Samir Hamdan, bu tekniğin geliştirilmesi destekli E. coli proteinler Prof. Nick Dixon laboratuar, Wollongong Üniversitesi ve T7 proteinler, Harvard Tıp Fakültesi&#39;nden Prof. Charles Richardson . Çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (AMvO için GM077248) ve Jane Tabut Childs Vakfı (JJL) tarafından desteklenmektedir.

Tek bir molekül çoğaltma deneyi yapmadan önce, birkaç malzemeleri önceden hazırlıklı olmak gerekir. 1. DNA replikasyonu Şablonu Çoğaltma reaksiyonu substrat standart moleküler biyoloji teknikleri 1,2 kullanılarak hazırlanmış bir biotinlenmiş, kuyruklu M13 yuvarlanma daire. Malzemeler: M13mp18 tek iplikli DNA, biotinlenmiş kuyruk oligonükleotid astar (5&#39;-Biotin-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &#39;), T7 DNA polimeraz, Isı blok, izoamil / Fenol Alkol / Kloroform <ol><li> TBS tampon (330 nM kuyruk oligo, 33 nM M13) oligo 10 kat daha fazla ekleyerek, M13 biotinlenmiş kuyruk oligo Tavlama. </li><li> 65 ° C ısı bloğu karışımı ısıtın. Isıtmalı, ısı bloğu kapatın ve yavaş soğutma astar düzgün tavlama için izin. </li><li> Astarlanmalıdır M13 64 nM T7 DNA polimeraz ve T7 çoğaltma tampon dNTP ve MgCl 2 içeren bir karışıma ekleyin. </li><li> 37 ° C de 12 dakika reaksiyon inkübe ve 100 mM EDTA ile soğutun. </li><li> Purify doldurulmuş ürün DNA, fenol / kloroform / izoamil alkol ekstraksiyonu ve TE tampon ya da başka bir uygun depolama tampon dialyze ve DNA konsantrasyonu (M13 astarlanmalıdır herhangi bir kalıntı kurtarmak için her organik faz geri-extract) belirlemek. </li><li> Bir şablon hazırlık iterasyon kolayca tek-molekül deneyler binlerce yüzlerce yeterli, nanomolar konsantrasyon şablonu birkaç mililitre yapabilirsiniz. </li></ol> 2. Fonksiyonlu lameller DNA cam lamel eklemek için, cam, daha sonra biotinlenmiş PEG moleküllere birleştiğinde bir aminosilane, ilk işlevselleştirildiyse. Bu kaplama yüzeyi 1,3 ile non-spesifik etkileşimler, DNA ve çoğaltma proteinler azaltmaya yardımcı olur . Malzemeler: Cam lamelleri, Boyama kavanoz, 3-aminopropyltriethoxysilane, metoksi-PEG5k-NHS ester, Biotin-PEG5k-NHSester, Aseton, 1M KOH, Etanol, Fırın, Banyo sonikatör <ol><li> Cam kavanoz boyama ve etanol ile kavanoz dolum onları yerleştirerek lamelleri iyice temizleyin. 30 dakika boyunca sonikasyon ve kavanoz yıkayın ve 1 M KOH ile doldurun. 30 dakika hem yıkar tekrarlayın sonikasyon. </li><li> Ilk işlevsellik tepki için, tüm su izlerini kaldırılması gerekir. 10 dakika aseton ve sonikasyon kavanozları doldurun. Aseton ile kavanoz tekrar durulayın. </li><li> 2% v / v aseton silan reaktif bir çözüm hazırlayın. Boyama kavanoz ekleyin ve 2 dakika boyunca ajitasyon. Bu reaksiyon çiftler cam aminosilane alkoksi grup, bir sonraki kaplin adım için bir reaktif amin bırakarak. Büyük bir su fazlalığı ile reaksiyon Quench. </li><li> 110 ° C&#39;de 30 dakika fırında pişirme tarafından lamelleri kurulayın. </li><li> 100 mM NaHCO 3 pH 8.2 50:1 metoksi: biotin PEG karışımı hazırlayın. Amaç yaklaşık% 0.2 w / v biotinlenmiş PEG. </li><li> Pipet 100 mcL kuru Silanlanmış lamel ve yer üstünde başka bir lamel üzerine PEG karışımı. Bir cam lamel spacer dahil lamelleri ayrılması sağlayacaktır. </li><li> 3 saat PEG çözüm lamelleri inkübe edin, sonra her çift lamelleri ayrı ve suyla iyice yıkayın. Sadece bir kez yan PEG ile kaplı olacak gibi lamelleri yan Fonksiyonlu tutmak için dikkatli olun. </li><li> Vakum altında lamelleri ve mağaza kurulayın. Yüzeyler en az ayda bir sabit kalır, bu yüzden onlarca lamelleri bir toplu yapılan ve gerektiği gibi kullanılabilir. </li></ol> Bu malzemeler, vaktinden önce ve sonra her bir deney için kullanılan olmalıdır. Her tek-molekül denemeyi başlatmak için, akış odasına montaj başlar. 