PAC נתמך בחלקו על ידי מכון לאומי לבריאות T32 מענק לאוניברסיטת התכנית ויסקונסין לתאי גזע אימון (הרשות קלארק). JSK מומן בחלקו על ידי Professorship HEADRUSH גידולי המוח במחקר, קרן רוג&#39;ר Loff זכרון GBM מחקר, וUW הקרן / מחקר נוירוכירורגיה גידולי מוח ובקרן השתלמות. JCW וי.ח. נתמכים חלקית על ידי מענק NIH NIBIB 1R01EB009103-01.

1. התא של BTSC דיסוציאציה BTSCs נגזרים מתרבויות קיימות מראש שגודלו בתאי גזע בינוני סרום ללא כneurospheres. התרבות אשר מתוארת 10, 11 בעבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השעית תא מneurospheres BTSC נגזרות. neurospheres BTSC-derived נאסף בצינור חרוטים 15 מ&quot;ל וcentrifuged ב900 סל&quot;ד במשך 5 דקות. צנטריפוגה מהר יכולה גזירה ו / או ניזק neurospheres. Supernatant הוא aspirated ותרבות neurosphere היא resuspended ב 0.5 מ&quot;ל של Accutase מראש מחומם. פתרון זה הודגרו למשך 5-10 דקות על 37 מעלות צלזיוס ומאפשר את neurospheres כדי לשחרר. תאים הם שבשו מכאניים עם 10-20 משייכות עדינות של פיפטה P100 ולאחר מכן 1.5 מ&quot;ל של מדיום תאי גזע יתווסף לתאים לנטרל Accutase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את BTSCs מכן centrifuged ב1300 סל&quot;ד במשך 5 דקות, וresuspended ב 1 מ&quot;ל של מדיום בתאי גזע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot μl 50 הוא להסיר את suspensיון והניח לתוך צינור microcentrifuge לספירת תאים. 50 μl של trypan כחול מתווסף לצינור אפנדורף וההשעיה ממוקמת בhemocytometer לספירת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נדרש לאחר ספירת תאים, תאי גזע בינוני נוספת מתווסף להשעית BTSC לתת צפיפות תאים של 20,000 תאים חיים / מדיה μl. </li></ol> 2. המצאה של סו 8 אדון דו שכבתי ודפוס של חותמת PDMS (ראה תרשים 1) אנו משתמשים ליתוגרפיה האופטית ליתוגרפיה רכה ולפברק su-8 אדון וחותמת PDMS, שהם חיוניים להרכבה של מכשירי microfluidic. מעט שונה מההליך הרגיל 12, סו 8-אדוננו מורכב משתי שכבות. את microchannels-3-מיקרומטר הגבוה הם casted בשכבה הראשונה / תחתונה מוקדם יותר בתהליך, ואילו תאי זריעה וקבלת 250-מיקרומטר-הגבוהים הם בשכבה השנייה / העליונה. על מנת שחיבור נכון בין שני מדורי תרבות (microchannelשל ותאים), שתי שכבות צריכות להיות מיושרות במדויק בתפקיד. עם זאת, עובי ואטימות של השכבה השנייה הם גדולים מספיק כדי לחסום את aligner fiducial / אופטי גישה לתכונות התחתונות. כאן אנו מעצבים את המסכות עם סמני fiducial שמוצבים מרחוק. לפיכך, סמנים אלה בשכבה הראשונה יכולים להיות מוגנים באופן סלקטיבי תוך ספינינג השכבה השנייה. כתוצאה מכך, שתי השכבות של תכונות נעשות באדון אחד ומוכן לדפוס בתבליט של בול PDMS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנן ולהכין שתי תמונות מסכות. מסכה אחת מורכבת משני סמני fiducial ומערך של microchannels (400 מיקרומטר ארוך ורחב 10-50 מיקרומטר) לשכבה הראשונה. עוד מסכה מורכבת מזריעה וקבלת תאים (2 מ&quot;מ ארוך ורחב 600 מיקרומטר) לשכבה השנייה. שני המסכות נועדו בIllustrator (Adobe, קליפורניה), הליזר מודפס על גבי סרטי שקיפות (חלקי מתכת דקים, קולורדו), ניקו עם isopropanol ואוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את השכבה הראשונה עםsu-8 photoresist (MicroChem, מסצ&#39;וסטס) על פי חוברת הוראות של מוצר מספק. ראשית, ספין מעייל רקיק הידית (חומרי WRS, קליפורניה) עם photoresist 3-מיקרומטר בעובי של su-8 (5), ואחריו רך של אפייה. Photoresist אז סגול חשוף ונרפא עם המסיכה המתאימה במגע קרוב, ואחרי שלאחר אפייה ובפיתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מעייל השכבה השנייה עם 250 מיקרומטר העבה su-8 (2100). על מנת למנוע photoresist העבה מחסימת סמני fiducial מהשכבה הראשונה, אנחנו מכסים שטחים אלו בנייר דבק בלפני ספין ציפוי של השכבה השנייה. אז הקלטת התקלפה לחשוף את הסמנים למטרת יישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> UV-לחשוף את השכבה השנייה עם המסכה 2. עם סמני היישור גילו, זה פשוט, כדי ליישר אותם לאלה במסכה השנייה באמצעות aligner מסיכה אופטית. השכבה השנייה של photoresist אז סגול חשופה ורפא במגע קרוב, ואחרי אפיית הודעה ופיתוח. