Bu çalışma Ulusal Sağlık hibe GM086822, Umut Kalp Enstitüsü Temel Bilimler ödül, ve MJ Murdock Hayırsever Güven Koleji Bilim Araştırma Programı Enstitüleri tarafından finanse edildi. Elektroforez reaktifler seçin ve görüntü analiz yazılımı, Bio-Rad tarafından cömertçe verilmiştir.

1. Fonksiyonel GR bulunduğu hücrenin sitoplazmada hazırlanması <ol><li> Teknik not: Tüm tamponlar soğutmalı olmalı ve santrüfüj ve inkübasyon dahil olmak üzere bu protokolü, her adımında, buz üzerinde veya 4 yapılmalıdır ° C, aksi belirtilmedikçe. Düşük sıcaklık, GR ve protein kompleksleri bozulmasını önlemek için çok önemlidir. </li><li> Soğutmalı santrifüj kullanarak hücrelerin fonksiyonel GR yüksek bir konsantrasyon ifade ~ 1-5 ml pelet edinin. GR zengin hücre kaynakları örnekleri fare fibroblast endojen GR yüksek bir konsantrasyon ifade L929 hücreleri, ve Sf9 rekombinant GR bakülovirüs (örneğin p2Bac-mgr bakülovirüs 12) ile enfekte olmuş hücreleri içerir. Paketlenmiş hücreleri yaklaşık 15-20 ml Sf9 bakülovirüs hücre kültürü litre başına elde edilir. Hücreler önce hasat katlanarak büyüyor olmalıdır. 5 dakika boyunca 5.000 × g hücre süspansiyonu santrifüjleyin. </li><li> Hanks &#39;tamponlu salin solüsyonu 15 ml hücre pelletini üç kez yıkayın. Yıkar arasında, 5 dakika hafifçe için 5.000 santrifüj takip pelet, × g tekrar süspansiyon haline getirin. Son yıkama sonrasında, süpernatantı tamamen kaldırmak. </li><li> HEM tamponu (10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 20 mM sodyum molibdat, pH 7.4), 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) ve 3 yer tablet Komple Mini proteaz inhibitörü içeren bir homojenizasyon tamponu 7.5 ml hazırlayın. PMSF ve Komple-Mini tablet sonraki adımları sırasında meydana gelen proteoliz önler. Komple Mini tablet kolay bir havanda ince bir toz için zemin olabilir. Homojenizasyon tampon 1,5 cilt hücre pelet ekleyin. </li><li> Rüptürü Dounce homojenizasyon (50 vuruş) veya donma / çözülme (3 siklus) tekniği ile hücreleri. Dounce homojenizasyon gelişmiş endojen GR • hsp 90 protein kompleksleri sürdürmek ve tamamlamak için daha hızlı olabilir. Donma / çözülme araştırmacı bu aşamada protokolü askıya alma ve daha sonraki bir zamanda devam etmek için bir fırsat sağlar. Dounce homojenizasyon protein parçalanmasını önlemek için bir buz kovası homojenizatör ile yapılmalıdır. Donma / çözülme pelet homojenizasyon tampon karışımı hücre içeren sıvı azot, kuru buz veya -20 ile santrifüj tüpüne dondurma yapılabilir ° C inkübasyon, 30 ° C su banyosunda çözülme. </li><li> Ultrasantrifügasyon rüptüre hücre partikül madde GR içeren sitoplazmada ayırın. 30 dakika boyunca 100.000 × g dayanıklı ultrasantrifüjdeki tüpleri, çift kütle denge tüpler ve santrifüj Homojenat aktarın. </li><li> -20 Sitoplazmada (süpernatant) ve mağaza ° C, uzun süreli depolama için 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler 500 ul alikotları çıkarın. Maksimum fonksiyonel GR aktivitesi korumak için, depolama önce metanol-kuru buz banyosu 30 saniye boyunca sıvı nitrojen ya da inkübe alikotları flaş dondurma. Soğutma reaktifi ile doğrudan temas önlemek için dikkatli olunuz. </li></ol> 2. Hücre sitoplazmasında GR Immunoadsorption <ol><li> Teknik not: Şekil 2 Bu protokol Adımlar 2-5 şematik bir bakış sağlar. </li><li> Adım 1 hazırlanan reseptör immunoadsorb GR karşı yükseltilmiş bir monoklonal immünglobulin G (IgG) antikor içeren bir immunoadsorption karışım hazırlayın. 1,5 ml mikrosantrifüj tüp, çözülmüş, 100 ul GR içeren sitozolde 200 ul TEGM tampon (8 mM TES, 4 mM EDTA, 50 mM NaCl, 20 mM molibdat,% 10 (v / v) gliserol, pH 7.6) birleştirmek 100,% 20 protein ul-sepharose (PAS), anti-GR monoklonal IgG bulamaç (v / v, TEGM tamponunda hazırlanmış) ve 5 mg (örneğin BuGR2). Molibdat, tahlil endojen heterocomplex steroid bağlanma aktivitesi 13 için yararlı olabilir GR-hsp 90 heterocomplex, istikrara kavuşturmak amacıyla TEGM tampon dahildir . <ol><li> Anti-GR antikor saflaştırılmış protein ticari olarak kullanılabilir. Alternatif olarak, 10 anti-GR immunoadsorption karışımı IgG içeren asit ul ekleyerek elde edilebilir. Asit, anti-GR hibridoma hücreleri (örneğin FiGR hibridoma hücreleri 14) ile enjekte edilen farelerin tarafından üretilen ve asit elde edilmiş ve bu deneylerde kullanılan antikor konsantrasyonunu yaklaşık Bradford yöntemi ile ölçülen, 0.5 mikrogram / ​​ml idi . </li><li> GR-içeren sitozolde TEGM tampon ve PAS (yukarıda açıklandığı gibi) ve GR tanımaz bir IgG 5 mikrogram, hsp 90 ya da diğer moleküler şaperon proteinleri (&quot;immün olmayan&quot; olarak anılacaktır kullanarak bir negatif kontrol örneği hazırlayın antikor). </li><li> Numune tüpleri% 20 bulamaç PAS aktarırken, bir kesim nispeten büyük PAS boncuk büyüklüğü nedeniyle P-200 pipetlemeyin ucunu kullanabilirsiniz. Kes pipetlemeyin ipuçları, böylece pipetlemeyin ucu diyafram artırılması, piyasada bulunan P-200 ipuçları sonunda 2-3 mm dilimleme tarafından hazırlanmıştır. </li></ol></li><li> 2 saat sürekli rotasyon ile en az bir dikey dönen tekerlek ve inkübe yerleştirin örnekleri. Örnekler olabiliraktivitesini kaybetmeden 8 saate kadar inkübe edilmelidir. </li><li> Immunoadsorption inkübasyon bitiminde, santrifüj bağlanmamış proteinler antikor-PAS pelet (&quot;immunopellet&quot;) çıkarın. 10.000 az 1 dakika için programlanmış bir soğutmalı santrifüj × g kullanarak santrifüj immunopellets süpernatantlar ayırın ve sonra 1 ml TEGM tampon ve vorteks ile iki kez yıkayın. Santrifüj ve yıkar arasında pelet rahatsız ihtiyatlı olmak süpernatant atın. <ol><li> Ikinci yıkama bitiminde tüm süpernatantı. Pelet hiçbiri yanlışlıkla aspire edilir sağlamak amacıyla, son supernatant aspirasyon crimped P-200 pipetlemeyin ucu kullanın. Kıvrımlı pipetlemeyin ipuçları forseps kullanarak piyasada bulunan P-200 ipuçları düzleştirme tarafından hazırlanır. </li></ol></li></ol> 3. Endojen hsp 90 GR immunopellet Çözülme (&quot;Tuz sıyırma&quot;) <ol><li> Adım 2 hazırlanan yıkanmış immunopellet, 355 ul TEG tampon (sodyum molibdat olmadan TEGM tampon) ve 5 M NaCl (son NaCl konsantrasyonu = 0,5 M) 45 ul ekleyin. </li><li> 1.5 saat sürekli rotasyon için dikey dönen tekerlek ve inkübe yerleştirin örnekleri. Örnekler 2 saat inkübe edilebilir, ancak, uzun inkubasyon azalmış protein kurtarma ve alt fonksiyonel aktivite yol açabilir. </li><li> Santrifüj yoluyla immunopellet bağlanmamış proteinler çıkarın. 10.000 x g. az 1 dakika süreyle örnekleri Spin 1 ml TEG tampon ve bir kez 1 ml 10 mM HEPES tamponu, pH 7.4 ile bir kez yıkayın. </li><li> Ikinci yıkama sonuca tüm süpernatantı immunopellet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, bir crimped P-200 pipetlemeyin ucu kullanarak. </li></ol> 4. Sulandırma GR • hsp 90 heterocomplex moleküler şaperonlar, kofaktör ve ATP <ol><li> Teknik not: aşağıda hazırlanan sulandırıldıktan karışımı ek proteinler, kofaktör, harekete geçirmek, ya da ilgi inhibitörleri de dahil olmak üzere sayısız deneysel koşullar test edilebilir. Sulandırıldıktan karışımlarının toplam hacmi &lt;120 ul olmalıdır. </li><li> Her tuz elimden immunopellet 50 moleküler bir hastabakıcı kaynak ve ATP üreten bir sistem (10 mM Hepes, 50 mM ATP, 250 mM kreatin fosfat, 20 mM magnezyum asetat 5 ul ul içeren bir sulandırıldıktan karışımı ekleyin, Adım 3 hazırlanan 100 U / ml kreatin fosfokinaz, pH 7.4). <ol><li> 50 ul HKD tamponu (10 mM Hepes, 100 mM KCl, 5 mM dithiothreitol (DTT), pH 7.4) ve ATP üreten sistemin ek bir 5 ul sulandırıldıktan karışımı tamamlayan Sulandırma reaksiyonlar artabilir. Bu adım, bol sulandırıldıktan ve steroid bağlayıcı gözlenmektedir atlanabilir. KCl hsp70 ATPaz aktivitesini artırır ve DTT oksidasyon 9 sistein içeren proteinler korur. </li><li> Önerilen moleküler şaperon kaynağı piyasada bulunan tavşan retikülosit lizat. Bireysel moleküler şaperonlar retikülosit lizat arınmış veya recombinantly ifade (örneğin 15 hsp 90 mg, 15 mg hsp70, 0.6 mg Hop, 6 mg P23 ve 0.125 HKD tampon mikrogram hsp40) de kullanılıyor olabilir. </li></ol></li><li> Numune tam 20 dakika boyunca 30 ° C su banyosunda inkübe edin. Flick tüpler için her 1-2 dakika hafifçe pelet rahatsız ve sulandırıldıktan çözüm karıştırın. </li><li> 1 dakika için 1 ml. TEGM 10.000 tampon, vorteks, santrifüj × g. Süpernatantı ve pelet rahatsız etmemek için dikkatli atın. Toplam üç yıkar için tekrarlayın. Tamamen bir crimped P-200 pipetlemeyin ucu kullanarak nihai yıkama sonuca tüm süpernatant kaldırmak. </li></ol> 5. Sulandırılmış protein kompleksleri ve ligand bağlayıcı aktivite analizi <ol><li> Sulandırılmış immunopellet Proteinler geleneksel denatüre poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), mikroakışkan elektroforez (örneğin, Bio-Rad Experion) ve batı blot (Şekil 3) ile tespit edilebilir. Teknik not: SDS-PAGE 15 ve 16 blot batı açıklayan Mükemmel protokolleri diğer araştırmacılar sayesinde, şu anda kullanılabilir. <ol><li> SDS-PAGE β-mercaptoethanol ve vorteks içeren numune tamponu 50 ul ekleyin. Özel numune tamponu tarifleri değişir. Elektroforez sistemi istihdam edilmek üzere üretici tavsiyesine göre