PAC는 부분적으로 위스콘신 줄기 세포 연수 프로그램 (PA 클락)의 대학에 NIH T32 교부금으로 지원됩니다. JSK는 부분적으로 HEADRUSH의 뇌 종양 연구 교수, 로저 Loff 기념 GBM 연구 기금과 UW 재단 / 신경 외과 뇌 종양 연구 및 교육 기금에 의해 지원되었다. JCW와 YH는 부분적으로 NIH 보조금 NIBIB 1R01EB009103-01에 의해 지원됩니다.

1. BTSC의 세포 분리 BTSCs는 neurospheres으로 혈청이없는 줄기 세포 매체에서 재배 기존의 문화에서 파생됩니다. 의 문화는 이전에 10, 11 설명되어 있습니다. <ol><li> BTSC - 파생 neurospheres에서 세포 현탁액을 준비합니다. BTSC - 파생 neurospheres로 15 ML 원뿔 튜브에 수집 된 5 분 900 rpm으로 centrifuged 있습니다. 빠른 원심 분리는 전단 및 / 또는 손상 neurospheres 수 있습니다. 표면에 뜨는이 흡입되어 neurosphere 문화는 사전 예열 Accutase의 0.5 ML에 resuspended 있습니다. 이 솔루션은 37 5-10분에 대한 incubated 수 있습니다 ° C neurospheres가 풀어야 할 수 있도록합니다. 셀은 기계적으로 10-20 부드러운 P100의 피펫의 스트로크 한 후 줄기 세포 매체의 1.5 ML은 Accutase을 중화하기 위해 셀에 추가됩니다으로 끝낼 수 있습니다. </li><li> BTSCs 그 다음 5 분 1,300 rpm으로 centrifuged, 그리고 줄기 세포 매체 1 ML에 resuspended 있습니다. </li><li> 50 μl 나누어지는이 suspens에서 제거됩니다이온은, 세포 계산을위한 microcentrifuge 튜브에 배치. trypan 파랑의 50 μl는 Eppendorf 튜브에 추가되고 정지는 셀 계산을위한 hemocytometer에 배치되어 있습니다. </li><li> 셀 계산 한 후 필요한 경우 추가 줄기 세포 매체는 20000 라이브 셀 / μl 미디어의 셀 밀도를 제공 할 수있는 BTSC 정지에 추가됩니다. </li></ol> 2. 이중 계층 스와-8 마스터와 PDMS 스탬프의 성형 제작 (그림 1 참조) 우리는 마이크로 유체 장치의 조립에 필수적인 스와-8 마스터와 PDMS 스탬프를 조작하는 광학 리소그래피와 부드러운 리소그래피를 사용합니다. 표준 절차 12보다 약간 다른, 우리의 스와-8 마스터는 두 층으로 구성되어 있습니다. 250 μm 높이 퍼 뜨리고 및 수신 챔버 두 번째 / 상위 레이어에있는 동안 3 μm 높이 microchannels은 이전 과정에서 아래 / 첫 번째 층에 주조되어 있습니다. 이 문화 구획 (microchannel 사이의 올바른 연결을 위해서는s와 챔버), 두 레이어가 정확하게 위치에 정렬해야합니다. 그러나, 두 번째 층의 두께와 불투명도는 아래 기능을 액세스 광학 / fiducial aligner를 차단 할 수있을만큼 큽니다. 여기 fiducial 마커가 원격 위치하고있는 마스크를 디자인합니다. 두 번째 레이어를 회전하는 동안 따라서, 첫 번째 레이어에서 이러한 마커는 선택적으로 차폐 될 수 있습니다. 그 결과, 기능을 모두 레이어가 하나의 마스터에서 만든되고 PDMS 스탬프의 얕은 돋을 새김으로 성형 준비. <ol><li> 디자인 두 사진 마스크​​를 준비합니다. 