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעייל נגד מקל ההורים הביאו. כדי לסייע בהסרת PDMS נרפא, סו 8-האדון ניתן silanized באמצעות שיקוע כדי ליצור את משטח ציפוי טפלון סוג. פשוט מניח אותה לייבוש למשך שעה אחת לפחות, עם כמה טיפין של trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) פתרון silane תחת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובש PDMS עם האב. מערבב בסיס prepolymer וידעונית של PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, מישיגן) ב10:01 יחס יסודיות. מקם אותו בתא ייבוש לdegassing ואקום עד שלא נראית בועת אוויר. יוצק את התערובת על המסכה והדגה שוב אם בועת האוויר חדשה הוא הציג. לרפא את העובש על פלטה חשמלית ברמה של 2 שעות ב90 ג לאחר שהיא מתקררת לטמפרטורת חדר, משחרר בעדינויות את חותמת PDMS. לפיכך, ערוצי culturing חקוקים בPDMS ומוכן להרכבה של מכשיר. האדון הוא לשימוש חוזר עבור דפוס עד שהוא סדוק או שחוק. הציפוי נגד המקל צריך להתבצע שוב כאשר הדביקות חוזרת. </li></ol> 3.הרכבה של מכשירי microfluidic וculturing תא (איור 2) כדי תאי תרבות, חותמת PDMS תכונה החקוקה מצורפת לcoverslip זכוכית ליצירת ערוצים סגורים. מפרצונים ונוצרים שקעים לטעינת התרבות / תקשורת. בינתיים, ניקוי והליכים אחרים למצע הזכוכית וחותמת PDMS נחוצים כדי להבטיח את תא התאימות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מאגרים באמצעות חותמת PDMS באמצעות אגרופן חור ביופסיה. אנחנו בוחרים קוטרם להיות 6 מ&quot;מ. מאגרים אלה משמשים לשתי מטרות. אחת הוא להחזיק תזונתי נוספת לצמיחת תאים. השני הוא לגישה של טעינת פיפטה ושאיפת אבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרה את חותמת PDMS ב70% אתנול למשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף אותו עם מים לא מיוננים למשך 10 דקות נוספות. המטרה היא לנקות את השאריות אורגניות פוטנציאליות הציגו במהלך תהליך ייצור, וuncrosslinked זיהום PDMS. תהליכי ניקוי יותר אינטנסיביים ויסודיים כגון מיצוי אורגני 13 </sup&gt; וחילוץ Soxhlet 14 שמשו במקום אחר. עם זאת, מצא אותו מיותר בתרבות BTSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את חותמת PDMS באמצעות חיטוי (121 ° C, 35 דקות). צעד זה נוסף משלים את תגובת crosslink של PDMS. החל מהשלב הזה ועד שלב 3.6, כל ההליכים נלקחים באופן סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז חותמת PDMS מונחת על coverslip זכוכית, אשר מצופה בעבר עם פולי-L-ליזין. 15-17 מכשיר אז מצופה laminin ידי מילוי הערוץ עם פתרון laminin הלילה בשעת 37 ° C. Laminin הוא aspirated מהמכשיר והמכשיר הוא שטף עם מדיום בתאי גזע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען השעית תא של שלב 1 לתוך מאגרים ותעלות. 11 μl של תאים ניתקו ממוקם במאגר זריעה אחד. שאיפת ואקום משמש להפוך תאים לתוך תא הזריעה, במידת צורך. 7 μl נוסף של תאים מוקם מאגר הזריעה הסמוכה. הערה: ממוצע צפיפות תאים היא 20,000 תאים / μl תקשורת. בירכתי הספינהאה חמש דקות, הזריעה ומאגרים שקבלו מוצפים באמצעי תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 0.5-1 גיליון PDMS מראש autoclaved מ&quot;מ על גבי. הידבקות המשטח התרחש באופן טבעי, בין שתי פיסות PDMS תעשה תרבית התאים אטומות ומוכנה להובלה, דגירה והדמיה מיקרוסקופית. </li></ol> 4. לטווח ארוך הדמית זמן לשגות של BTSC הגירה עם BioStation IM (ניקון מכשירי Inc, מלוויל, ארה&quot;ב). שילוב של מצלמה, תוכנה וחממה כל אחד בתיבה, מערכת מיקרוסקופית זה מאפשר לתרבית תאי תמונה ללא הפרעה במשך ימים. בנוסף, עיצוב המנוע הייחודי שלה מעביר את העדשה האובייקטיבית ושומר במת מדגם נייח בתכונת נקודת ביקור-. זה עושה את זה מעשי לניסויים מקבילים תמונה ותנועת תאים במסלול בדיקת תפוקה גבוהה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לאזן IM Biostation במשך 45 דקות כדי לייצב את אספקת טמפרטורה, לחות ואוויר. תוספת של כמה מי המשךמנות ained בחדר מדגם משמשת כדי לשמור על לחות מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המכשיר סלולרי, המתקיים קאמרי המדגם של מיקרוסקופ, ומרכז אותה באמצעות