birini seçin. </li><li> Kaynar su banyosu ya da 100 ° C, elektronik ısı blok 5 dakika inkübe edin. </li><li> 1 dakika 10.000 x g&#39;de santrifüjleyin. GR için complexed immunoadsorbing antikor, GR ve proteinleri birbirinden ayrı düşünülemez ve örnek tampon süpernatant salınır. </li><li> Süpernatantı crimped ucu P-200 pipetlemeyin ucu kullanarak taze mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Pelet atın. Örnek şu anda piyasada bulunan SDS-PAGE veya mikroakışkan elektroforez sistemleri kullanılarak analiz için hazırlanır. Tekniği f ya tamamlayınüreticinin talimatlarına ollowing. </li><li> Western blot analizi aşağıdaki SDS-PAGE immunoadsorbed GR ve sulandırıldıktan inkübasyon aşağıdaki GR complexed moleküler şaperonlar kesin tanımlama için olanak sağlar. GR (BuGR2), hsp 90 (AC88) karşı gündeme monoklonal primer antikorlar, hsp70 (N27F3 4) ve co-hastabakıcı proteinler GR • hsp 90 protein kompleksi ana bileşenleri tespit etmek için kullanın. </li></ol></li><li> [3 H] steroid (Şekil 4) kullanarak steroid bağlanma aktivitesi assaying • hsp 90 protein kompleksi tarafından tespit edilebilir GR sulandırıldıktan sonra tuz elimden GR Fonksiyonel aktivasyonu. Protokolün geri kalanı için, güvenli tritiated örnekleri ve atık kullanım için gerekli önlemleri uygulayın. <ol><li> Sulandırılmış immunopellet için, 47.5 ul HEM tampon ve 2 mcM 2.5 ul [3 H] deksametazon (son steroid konsantrasyonu = 100 nM) ekleyebilirsiniz. </li><li> Yavaşça mikrosantrifüj tüp duvar yerinden numune miktarı en aza indirmek için dikkatli olmak pelet karıştırın. </li><li> Buz üzerinde bir gece inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında numune tüpleri döndürmek veya karıştırmak için gerekli değildir. </li><li> 1 ml 10.000 TEGM tampon, hafifçe karıştırın ve santrifüj × g 1 dakika boyunca ekleyin. Dikkatli olmak, süpernatantı atın bağlanmamış [3 H] steroid içerir. TEGM tamponu ile 3 yıkar toplam tekrarlayın. </li><li> Tamamen bir crimped P-200 pipetlemeyin ucu kullanarak nihai yıkama sonuca tüm süpernatant kaldırmak. Pelet GR, GR complexed hsp 90 ve diğer moleküler şaperonlar ve [3 H] özellikle steroid reseptör bağlı içerir. Nonspesifik bağlayıcı bir gecelik inkübasyon karışımı 1000 kat daha fazla olmayan tritiated deksametazon gibi hesaplanabilir. Alternatif bir negatif kontrol olarak, anti-GR immunoadsorbing antikor ile değiştirilebilir Adım 2.2 &#39;de eklendi olmayan bir-GR-immunoadsorbing antikor (NI). </li><li> Yıkanmış immunopellets 200 ul TEGM tampon ve bir kesim P-200 pipetlemeyin ucu kullanarak 10 ml sintilasyon şişeleri transfer askıya alındı. </li><li> Şişeleri ve vorteks 4.8 ml sintilasyon kokteyl ekleyin. </li><li> [3 H] sulandırılmış GR steroid bağlama miktarı • hsp 90 protein kompleksi sıvı sintilasyon spektrometresi kullanılarak test edilebilir. </li></ol></li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Temsilcisi SDS-PAGE ve western blot verileri Şekil 3&#39;te sunulmaktadır. Endojen GR • hsp 90 heterocomplex anti-GR antikor ve GR ile birlikte immunoadsorb Coomassie boyama (Şekil 3A) tarafından görüntülenmiştir olduğunu bireysel proteinleri kullanarak hücre sitoplazmada immunoadsorbed. Immunopellet sulandırıldıktan tayininde herhangi bir aşamada herhangi bir bileşeninin protein kimlik teyidi ilgi protein karşı gündeme monoklonal antikorlar kullanarak molekül ağırlığı ve batı blot SDS-PAGE hesaplama yapılabilir. Sulandırılmış GR • hsp 90 heterocomplexes Experion mikroakışkan elektroforez verileri (Şekil 3C ve 3D) ve western blot analizi (Şekil 3B) kullanılarak sunulmaktadır. GR immunoadsorption özgüllüğü immunoadsorbing anti-GR antikor immün olmayan bir antikor (Şekil 3C, NI IgG kulvar) ile değiştirerek teyit edilir. Immün olmayan antikor aşırı miktarda kullanıldığında bile, hiçbir GR veya moleküler şaperonlar (bkz. Şekil 3C, GR, hsp 90 ve gözlenen grubun eksikliği ile anti-GR immunoadsorption şerit bulunan hsp70 protein bantları immunoprecipitated NI IgG şerit). Aynı şekilde, soyulmuş ve suni immunopellets western blot analizi ile tuz elimden GR (Şekil 3B) hsp 90 bölünmeler ve diğer şaperon proteinler onaylamak mümkün. Immunoadsorbing antikor ağır zincir (HC) Coomassie leke ve batı blot tarafından saptanabilir ve her kulvarın görüntülenir eşit büyüklükte immunopellets onaylamak için hizmet vermektedir. Steroid bağlayıcı immunoadsorbed GR aktivitesi test edilen tüm koşulları için test edilmelidir, ve temsili steroid veri bağlama Şekil 4&#39;te sunulmaktadır. Endojen GR • hsp 90 heterocomplexes immunoadsorbed, tuz