한 마스크는 두 fiducial 마커와 첫 번째 층에 microchannels의 배열 (400 μm 길이 10-50 μm 폭)으로 구성되어 있습니다. 또 다른 마스크는 두 번째 레이어 챔버 (2mm 길이 600 μm 폭)을 퍼 뜨리고 및 수신 구성되어 있습니다. 두 마스크가 일러스트 레이터 (어도비, 캘리포니아)에 설계되어, 이소프로판올, 공기 건조로 청소 투명 필름 (얇은 금속 부품, 콜로라도)에 레이저 인쇄. </li><li> 첫 번째 층과 만들기스와-8 포토 레지스트 (MicroChem, 매사추세츠) 공급 업체의 제품 설명서에 따라. 첫째, 스핀 코트 스와-8 (5)의 3 μm 두께의 포토 레지스트와 핸들 웨이퍼 (WRS 자료, 캘리포니아) 소프트 베이킹이 나타납니다. 포토 레지스트는 자외선 노출 후 베이킹 개발에 이어 가까운 접촉에서 해당 마스크와 치료 후입니다. </li><li> 스와-8 (2100) 두께 250 μm와 스핀 코트 두 번째 층. 첫 번째 층에서 fiducial 마커를 차단에서 두꺼운 포토 레지스트를 방지하기 위해, 우리는 두 번째 층의 스핀 코팅하기 전에에 스카치 테이프로 이러한 영역을 다룹니다. 테이프 그런 다음 정렬 목적으로 마커를 나타 내기 위해 벗겨되어 있습니다. </li><li> UV-노출 두 번째 마스크가 두 번째 레이어를. 정렬 마커가 발견으로, 그것은 광학 마스크 aligner를 사용하여 두 번째 마스크에있는 사람들에게 정렬 간단합니다. 포토 레지스트의 두 번째 층은 자외선 노출과 가까이 접촉에서 치료, 사후 제빵 및 개발에 이어 다음입니다. &lt;/ 리&gt; <li> 안티 - 스틱 코팅 된 마스터합니다. 치료 PDMS의 제거에 도움이되는 스와-8 마스터는 표면에게 nonstick 형 코팅을 할 수 증착을 통해 silanized 할 수 있습니다. 간단하게 trichloro 여러 드롭스 (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 진공 실란 솔루션으로, 적어도 하나의 시간 동안 건조기에 넣으십시오. </li><li> 마스터와 PDMS을 본 뜨는거야. 성 예비 중합체베이스 철저히 10시 1분 비율로 PDMS Sylgard 184 (다우 코닝, 미시간)의 치료자를 섞는다. 공기 방울은 본 적이 될 때까지 진공 degassing을위한 건조기에 넣으십시오. 새로운 기포가 도입되는 경우 다시 마스크와 가스를 제거하다에 혼합물을 부어. 는 실내 온도에 냉각 한 후 90 C.에서 2 시간 동안 레벨 열판에 금형을 치료, 부드럽게 PDMS 스탬프를 놓습니다. 따라서, 배양 채널 PDMS에 새겨진 및 장치의 조립 준비되어 있습니다. 이 금이 간 또는 착용 될 때까지 마스터 성형 재사용합니다. 안티 - 스틱 코팅 끈적 거림이 회복되면 다시 수행해야합니다. </li></ol> 3.마이크로 유체 장치 및 세포 배양의 조립 (그림 2) 문화 셀 위해, 기능 조각 PDMS 스탬프는 동봉 된 채널을 형성하기 위해 유리 coverslip에 부착되어 있습니다. 유입구 및 유출구는 문화 / 미디어를로드하기 위해 생성됩니다. 한편, 청소 및 유리 기판과 PDMS 스탬프를 다른 절차는 셀 호환성을 보장하기 위해 필요합니다. <ol><li> 생검 구멍 구멍을 뚫는를 사용하여 PDMS 스탬프를 통해 저수지하십시오. 우리는 직경이 6mm로 선택합니다. 이 저수지는 두 목적을 위해 제공하고 있습니다. 하나는 세포 성장을위한 추가 영양을 보유하는 것입니다. 