פינצטה מייקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המיקוד, מיקום נקודות וזמן-נקודות בתוכנה ולהתחיל Biostation הזמן לשגות. </li></ol> 5. תוצאות נציג: דוגמאות לבדיקה חזותית ואפיון של נדידת תאי הסרטן באמצעות מכשיר microfluidic מידור מומחשות באיור 3 ואיור 4. תא אונליין הוא BTSC. עם ההתקנה הנוכחית שלנו, תמונות שלב של תרבית תאים ניתן להקליט ברציפות במשך זמן רב ככל 5 ימים (איור 3) ותכוף כמו כל 2 שניות (איור 4). מעבר 5 ימים, תקשורת התרבות צריכה להיות מוחלפת למילוי ופסולת תזונתיים הוסר. לטווח ארוך הזמן לשגות שלנו מזהה רצף מסתובב של שישה שלבים סלולריים במהלך נדידתו מבוססת על השינויים מורפולוגיים. כillustrated באיור 3, שמתארים אותם כ( ט) לפני ההגירה, (ii) ייזום, (iii) נתיב חיפושים, (iv) שיוט, יעד-exloration (v) ולאחר ההגירה (vi). בחדר הקבלה, תאי כישור בצורה להישאר בשלב (i) כמו בגידולים בתפזורת כי הם מסוגלים לגדול, להתחלק ולהעביר בהדרגה. ככל שהם מתקרבים לכניסת microchannel, כמה תאים להמשיך לביים (ii) כאשר הם להרחיב וליצור בליטת דבק. רק אחד מהם הוא מסוגל לכבוש את הכניסה ולהמשיך לשלב (ג), שיכול לחקור את כיוון הנדידה. לאחר התא מקובע את כיוון הנדידה, הוא ממשיך ושלב (ד) לשיוט דרך microchannel במהירות קבועה וגבוהה, אשר נעשית דרך microchannel כולו. בסוף תמורת microchannel, תאים לבמה (v) כדי לחקור את החלל הפתוח של קבלת חדר, ולאחר מכן לבמה (vi). בmicrochannel, כוח נודד נוצר בעיקר על ידי פעילות blebbing כפי שמודגם באיור 4, בדומה לזה של amoeboid celאני. blebbing תא ועיוות קרום נרשמים באופן מלא כאן. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. שרטוטים של ייצור של מכשיר microfluidic. התהליך כולו מתבצע על פרוסות סיליקון ידית סיליקון 3-inch באמצעות טכניקה שונה של ליתוגרפיה הרכה. microchannels 3-מיקרומטר-גבוה וסמני יישור נעשים כמו בשכבה הראשונה. אז su-8 250 מיקרומטר בעובי הוא ספין מצופה, ואילו סמני היישור מכוסים בנייר דבק, כך שאינם יכול מאוחר יותר להיות נגיש כדי להסוות aligner ללא חסימת ראייה על ידי photoresist העבה. לפיכך, תכונות קאמריות יכולות להתבצע כשכבה השנייה ומדויקת מיושר לשכבה הראשונה. חותמת PDMS מעוצבת סופו של דבר את האדון שהתקבל. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. שרטוטים של הרכבת מכשיר ותהליך זריעת תא. מוקף PDMS וglcoverslip תחת, חלל culturing 3D מורכב מתאים, מאגרים וmicrochannels. קאמרי זריעה מלאה בתרבית תאים, ואילו התא המקבל תחילה מלא בתקשורת סלולרית בחינם. את microchannels שמתחבר ביניהם לספק שביל תא נודד מצד לזריעת קבלת צד. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הגירת BTSC דרך microchannel. עליון: תצלומים של זמן לשגות להראות תא בודד (מודגש בירוק) נודד מעל 400 מיקרומטר מצד הזריעה לצד המקבל. כל המסע לוקח בערך 2 ימים, הכולל רצף של שינויים מורפולוגיים סלולריים. סרגל קנה המידה הוא 40 מיקרומטר. הנמך: ייצוג קריקטורה של שישה שלבי הגירה. טרום הגירה (i): בחדר זריעה, תאי כישוריות וdividable להעביר בהדרגה לאורך אחד את השני. תאי הגזע ליד כניסת microchannel אחד עם השני על ידי קיטוב גוף תא ודואר<html> xerting בליטת lamellipodia. ייזום (ii): התא הנודד עם הקיבולת הגבוהה ביותר תופס את כניסת הערוץ בעוד מתחרתה תיסוג. נתיב חיפושים (iii): שינויי התאים הנודדים למצב amoeboid עם קוטביות קטנה. מצב הגירה זה מאוד ניע ומסוגל לחקור נתיב בכל הכיוונים על ידי blebbing בליטות קטנות בממברנה. שיוט (ד): ברגע שנתיב הנדידה נקבע, התא הופך למצב amoeboid הותאם על ידי שמירה על בליטה גדולה נוספת בדרך קדימה. בדרך זו, תא מקיימת תנועתיות גבוהות, כמו גם כיוון ומהירות קבוע. יעד חיפושים-(v): עם נתיב הקצה, התא מאט ומפתחת filopodias לחקור את חדר קבלה לכל מטרת פלישה. לאחר הגירה (vi): אחרי שנכנס לחדר הקבלה, תא הופך לצורת כוכב ושומר על תנועתיות גבוה, אך ללא כיוון נקבע. &quot;/&gt; . איור 4 תצלומים של זמן לשגות להראות מעגל blebbing עיוות פעילות וקרום של BTSC: (AB). ייזום; (BD). התרחבות; (DF). הכחשה. החיצים ועקומים הקווים מייצגים את הכיוון ומיקום של עיוות קרום, בהתאמה. את התמונות נאספות כל 8 שניות.