elimden, ve yeniden. Ya retikülosit lizat kullanılması veya saflaştırılmış proteinler, sulandırılmış GR steroid bağlanma aktivitesi • hsp 90 heterocomplex genellikle endojen GR • hsp 90 bağlayıcı aktivite düzeyi% 75-100 döner. Elektroforez verilere benzer şekilde, immün olmayan bir antikor (NI), negatif kontrol olarak hizmet vermek üzere ve nonspesifik [3 H] steroid bağlanma bir önlem olarak anti-GR antikor (I) yerine kullanılır . <img src="/files/ftp_upload/3059/3059fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. GR • hsp 90 heterocomplex montaj ve GR steroid bağlayıcı yarık açma Model. Hsp90/hsp70-based şaperon makine bir fol GR ligand bağlayıcı etki alanı dönüştürüryarık steroid bağlanma kapalı ve açık bir yarık konformasyon (heterosiklik steroid simgesi ile gösterilen) erişilebilir hormon erişilebilir olduğu ded konformasyon. Hastabakıcı makineleri hücre önceden monte edilmiş ve hsp70 hsp 90, saflaştırılmış kendiliğinden oluşturacak ve Hop (Reaksiyon 1) çözümü karıştırılır. Hop, 34 amino asit tetratricopeptide tekrar (TPR) etki alanı (karanlık hilal olarak gösterilen) içerir ve daha sonra bir TPR etki immünosüpresanlarla protein içeren heterocomplex olgunlaşma işlemi sırasında değiştirilir. Makine Hop ve hsp40 hsp70 ve sonuçta çoğu bırakın sonra, bir ATP-K +-bağımlı bir şekilde yarık steroid bağlanma açılır kompleksi (kesik bir simge olarak gösterilmiştir). Mekanistik, hsp70 hsp 90 reseptör ve sonraki yarık açma hsp 90 GR önce etkileşim ve asal. Hsp 90 ve hsp70 aynı anda mevcut Deneysel olarak, steroid bağlayıcı ve GR yarık açma artar. Heterocomplex bağlı bir ATP yapısındaki hsp 90 korur hsp 90 co-hastabakıcı P23, giriş tarafından stabilize edilir. Hop çıktıktan sonra, yüksek molekül ağırlıklı bir immünosüpresanlarla (İBB), son heterocomplex oluşturan hücrelerden kurtarılır, hsp 90 bağlayabilirsiniz. Pratt ve Toft 1 uyarlanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/3059/3059fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 bu protokol Adımlar 2-5 şematik. GR protein A-sepharose bir pelet bağlı GR (FiGR) karşı yükseltilmiş bir monoklonal antikor kullanarak hücre sitoplazmada immunoadsorbed. Hsp90 ve diğer hastabakıcı proteinler • hsp 90 heterocomplex GR ile birlikte immunoadsorbed endojen GR, bugünü ve GR steroid bağlamak mümkün. Hsp90 GR (Str) tuz sıyırma olarak adlandırılan hafif bir tuz tedavi, ayrı. Tuz elimden GR yarık steroid bağlanma steroide bağlamak sağlayamıyordu kapatır. Orta GR bağlayıcı steroid yeteneğine sahip • hsp 90 hsp70 içeren heterocomplexes, hsp40, Hop, saflaştırılmış proteinler ya da retikülosit lizat (Retik lizat) ve kofaktör tuz elimden GR inkübe (Recon) sulandırılmış olabilir. Her adımın steroid bağlanma aktivitesi ve immunopellet protein içeriği gecede [3 H] steroid kuluçka ve batı sırasıyla, blot tespit edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/3059/3059fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 immunoadsorbed kompleksleri Elektroforetik protein analizi. A, sulandırılmış GR SDS-PAGE • electrotransfer ve Coomassie boyama takip konvansiyonel elektroforez sistemi kullanarak görüntülü hsp 90 heterocomplex. GR, hsp 90 ve hsp70 ek olarak, ağır zincir (HC) ve antikor hafif zincir (LC) görselleştirilebilir. Molekül ağırlığı belirteçleri (kDa olarak ifade edilmiştir.) Göç soldaki gösterilir. B, tuz elimden GR (Str) ve suni GR • hsp 90 heterocomplex (Recon) içeren immunopellets Western Blot. C, sulandırılmış GR sanal jel • Experion mikroakışkan elektroforez sistemi kullanılarak oluşturulan hsp 90 heterocomplex. İki farklı konsantrasyonlarda (NI IgG) immün olmayan ve immunoadsorbing antikorları (anti-GR) bağışıklık dahildir. NI IgGs negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. D, sulandırılmış GR Elektroferogram • mikroakışkan elektroforez paneli B. Avantajları küçük örnek hacimleri için gereklilik üçüncü şeritte gösterilen Experion mikroakışkan elektroforez örnek alınan hsp 90 heterocomplex, gelişmiş kantifikasyon sıvı taşıma ve işletilen sonrası temizlik azalma, büyük ölçüde kısa bir örnek çalışır. <img src="/files/ftp_upload/3059/3059fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4, endojen GR immunoadsorption (Enodg), tuz elimden GR (Str) aşağıdaki immunopellets steroid bağlayıcı aktivite ve GR sulandırılmış • hsp 90 heterocomplex (Recon) . Bir anti-GR immunoadsorbing monoklonal antikor (I) ile GR immunoadsorbing yanı sıra, her durum için negatif kontrol örnekleri immün olmayan immünglobulin (NI) kullanılarak hazırlanmıştır.