3. Akış Odası Hazırlık Deney Fonksiyonlu lamel, çift taraflı bant, kuvars slayt ve boru ile yapılan basit bir akış odası kullanılarak yapılır. Bir akış odası, tek tek her molekülün deney 1,4 için hazırlanmıştır. Malzemeler: Çift taraflı bant, Razor bıçak, boru, Hızlı kuru epoksi delikli Kuvars slayt işlevselleştirildiyse lamel (bkz. yukarıda), Streptavidin çözümü (1 mg / mL PBS içinde 25 mcL), Boru, tampon Engelleme (20 mM Tris pH: 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.2 mg / ml BSA,% 0.005 Tween-20) <ol><li> Sonraki adımlar için herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için bir desikatörde 20-25 mL engelleme tampon koyarak başlayın. </li><li> PEG-Fonksiyonlu lamel alın ve PBS-seyreltilmiş streptavidin çözüm yüzey üzerinde 125 yayıldı. Streptavidin yüzey biotins bağlamak için izin odasının diğer bölümlerine hazırlarken, 20 dakika boyunca inkübe bırakın. </li><li> Çift taraflı bir parçasınıd bant kuvars slayt boyutuna uyacak. Akış odasının bir taslak bant (1 mg / ml) çizilebilir, böylece bir kalem ile kaset üzerine boru delik konumunu işaretleyin. </li><li> Delikleri etrafında 2 mm genişliğinde dikdörtgen olun. Bu akış kanalı olarak hizmet verecek, bu yüzden etrafında düz saplı boru giriş ve çıkış yapmak ve odayı terk emin olun. İsterseniz, birden fazla kanal ya da farklı boyutlarda kullanılabilir. </li><li> Kanal içine herhangi bir yapışkan çıkıntı emin olmak için düz ve temiz kesim, çizilen taslak boyunca kesin. </li><li> Kuvars iyice kullanarak aseton veya etanol önceki akış hücresi inşaat yapıştırıcı çıkarmak için temizleyin. </li><li> Kanal anahat iyi hizalama, bir tarafı yapışkanlı arka kaldırmak ve kuvars slayt üzerine bandı dikkatlice yerleştirin. Giriş ve çıkış delikleri unblocked kalmaya ihtiyacı gibi, bant düzgün hizalamak için dikkatli olun. </li><li> Akış hücresi giriş ve çıkış boru uzunlukları kesin. Bu tüp odası dibine düz basın böylece ilgili bir 30 ° açı tüp sonuna kesmek için yardımcı olur. Sonraki adımlar akış hücresi kolay eki için askıya destek çeşit tüpler yerleştirin. </li><li> Streptavidin kaplı lamel su ile iyice durulayın ve basınçlı hava kullanarak kurutun. Yalnızca tek taraflı Fonksiyonlu olduğunu unutmayın; lamel üzerinde açmak için dikkatli olun. Teyp yedekleme diğer tarafına çıkartın ve kuvars slayt lamel üzerine yerleştirin. </li><li> Yapıştırıcı sıkışıp herhangi bir hava hafifçe dışarı itmek için lamel basın. Bu akış kanalı içine almak herhangi bir hava kabarcıkları önlemeye yardımcı olacaktır. </li><li> Epoksi ile odasının yanında Seal. Kesilmiş boru epoksi ile kuvars ve mühür deliklere yerleştirin. Bu, birkaç dakika kurumasını gerekiyor. </li><li> Kuruduktan sonra, bazı gazlar engelleme tampon tüplerinden biri aracılığıyla çekerek yüzey engelleme başlar. 21-gauge iğne, 0,76 mm boru içinde mükemmel uyum sağlar. Hava kabarcıklarını çıkarmak için birkaç kez yıkayın ve odasının en az yarım saat süreyle inkübe izin. </li></ol> 4. Tek Molekül Çoğaltma Deney Malzemeler: Hazır akış odası, SYTOX Portakal, TIRF mikroskop, 532 nm lazer, CCD kamera, görüntü elde etme yazılımı ile bilgisayar, Rolling daire DNA substrat Çoğaltma proteinleri <ol><li> Akış hücresi bloke edildikten sonra, her şeyi tek-molekül denemenize başlamaya hazır. </li><li> Akış hücresi ve mikroskop sahne üzerine yerleştirin. Sahne klipler ile yerine oda tutun ve akış kanalı düz y ekseni boyunca yerleştirilmiş olduğundan emin olun. </li><li> Daha büyük çaplı bir konektörü tüp veya bir iğne kullanarak şırınga pompası akış hücresi çıkış borusunun bağlayın. Tampon engelleme giriş yerleştirin ve şırınga, tüp içindeki herhangi bir havayı çıkarmak için geri çekin. Çıkış borusunun nazik bir fiske akış hücresi sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcığı temizlenmesine yardımcı olacaktır. </li><li> 1 ml engelleme tampon stok DNA şablonu pM 25 sulandırınız. DNA iyi bir yüzey kaplama izin orta akış hızında odasına Akış. 0.025 ml / dk 30 dakika iyi çalışır. Bu lamelleri her parti için yüzeyde ya da deney için kaç istenilen kaç DNA molekülleri dayalı çeşitli olabilir. </li><li> DNA sonra, aşırı DNA engelleme tampon kullanarak yıkayın. Tüm serbest DNA kurtulmak için en az 200 akış hücre hacimleri için yıkayın. </li><li> Çoğaltma tampon gaz alma başlayın. E. için coli çoğaltma deneyler, bunu 37 ° ° C ısıtılmış akış odasında kabarcıkları riskini azaltmak için. </li><li> Lazer ve kamera açın. Soğutmalı CCD kullanılmadan önce sıcaklığa ulaşması gerekiyor. </li><li> Eğer 37 ° C deney yapan, ısıtıcı açmak. Amacı, akış hücresi ile temas ya da daha sonra bir ısı banyosu olacaktır emin olun. </li><li> Yıkama ve gaz alma sonra, reaksiyon hazırlanabilir. Mix nükleotidler, DTT ve çoğaltma tampon SYTOX. Sonra proteinler ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> Akış hücresi içine reaksiyon karışımının akış. Bu akış hızı dsDNA germek için yeterli olması gerekir. 