<ol>
	<li>Carke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Stem+Cells-Perspectives+on+Current+Status+and+Future+Directions.">Cancer Stem Cells-Perspectives on Current Status and Future Directions.</a> AACR Workshop on Cancer Stem Cells. Cancer Research. 66, 9339-9344 (2006).</li><li>Stupp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352, 987-996 (2005).</li><li>Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cancer+cell+invasion.">Mechanisms of cancer cell invasion.</a> Current Opinion in Genetics &#38; Development. 15, 87-96 (2005).</li><li>Shackleton, M., Quintana, E., Fearon, E. R., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+Cancer:+Cancer+Stem+Cells+versus+Clonal+Evolution.">Heterogeneity in Cancer: Cancer Stem Cells versus Clonal Evolution.</a> Cell. 138, 822-829 (2009).</li><li>Karnoub, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+within+tumour+stroma+promote+breast+cancer+metastasis.">Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis.</a> Nature. 449, 557-557 (2007).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+Devices:+New+Tools+for+Studying+Cancer+and+Cancer+Stem+Cell+Migration.">Microfluidics-based Devices: New Tools for Studying Cancer and Cancer Stem Cell Migration.</a> Biomicrofluidics. 5, (2011).</li><li>Rolli, C. G., Seufferlein, T., Kemkemer, R., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Tumor+Cell+Cytoskeleton+Organization+on+Invasiveness+and+Migration:+A+Microchannel-Based+Approach.">Impact of Tumor Cell Cytoskeleton Organization on Invasiveness and Migration: A Microchannel-Based Approach.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Chung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+into+scaffolds+under+co-culture+conditions+in+a+microfluidic+platform.">Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform.</a> Lab on a Chip. 9, 269-275 (2009).</li><li>Irimia, D., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+migration+of+cancer+cells+under+conditions+of+mechanical+confinement.">Spontaneous migration of cancer cells under conditions of mechanical confinement.</a> Integrative Biology. 1, 506-512 (2009).</li><li>Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85, 141-152 (1998).</li><li>Clark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+cancer+stem+cells+exhibit+decreased+dependence+on+exogenous+growth+factors+for+proliferation+and+survival.">Glioblastoma cancer stem cells exhibit decreased dependence on exogenous growth factors for proliferation and survival.</a> , .</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37, 551-575 (1998).</li><li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities.">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab on a Chip. 7, 987-994 (2007).</li><li>Regehr, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture.">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab on a Chip. 9, 2132-2139 (2009).</li><li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation.">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nature Cell Biology. 9, 1347-1347 (2007).</li><li>Hu, X. D., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Dynamic+Microtubule+Invasion+of+Dendritic+Spines.">Activity-Dependent Dynamic Microtubule Invasion of Dendritic Spines.</a> Journal of Neuroscience. 28, 13094-13105 (2008).</li><li>Vitzthum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+Na(+)/H(+)+exchange-mediated+pH(i)+regulations+in+neuronal+soma+and+neurites+in+compartmentalized+microfluidic+devices.">Study of Na(+)/H(+) exchange-mediated pH(i) regulations in neuronal soma and neurites in compartmentalized microfluidic devices.</a> Integrative Biology. 2, 58-64 (2010).</li><li>Clark, P. A., Treisman, D. M., Ebben, J., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+signaling+pathways+in+brain+tumor-derived+stem-like+cells.">Developmental signaling pathways in brain tumor-derived stem-like cells.</a> Developmental Dynamics. 236, 3297-3308 (2007).</li><li>Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Hierarchy+of+Self-Renewing+Tumor-Initiating+Cell+Types+in+Glioblastoma.">A Hierarchy of Self-Renewing Tumor-Initiating Cell Types in Glioblastoma.</a> Cancer Cell. 17, 362-375 (2010).</li><li>Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+Stem+Cell+Lines+Expanded+in+Adherent+Culture+Have+Tumor-Specific+Phenotypes+and+Are+Suitable+for+Chemical+and+Genetic+Screens.">Glioma Stem Cell Lines Expanded in Adherent Culture Have Tumor-Specific Phenotypes and Are Suitable for Chemical and Genetic Screens.</a> Cell Stem Cell. 4, 568-580 (2009).</li><li>Lobo, N. A., Shimono, Y., Qian, D., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+cancer+stem+cells.">The biology of cancer stem cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 675-699 (2007).</li><li>Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li><li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Research. 64, 7011-7021 (2004).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