<ol>
	<li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+signaling+protein+function+and+trafficking+by+the+hsp90/hsp70-based+chaperone+machinery.">Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery.</a> Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).</li><li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucocorticoid+receptor+steroid+binding+and+trafficking+by+the+hsp90/hsp70-based+chaperone+machinery:+implications+for+clinical+intervention.">Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention.</a> Leukemia. 19, 710-712 (2005).</li><li>Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery+regulates+signaling+by+modulating+ligand+binding+clefts.">The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts.</a> J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).</li><li>Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+steroid+receptor&#149;hsp90+heterocomplex+assembly+system+of+rabbit+reticulocyte+lysate.">Reconstitution of the steroid receptor&#149;hsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).</li><li>Morishima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp+organizer+protein+hop+enhances+the+rate+of+but+is+not+essential+for+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+multiprotein+Hsp90-based+chaperone+system.">The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system.</a> J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).</li><li>Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry,+abundance,+and+functional+significance+of+the+hsp90/hsp70-based+multiprotein+chaperone+machinery+in+reticulocyte+lysate.">Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).</li><li>Dittmar, K. D., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+the+glucocorticoid+receptor+by+the+reconstituted+Hsp90-based+chaperone+machinery.+The+initial+hsp90.p60.hsp70-dependent+step+is+sufficient+for+creating+the+steroid+binding+conformation.">Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation.</a> J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).</li><li>Kanelakis, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+the+hsp70-binding+protein+BAG-1+on+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+hsp90-based+chaperone+machinery.">Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).</li><li>Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+iterative+ratcheting+of+receptor-bound+hsp70+between+its+ATP+and+ADP+conformations+during+assembly+of+glucocorticoid+receptor.hsp90+heterocomplexes.">Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes.</a> Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).</li><li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pifithrin-alpha+inhibits+p53+signaling+after+interaction+of+the+tumor+suppressor+protein+with+hsp90+and+its+nuclear+translocation.">Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation.</a> J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).</li><li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation/deacetylation+of+the+chaperone.">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li><li>Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&#149;hsp90+heterocomplex+resolves+two+sequential+ATP-dependent+events+involving+first+hsp70+and+then+hsp90+in+opening+of+the+steroid+binding+pocket.">Stepwise assembly of a glucocorticoid receptor&#149;hsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).</li><li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+receptor+interactions+with+heat+shock+protein+and+immunophilin+chaperones.">Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones.</a> Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).</li><li>Bodwell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+phosphorylated+sites+in+the+mouse+glucocorticoid+receptor.">Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor.</a> J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).</li><li>Penna, A., Cahalan, M. W. e. s. t. e. r. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels.">Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).</li><li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Protein+Ubiquitination.">Detection of Protein Ubiquitination.</a> J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).</li><li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&amp;bull;Hsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft.">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&amp;bull;Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+Immunoprecipitation+Detected+by+Flow+Cytometry.">IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).</li><li>Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functioning+of+the+Hsp90+machine+in+chaperoning+checkpoint+kinase+I+(Chk1)+and+the+progesterone+receptor+(PR).">Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR).</a> Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).</li><li>Cintron, N. S., Toft, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+requirements+for+Hsp40+and+Hsp70+in+the+Hsp90+chaperone+pathway.">Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway.</a> J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).</li></ol>