2 mm genişliğinde, 100 mikron uzun boylu akış kanalı için 0.04 ml / dak iyi çalışır. </li><li> Karışımı için odasına girin ve görüntüleme başlamak için zaman tanıyın. Iyi bir ipucu, kanalın yan görüş alanını taşımak ve yapıştırıcı malzeme odaklanmak. Bu odaklama için yüzeye yakın sağlayacaktır. </li><li> Lazer gücü, mikroskop odak ve TIRF açısını ayarlayın. Lekeli DNA herhangi bir photocleavage önlemek için düşük güç tutun. DNA replikasyon oranına bağlı olarak birkaç dakika için 1-5 kare / saniye edinin. Arzu edilirse, daha uzun çoğaltma yörüngeleri ya da daha fazla molekülleri görmek için yeni bir alana taşımak için tekrarlayın. </li><li> Reaksiyon karışımı neredeyse boş sonra, S ile daha fazla tampon akışı iyi bir fikirdirYTOX bakış diğer alanlarını görmek için. Farklı çoğaltılır moleküllerin birden fazla görüntü almak processivity belirlenmesi için istatistikleri sağlar. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Aktif kopyalayan moleküller kolayca boyanan DNA büyüyen çizgiler olarak görülür. Deneylerde, M13 substrat 25 pM akan bir görüş 60x, 125 mm x 125 mm alan (Şekil 1) 100-1000 molekülleri verir. E. kullanarak çoğaltma deneyler az 37 coli replisome proteinler ° C (Ayrıntılar için malzemeler), görüş alanı başına 5-50 kopyalayan moleküller verir . T7 replisome, çok daha verimli yüzey başlatan eşdeğer konsantrasyonlarda, biz bir alan çoğaltmak moleküllerin&gt;% 70 gözlemlemek. Bu koşullar, tek tek moleküllerin çözmek ve analiz etmek için zor olduğu kadar yüksek bir ürün yoğunluğu verim, böylece daha az protein konsantrasyonları T7 deneyler yapılmaktadır. Veri Analizi: oran veri elde etmek için, sadece DNA vs zaman son nokta arsa ve eğimi hesaplamak (Şekil 2) . Processivity için DNA toplam uzunluğu belirler. Bu iki numaraları baz çifti dönüştürülmesi gerekir. Deneme yapmadan önce, uygun büyütme kameranın piksel büyüklüğünü bilmeli. Basepair dönüşüm için iyi bir tahmin sadece DNA kristalografik uzunluğu, 2.9 bp / nm göre dönüştürme. Ancak, laminer akış tamamen DNA streç olmaz, bir DNA uzunluğu kalibrasyon, uzunluğu bilinen DNA, örneğin 48.502 bp λ DNA biotinlenmiş oligo akış hücresi takılarak ve onun SYTOX lekeli uzunluk ölçüm yapılmalıdır çoğaltma deney için kullanılan akış hızı. Baz çifti / piksel sayısını belirleyen çoğaltma oranları ve processivities doğru hesaplama sağlayacaktır. Oranı ve processivity dağılımları (Şekil 2) 1 komplo sağlayan, çok sayıda fotoğraf ve film çekmek çok sayıda ürün molekülünün sağlayacaktır . <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: (Ref itibaren 1) a) haddeleme daire çoğaltma tahlil Cartoon. (SA, streptavidin). Önde gelen iplikli sentezi daire ve yüzey birbirine bağlayan kuyruk uzanır. Kuyruk gecikmeli iplikçik polimeraz dsDNA dönüştürülür ve laminer akış gergin. b) Örnek SYTOX Orange ve 532 nm eksitasyon ile görüş alanı. Küçük floresan noktalar gergin olmayan çoğaltılmış substratlar. Ürünlerin aşırı uzunluğu ve alan başına ürünleri (&gt; 5000 gibi alanlarda her bir akış hücresi içerir) çok sayıda unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: (Ref adapte 1) a, b) T7 (a) ve E. tipik kopyalayan moleküllerin Kymographs coli (b) deneyler. c) a) ve b) moleküllerin Endpoint yörüngeleri zaman karşı çizilen. Yörüngeler çoğaltma oranlarını elde etmek için lineer regresyon ile donatılmıştır. Gösterilen örnekler 99.4 baz puan (bp) -1 ve 467,1 bp s -1. ) 25.3 ± 1.7 kbç (T7), 85.3 ± 6.1 kbç (E. coli: d) çoğaltma ürünleri uzunluğu dağılımları, processivity elde etmek için tek bir üstel bozulma ile uygun . e) tek bir molekül yörüngeleri kuru dağılımları, tek bir Gauss uygun. Şu anlama gelir: 75.9 ± 4.8 bp s -1 (T7), 535,5 ± 39 baz puan (bp) -1 (E. coli).

