers across 20 countries located in both hemispheres. Central to the success of this method was the strategic use of plot analysis to guide and corroborate the statistical regression modelling. Initial plot analysis was necessary for establishing realistic hypotheses regarding the presence and structural form of seasonal and latitudinal influences on relapse probability and then testing the performance of the resultant models. Trigonometric regression was then necessary to quantify these relationships, adjust for important confounders and provide a measure of certainty as to how plausible these associations were. Synchronization of graphing techniques with regression modelling permitted a systematic refinement of models until best-fit convergence was achieved, enabling novel inferences to be made regarding the independent influence of both season and latitude in predicting relapse onset timing in MS. These methods have the potential for application across other complex disease and epidemiological phenomena suspected or known to vary systematically with season and/or geographic location.

Combining plot analysis with trigonometric regression is a robust method for exploring complex, cyclical phenomena such as relapse onset timing in multiple sclerosis (MS). This method enabled unbiased characterisation of seasonal trends in relapse onset permitting novel inferences around the influence of seasonal variation, ultraviolet radiation (UVR) and latitude.

Multipl Skleroz Relaps Verilerle kanıtlanmış Mevsimsel Değişim Trigonometrik Modelleme Bir Yöntem

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to  55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Deri Cerrahi denervasyon: Cilt Hastalıkları Fare modelleri Sinirler için Gereği Test Bir Yöntem

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...