Elektroforez reaktifler seçin ve görüntü analiz yazılımı, Bio-Rad tarafından sağlanmıştır.

Yukarıda açıklanan test hsp90/hsp70-based hastabakıcı makineleri şaperon yanı sıra eylemlerin GR steroid bağlanma etkileyen şartlar sayısız test etmek için adapte edilebilir. Bu, daha önce bildirilen yöntemler 4,8,9,17 bir değişiklik ve elektroforez teknolojisi son gelişmeler yararlanmak ve daha geniş bir araştırma topluluğu erişilebilir olması için tasarlanmıştır . Ek ilgi kofaktör veya protein GR eklenebilir steroid bağlayıcı, heterocomplex protein-protein etkileşimleri ve c...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Sf9 böcek hücre </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> rekombinant fare GR bakülovirüs ifade </td></tr><tr><td> L929 hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CRL-2173 </td><td> endojen fare GR sitoplazmada hazırlanması (bakülovirüs ifade alternatif) </td></tr><tr><td> FiGR hibridoma hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CRL-2173 </td><td> anti-GR monoklonal antikor içeren asit (saflaştırılmış BuGR2 antikor alternatif) hazırlamak için </td></tr><tr><td> Komple-Mini proteaz inhibitörü, EDTA-free </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> protein A-sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> tavşan retikülosit lizat </td><td> Yeşil Hektar (Oregon, WI) </td><td></td><td> endojen hsp90/hsp70 hastabakıcı makineleri zengin bir kaynak </td></tr><tr><td> kreatin fosfokinaz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td><td> ATP-yenileyici sistem </td></tr><tr><td> phosphocreatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td><td> ATP-yenileyici sistem </td></tr><tr><td> anti-GR fare monoklonal antikor (BuGR2) </td><td> Pierce / Thermo Scientific </td><td> MA1-510 </td><td> GR immunoadsorption için kullanılan ve batı blot olarak primer antikor </td></tr><tr><td> anti-hsp 90 fare monoklonal antikor (AC88) </td><td> Enzo Yaşam Bilimleri </td><td> ADI-SPA-830 </td><td> western blot primer antikor olarak kullanılan </td></tr><tr><td> hsp70 anti-fare monoklonal antikor (N27F3 4) </td><td> Enzo Yaşam Bilimleri </td><td> ADI-SPA-820 </td><td> western blot primer antikor olarak kullanılan </td></tr><tr><td> Fare serumu ile IgG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 038K7690 </td><td> immün olmayan antikor immunoadsorption negatif kontrol olarak kullanılan </td></tr><tr><td> anti-fare IgG-peroksidaz konjuge </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4416 </td><td> western blot ikincil antikor olarak kullanılan </td></tr><tr><td> Experion mikroakışkan elektroforez sistemi </td><td> Bio-Rad </td><td> 7007001 </td><td> geleneksel SDS-PAGE alternatif </td></tr><tr><td> [1,2,4,6,7 - 3 H] deksametazon </td><td> Perkin Elmer </td><td> NET1192001MC </td><td> güvenlik önlemlerini izleyin </td></tr></tbody></table>