<ol>
	<li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication.">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27 (2009).</li><li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7.">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+grafted+to+silicon+surfaces:+Grafting+density+and+protein+adsorption.">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M., Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> DNA replication: Methods and protocols. 521, 397-410 (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li></ol>

Bir kritik kontrol ilgi çoğaltma proteinler, leke, SYTOX Orange etkisini inceliyor. Bunu yapmanın kolay bir yolu olarak tanımlanan akış hücresi değil SYTOX ihmal çoğaltma deney yapmaktır. Reaksiyon karışımı odasına akardı sonra, DNA boyama ve çoğaltılmış moleküllerin uzunluğu dağılımı incelemek için SYTOX ile tampon ekleyin. Alternatif olarak, standart dökme reaksiyonlar SYTOX çoğaltma hızı ve verimliliği üzerinde herhangi bir etkisi kontrol etmek için kullanılabilir. Burada tarif edilen deney, sadece tek bir akış kanalı kullanır. Bu multi-kanal akışı odaları oluştururken veya PDMS veya benzer mikroakışkan cihazlar kullanarak kolayca değiştirilebilir. Kanal sayısının artırılması, protein konsantrasyonları, mutantlar, ya da inhibitör molekülleri tarama büyük ölçüde kolaylaştırır ve çoğaltma veri toplama hızı artmaktadır. Bahsettiğimiz gibi, E. gerçekleştirmek coli çoğaltma deneyler 37 ° ° C ev yapımı alüminyum akış hücresi ısıtıcı, rezistif bir ısıtma elemanı (kartuş ısıtıcı) ve değişken güç kaynağı. Bu iyi bir sıcaklık kararlılığı sağlar ve objektif bir ısıtıcı satın önler. Isıtıcı kalibre etmek için, biz sadece bir kuvars akışını hücrenin üst merkezinde bir delik delinmiş bir termokupl akış kanalı içine eklenen ve normal olarak tampon akıyordu. Artan gerilimler akış hücresi tampon sıcaklık ölçüm doğru ısıtma sağlar.