מכשיר microfluidic וטכניקת הקלטת תמונה המוצגת כאן מאפשרים אפיון חזותי של מורפולוגיה סלולרית בעת הנדידה. בהשוואה לשיטות קונבנציונליות קיימות, כוללת פלטפורמת microfluidic יתרונות של עלות יעילה, תפוקה גבוהה וגמישות בעיצוב. מערכת ההדמיה המיקרוסקופית הציגה מאפשרת מחקר והקלטה של ​​נדידת תאים חייה לטווח ארוך. תכונת עדשה הממונעת מאפשרת לעקוב אחר נתיבי נדידה מרובים בתמונה ברזולוציה גבוהה מבלי להפריע למדגם. במהלך ההרכבה של המכשיר, חותמת PDMS היא ערובה שאינן לצמיתות coverslip הזכוכית לנוחיות ציפוי PDL (שלב 3.4). זה קריטי להשגת איטום טוב להצלחתו של פרוטוקול זה. זיהום הציג מייצור המכשיר, כגון בועת אוויר בחותמת או אבק / לכלוך על פני המצע, יכול לסכן את המליטה והתוצאה בנוזל דולף. לכן, treating המכשיר באופן נטול אבק הוא חשוב כדי למנוע כשל בהתקן. לפני PDL-הציפוי, coverslips הזכוכית היא חומצה חנקתית טופלה ופתרון PDL הוא centrifuged לחסל אבק / לכלוך. אנחנו מוצאים את נייר דבק, אלכוהול לשטוף, ואמבט מים מאוד עוזר בהסרת אבק / לכלוך מבול PDMS, אם חדר נקי הוא לא נגיש. לאחר חותמת PDMS יצירת קשר עם coverslip הזכוכית, קשה על החותמת בעדינות עם פינצטה מקל את החותם. BTSCs ניתן להעשיר מחדר ניתוח דגימות אנושיות דרך התרבות בתחום תאי גזע בינוני, בדומה לתרבות של תאי גזע עצביים נורמלים 10. BTSCs מועשר באופן זה להדגים תכונות גזע תאים דמויים, כגון ביטוי של סמני תאי גזע (CD133, nestin), בידול לשושלות עצביות מרובות (גליה ועצבית), וייזום גידול במודל עכבר immunodeficient orthotopic עם כמה כמו 100 תאים 18. למרות שחלק ויכוח קיים לגבי purifiקטיון ותחזוקה של 1 BTSCs, 19-21, BTSCs תחום התוצרת טובה יותר לשמור על פנוטיפ וגנוטיפ של גידול ההורי 22-24. המרחב הממודר מחקה את הסביבה הפיזיולוגית לנדידת תאים. במכשיר שלנו, BTSC מפגין יכולת חזקה של הגירה דרך שטח מוגבל בגודל על ידי ויסות מורפולוגיה תאית. האפיון של השינויים מורפולוגיים הסלולריים שלנו מצביע על מצב תמורות ברצף שלב 6 שיכולים לעצב תיאור מפורט חדש אפשרי של פלישת BTSC של מוח הסמוך. בשלבים מוקדמים, התאים לקבל כמות משמעותית של קוטביות וליצור בליטות דבקות ביעילות לעגן את עצמם בתוך microchannel. ברגע שתפוסת התא בmicrochannel היא הוקמה, היא ממירה למצב שיוט ושומרת על מצב זה במשך כל הנסיעה דרך microchannel. בשלב זה, לשמור על תנועתיות BTSC גבוהה וכיוון עקבי אך לחסוך באנרגיה. בתוךterestingly, נראה כי אחד microchannel מוגבל לתא שיוט אחד בכל פעם, כך שכאשר תמורה יחידה סלולרית לשלב הזה, נסים תאים אחרים מmicrochannel. מנגנון זה מבטיח סיכוי יעילות של גידול ומונע התפשטות יתר של חומרים מזינים בmicrochannel. לאחר השלים נדידה על פני microchannel, תא חוזר לנטייתו לבליטות multidirectional ובדיקה נוספת למטרות פלישה או נתיבי הגירה חדשים. מכשיר microfluidic המידור מציע רומן במבחנה של יצירת משמעות microenvironment ללימוד חדירת BTSC של המוח parenchyma. שיטה זו יכולה בקלות להיות מותאמת למחקר של תאי גזע סרטניים (CSC) ושורות תאים נודדות הנגזרות מסוגי גידולים אחרים. תאי culturing במכשיר microfluidic ניתן לבצע בכל מעבדת ביולוגיה מודרנית שמצוידת באינקובטור ומומחיות תרבית רקמה. מצויד בסו 8 מאסטר, PDMSליהוק והרכבת מכשיר הם אפשריים עם קצת אימון בסיסי ליתוגרפיה הרכה. בנוסף, פלטפורמה זו עלולה להיות גם מורחבת עבור יישומים אחרים עם שילוב מודולים פונקציונליים אחרים כגון מיקסר שיפוע, דפוסי פני שטח, שליטה נוזלת וmicroelectrode.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> המדיום של Dulbecco העדכון של הנשר (DMEM), רמת הסוכר גבוה </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות </td></tr><tr><td> F12 של שינקין </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31765 </td><td> תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות </td></tr><tr><td> תוסף הוויטמין B27 מינוס </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td> תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות </td></tr><tr><td> אנטיביוטיקת Antimycotic (PSA) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15240 </td><td> תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות </td></tr><tr><td> פקטור צמיחה אפידרמיס (EGF), רקומביננטי אדם </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0313 &lt;/ Td&gt; <td> תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות </td></tr><tr><td> פקטור בסיסי גדילה (bFGF), רקומביננטי אדם </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0021 </td><td> תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות </td></tr><tr><td> מלח נתרן הפארין, מרירית מעי חזירית </td><td> סיגמא </td><td> H1027-250KU </td><td> תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות </td></tr><tr><td> Laminin (עכבר טבעי) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td> תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td> תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות </td></tr><tr><td> גזע בינוני תא </td><td></td><td></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30% החמס F12 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70% DMEM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% האנטיביוטיקה antimycotic </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2% B27 ללא ויטמין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EGF (20 ng / mL) וbFGF / הפרין (20 ng/ המ&quot;ל bFGF, הפרין 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) מרכיבים ומערבבים מסנן סטריליים לפני השימוש </li></ul></td></tr><tr><td> גורם בסיסי גדילה (bFGF) / הפארין </td><td></td><td></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוז aliquot 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 25 מיקרוגרם: הוסף 1.25 מ&quot;ל של הפרין 5mg/mL לbFGF מיקרוגרם 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 250 מיקרוגרם: הוסף 1 המ&quot;ל הפרין 5mg/mL לbFGF מיקרוגרם 250. העברה עד 15 מיליליטר חרוטים ולהוסיף המ&quot;ל הפרין 11.5 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​לקונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות כמו 50 או 250 aliquots μl μl ב -80 ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> גורם גדילה באפידרמיס (EGF) </td><td></td><td></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוז aliquot 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 200 מיקרוגרם: הוסף 1 המ&quot;ל סטרילי DMEM (Gibco 11965-118) לEGF מיקרוגרם 200. העברה עד 15 מיליליטר חרוטים ולהוסיף 9 המ&quot;ל DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 500 מיקרוגרם: הוסף 1 המ&quot;ל סטרילי DMEM (Gibco 11965-118) לEGF מיקרוגרם 200. העברה ל50 מיליליטר חרוטים ולהוסיף 24 המ&quot;ל DMEM. <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחסן 50 &amp; mu, אני או 250 aliquots μl ב-80 ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> הפארין </td><td></td><td></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוז aliquot 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקול את הפרין מ&quot;ג 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הפרין מ&quot;ג 100-20 מ&quot;ל (70%) DMEM-(30%) F12-(% 1) PSA (14 המ&quot;ל DMEM, 6 המ&quot;ל F12, 200 PSA μL) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון סטרילי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות כמו 50 או 250 aliquots μl μl ב -80 ° C </li></ul></td></tr><tr><td> su-8 photoresist </td><td> MicroChem </td><td></td><td></td></tr><tr><td> רקיק ידית סיליקון </td><td> חומרי WRS </td><td> 3P01-5SSP-INV </td><td></td></tr><tr><td> trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 448931 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS Sylgard 184 </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> laminin </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> 50 מיקרוגרם /מ&quot;ל ב PBS חיץ לריכוז הסופי </td></tr><tr><td> Biostation IM </td><td> ניקון מכשירים </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging

ב 40 השנים האחרונות, ארצות הברית השקיעה מעל 200 מליארד דולרים בחקר הסרטן, וכתוצאה מכך רק ירידה של 5% בשיעור תמותה. מכשול עיקרי בדרך לשיפור תוצאות מטופל הוא ההבנה הלקויה של מנגנוני נדידה סלולרית קשורה לסרטן תאי פלישה, גרורות אגרסיביות והתנגדות טיפולית 1. Glioblastoma multiforme (GBM), גידול הממאיר הנפוץ ביותר העיקרי מבוגר מוח 2, מדגים קושי זה. למרות ניתוח, הקרנות וכימותרפיה סטנדרטיות, חציון הישרדות חולה היא רק 15 חודשים, עקב חדירה אגרסיבית למוח GBM סמוך והישנות הסרטן מהירה 2. האינטראקציות של מנגנונים החריגים של תאים נודדים וגידול microenvironment סביר להבדיל מסרטן התאים נורמלים 3. לכן, שיפור גישות טיפוליות לGBM דורש הבנה טובה יותר של מנגנוני נדידת תאים סרטניים. העבודה האחרונה עולה thaתת אוכלוסיות קטנות ta של תאים בתוך GBM, תא גידול בגזע המוח (BTSC), עשויים להיות אחראים על התנגדות והישנות טיפוליות. מנגנונים בבסיס יכולת הנדידה BTSC רק מתחילים להיות 1,4 אפיין. בשל הגבלה בבדיקה ויזואלית ומניפולציה גיאומטרית, מבחני הגירה קונבנציונלית 5 מוגבלים לכימות אוכלוסיות תאים כוללות. לעומת זאת, מכשירי microfluidic להתיר ניתוח תא בודד בגלל תאימות עם מיקרוסקופיה ושליטה על מייקרו הסביבה 6-9 המודרניות. אנו מציגים שיטה לאפיון מפורט של הגירת BTSC באמצעות מכשירי microfluidic מידור. התקנים אלה PDMS התוצרת להטיל סביבת תרביות רקמה לשלושה תאים המחוברים: זריעה קאמרית, מקבל חדר וגישור microchannels. אנחנו מותאמים מכשיר כזה ששני התאים להחזיק תקשורת המספיקה כדי לתמוך BTSC קיימא עבור 4-5 דהys ללא מדיה חליפין. BTSCs מאוד נייד הציג בתחילה לתא מבודד הזריעה לאחר הגירה למרות גישור microchannels לחדר קבלה המקביל. הגירה זה מדמה התפשטות הסרטן סלולרי דרך חללי ביניים של המוח. תמונות החיות של שלב מורפולוגיה תא, במהלך הנדידה נרשמות על פני כמה ימים. BTSC מאוד נדידה ולכן יכול להיות מבודד, recultured, ונתח יותר. מיקרופלואידיקה מידור יכולה להיות פלטפורמה תכליתית למחקר הנדידה של BTSCs ותאי גזע סרטני אחרים. על ידי שילוב של המחוללים הדרגתיים, טיפול בנוזלים, מייקרו אלקטרודות ומודולים microfluidic אחרים, מכשירים אלה יכולים גם לשמש לסריקת תרופות ואבחון מחלה 6. בידודו של תת אוכלוסיות אגרסיביות של תאים נודדים יאפשר מחקרים של מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging at JoVE.com