biochemical reconstitution of steroid receptor&#x2022;hsp90 protein  complexes and reactivation of ligand binding

Hsp90 önemli ve son derece bol moleküler şaperon protein, hücre bisiklet alan transkripsiyon faktörleri (örneğin nükleer reseptörleri, p53) ve protein kinazlar (örneğin, Src, Raf, Akt kinaz) dahil olmak üzere 150&#39;den fazla ökaryotik sinyalizasyon proteinler, düzenleyen tespit edilmiştir. tümörogenez, apoptozis ve birden fazla ökaryotik sinyalizasyon yolları 1,2 . Hsp 90 için bu çok &#39;yandaş&#39; proteinler ki, steroid reseptör montaj • hsp 90 kompleksleri (Şekil 1) en iyi tanımlanmış . Biz burada bir uyarlanabilir glukokortikoid reseptör (GR) immunoprecipitation tahlil ve ökaryotik hsp 90 fonksiyonel aktivite, bağlayıcı hsp 90-aracılı steroid reseptör ligand ve moleküler şaperon kofaktör gereksinimleri kolayca prob kullanılıyor olabilir • in vitro GR hsp 90 sulandırıldıktan yöntemi mevcut. Örneğin, bu testte hsp 90 kofaktör gereksinimleri ve eksojen bileşiklerin sulandırıldıktan süreci ekleyerek etkilerini test etmek için kullanılır. Reseptör steroid 3 erişilebilir yarık açık bir ligand bağlanması için hsp 90 bağlı olması gerekir, çünkü GR hsp 90 eğitim için özellikle yararlı bir sistem olmuştur . Endojen, unliganded GR noncovalently hsp 90 bağlı memeli hücrelerinin sitoplazmasında bulunur. Endojen GR • hsp 90 heterocomplex bulunan yarık GR ligand bağlanması, açık ve bağlayıcı steroid yeteneğine sahip. Hsp 90 GR ayrıdır veya onun işlevini inhibe ise, alıcı, steroid bağlamak mümkün ve steroid bağlanma aktivitesi önce GR • hsp 90 heterocomplex sulandırılması gereklidir 4 geri . GR bir monoklonal antikor kullanılarak hücre sitoplazmada immunoprecipitated ve western blot ile test edilebilir gibi hsp 90 proteinler GR için complexed olabilir. [3 H] steroid immunopellet kuluçka immunoprecipitated GR Steroid bağlayıcı aktivite tespit edilebilir. Önceki deneyler, yarık GR ligand bağlama hsp 90 aracılı açılış göstermiştir hsp70, ikinci bir moleküler şaperon ökaryotik hücre canlılığı için de gereklidir gerektirir. Hsp 90 ve hsp70 biyokimyasal faaliyet proteinler co-hastabakıcı Hop hsp40 ve P23 5 tarafından katalize. Multiprotein hastabakıcı makineleri hsp 90, hsp70, Hop, ve hsp40 içeren bir ökaryotik hücre sitoplazmasında endojen ve retikülosit lizat bir hastabakıcı zengin protein kaynağı 6 sağlar. Sunulan yöntem, GR hücre sitoplazmada immunoadsorbed ve hafif tuzlu koşulları kullanarak endojen hsp90/hsp70 şaperon makine elimden. Tuz elimden GR GR sulandırıldıktan sonuçları retikülosit lizat, ATP ve K + ile inkübe steroid bağlanma aktivitesi 7 • hsp 90 heterocomplex ve yeniden. Bu yöntem, hsp 90-aracılı steroid bağlayıcı 8-11 fonksiyonel önemi belirlemek amacıyla çeşitli şaperon kofaktör, roman proteinleri, ve deneysel hsp 90 GR inhibitörlerinin etkilerini test etmek için kullanılabilir .