T7 Çoğaltma: 5 mM dithiothreitol ile 40 mM Tris, pH 7.5, 50 mM potasyum glutamat, 10 mM magnezyum klorür, 100 mg / ml BSA, 600 mcM dNTP, 300 mcM ATP, 300 mcM CTP, ve 15 nM SYTOX Turuncu hemen önce eklendi kullanın. 5 nM GP4 (hexamer), 40 nM polimeraz (1:1 GP5:: tiyoredoksin), 360 nm gp2.5 1,5 Proteinler olarak eklenir. E. coli Çoğaltma: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 mM magnezyum asetat, 80 mM potasyum klorür, 100 mg / ml BSA ile 10 mM dithiothreitol, 40 mcM dNTP, 200 mcM rNTPs, ve 15 nM SYTOX Turuncu hemen önce eklendi. Proteinler eklendi: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ 2 γ 1 δδ&#39;χψ veya τ 3 δδ&#39;χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 Nm PriB, 320 Nm PRIC, 480 nM DNAT 1,6

visualizing single-molecule dna replication with fluorescence microscopy

Biz tek-molekül düzeyinde DNA replikasyonu gözlemlemek için basit bir floresan mikroskopi tabanlı gerçek zamanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Dairesel, çatallı DNA örneğinin Fonksiyonlu bir cam lamel bağlı ve yaygın çoğaltma proteinleri ve nükleotidler (Şekil 1) girişten sonra çoğaltılır. Büyüyen ürün, çift iplikli DNA (dsDNA) laminer akış ile genişletilmiş ve intercalating boya kullanılarak görüntülenmiştir. Gerçek zamanlı olarak artan DNA sonu pozisyon ölçme çoğaltma oranının kesin tespiti (Şekil 2) sağlar. Ayrıca, tamamlanan DNA ürünlerin uzunluğu çoğaltma processivity raporlar. Bu deney, çok kolay ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilen ve sadece makul ölçüde duyarlı bir kamera ile bir floresan mikroskop gerektirir.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replisomes DNA replikasyonu görselleştirmek için basit bir tek-molekül floresan mikroskopi tekniği gösterir.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

visualizing-single-molecule-dna-replication-with-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

22.3K Görüntüleme.  Harvard Medical School. Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replisomes DNA replikasyonu görselleştirmek için basit bir tek-molekül floresan mikroskopi tekniği gösterir.

Video: Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biyoloji

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Floresan Mikroskobu ile Çoklu Nesiller boyunca Canlı Memeli Hücrelerinde Plazmid Çoğaltma İzlenmesi

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.