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

מכשיר microfluidic מידור לחקר נדידת תאי גזע סרטני מתואר. פלטפורמה חדשנית זו יוצרת microenvironment סלולרי קיימא ומאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של תנועת תאים חייה. מאוד ניעתי תאים סרטניים מבודדים ללמוד מנגנונים מולקולריים של חדירה אגרסיבית, שעלולים לגרום לטיפולים יעילים יותר בעתיד.

הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

evaluation-cancer-stem-cell-migration-using-compartmentalizing

Research

JoVE Journal

Medicine

25.2K Views.  University of Wisconsin-Madison. מכשיר microfluidic מידור לחקר נדידת תאי גזע סרטני מתואר. פלטפורמה חדשנית זו יוצרת microenvironment סלולרי קיימא ומאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של תנועת תאים חייה. מאוד ניעתי תאים סרטניים מבודדים ללמוד מנגנונים מולקולריים של חדירה אגרסיבית, שעלולים לגרום לטיפולים יעילים יותר בעת...

Video: Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

מיים מודלים של הדמיה חיה של תאים 4D גידול: אינטראקציות microenvironment המשפיעים ממאירה התקדמות

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

עיבוד של רקמת גידול במוח העיקרית למבחנים בתאי גזע וזרימת מיון

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

In organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is indispensable for proper physiological function, and the formation and maintenance of these structures is a highly regulated process. The analysis of these complex, 3-dimensional structures has greatly depended on either 2-dimensional examination in section or on dye injection studies. These techniques, however, are not able to provide a complete and quantifiable representation of the ductal or vascular structures they are intended to elucidate. Alternatively, the nature of 3-dimensional plastic resin casts generates a permanent snapshot of the system and is a novel and widely useful technique for visualizing and quantifying 3-dimensional structures and networks.
A crucial advantage of the resin casting system is the ability to determine the intact and connected, or communicating, structure of a blood vessel or duct. The structure of vascular and ductal networks are crucial for organ function, and this technique has the potential to aid study of vascular and ductal networks in several ways. Resin casting may be used to analyze normal morphology and functional architecture of a luminal structure, identify developmental morphogenetic changes, and uncover morphological differences in tissue architecture between normal and disease states. Previous work has utilized resin casting to study, for example, architectural and functional defects within the mouse intrahepatic bile duct system that were not reflected in 2-dimensional analysis of the structure1,2, alterations in brain vasculature of a Alzheimer's disease mouse model3, portal vein abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic mice4, developmental steps in rat lymphatic maturation between immature and adult lungs5, immediate microvascular changes in the rat liver, pancreas, and kidney in response in to chemical injury6.
Here we present a method of generating a 3-dimensional resin cast of a mouse vascular or ductal network, focusing specifically on the portal vein and intrahepatic bile duct. These casts can be visualized by clearing or macerating the tissue and can then be analyzed. This technique can be applied to virtually any vascular or ductal system and would be directly applicable to any study inquiring into the development, function, maintenance, or injury of a 3-dimensional ductal or vascular structure.

A method of visualizing and quantifying the 3-dimensional structure of mouse hepatic portal vein or intrahepatic bile duct is described. This resin cast technique can also be applied to other ductal or vascular systems and allows for in situ visualization or quantification of a system's intact communicating architecture.

יציקה והדמיה של וריד שער מאוס או מערכת צינור מרת intrahepatic שרף 3-Dimensional

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

מוות של תאים הקשורים מיטוזה חריגה נצפה על ידי ההדמיה Confocal בתאי סרטן חיים

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

העשרה לתאי גזע Chemoresistant סרטן השחלות משורות תאים אנושיות

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.