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Reconstitution of Steroid Receptorâ€¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding at JoVE.com

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Bir<em&gt; In vitro</em&gt; • hsp 90 protein kompleksleri proteinler ve hücresel lizatları saflaştırılmış fonksiyonel glukokortikoid reseptör (GR) hazırlanması için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, tuz sıyırma ve protein kompleksi sulandırıldıktan takip rekombinant GR immunoadsorption kullanır. Potansiyel yöntemi uygulamaları gibi kofaktör ve tampon koşulları önemi tartışıldı.

Steroid Reseptör Biyokimyasal Sulandırma Ligand • Protein Hsp90 Kompleksleri ve Yeniden bağlayıcı

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

biochemical-reconstitution-steroid-receptorhsp90-protein-complexes

Research

JoVE Journal

Biology

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

16.3K Görüntüleme.  Seattle University. Bir In vitro • hsp 90 protein kompleksleri proteinler ve hücresel lizatları saflaştırılmış fonksiyonel glukokortikoid reseptör (GR) hazırlanması için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, tuz sıyırma ve protein kompleksi sulandırıldıktan takip rekombinant GR immunoadsorption kullanır. Potansiyel yöntemi uygulamaları gibi kofaktör ve tampon koşulları önemi tartışıldı.

Video: Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Biyoloji

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Bitkiler ve Yeşil Alg Işık hasat Kompleksleri İn Vitro Sulandırma içinde

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.