다른 하나는 피펫 로딩 및 진공 흡인의 액세스입니다. </li><li> 30 분에 에탄올의 70 %에 PDMS 스탬프를 만끽 한 다음 다른 10 분에 드 이온화 물을 씻어. 목적은 제조 과정에서 도입하고, PDMS 오염을 uncrosslinked 잠재적 인 유기 잔차을 취소하는 것입니다. 이러한 유기 추출 13으로 더 강렬하고 철저한 청소 프로세스 </sup&gt;와 Soxhlet 추출 (14) 다른 곳에서 사용되었다. 그러나, 우리는 BTSC 문화가 필요 발견했다. </li><li> 압력솥 (121 ° C, 35 분)를 사용하여 PDMS 스탬프를 검사. 이 단계는 더 PDMS의 crosslink 반응을 완성합니다. 이 단계에서 시작하여 단계 3.6까지 모든 절차는 무균 방식으로 촬영하고 있습니다. </li><li> PDMS 스탬프 그런 다음 이전에 폴리-L-라이신으로 코팅 된 유리 coverslip에 놓여 있습니다. 15-17 장치는 다음 37 번 박 laminin 솔루션과 채널 ° C.를 작성하여 laminin으로 코팅되어 있습니다 Laminin은 장치에서 흡입되고 장치가 줄기 세포 매체로 세척합니다. </li><li> 저수지 및 채널에 1 단계에서 세포 현탁액을로드합니다. dissociated 세포 11 μl 한 심는 저장소에 배치됩니다. 진공 흡인이 필요한 경우, 시딩 챔버에 세포를 강제하는 데 사용됩니다. 셀의 추가 7 μl은 인접한 심는 저장소를 배치하고 있습니다. 참고 : 평균 셀 밀도는 20,000 세포 / μl 미디어입니다. 고물에어 5 분 심는 및 수신 저수지는 미디어와 물이 차고 있습니다. </li><li> 상단에 0.5-1 mm 사전 autoclaved PDMS 시트를 놓습니다. 이 PDMS 조각 사이의 자연 - 발생 표면 부착은 세포 배양은 밀폐 및 운송, 부화 및 미세 이미지 준비 할 것입니다. </li></ol> 4. BioStation IM (니콘 인스트루먼트 Inc의, 멜빌, USA)와 BTSC 이주의 장기 시간 경과 영상. 카메라를 결합, 소프트웨어 및 보육 모든 한 상자 안에서,이 미세 시스템은 일없이 방해와 이미지 세포 배양에이 가능합니다. 또한, 독특한 모터 설계 목적 렌즈를 이동하고 포인트 방문 기능에 고정 샘플 단계를 유지합니다. 이 높은 처리량 분석에 이미지 병렬 실험을 추적 세포 운동하는 것이 실용적 수 있습니다. <ol><li> 사전 평형 온도, 수분, 공기 공급을 안정화시키기 위해 45 분 동안 Biostation의 IM합니다. 여러 물 cont의 추가샘플 챔버에서 ained 요리는 적절한 습도를 유지하는 데 사용됩니다. </li><li> 현미경의 샘플 챔버에 휴대가 가능한 장치를로드하고, 센터는 마이크로 핀셋을 사용합니다. </li><li> Biostation 소프트웨어의 초점, 위치 - 포인트 및 시간 포인트를 설정하고 시간 경과를 시작합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : compartmentalizing 마이크로 유체 장치를 사용하여 암 세포 이주의 육안 검사 및 특성의 예는 그림 3과 그림 4에 설명되어 있습니다. 세포 라인은 BTSC입니다. 현재 설치로는, 세포 배양의 위상 이미지는 지속적으로 오일 (그림 3)과 같은 긴 매 2 초 (그림 4)처럼 자주로에 대해 기록 할 수 있습니다. 오일 외에도, 문화 미디어가 삭제 영양 보충 및 폐기물에 대한 교체해야합니다. 우리의 장기 시간 경과는 형태학의 변화에​​ 근거하여 마이그레이션하는 동안 여섯 세포 단계의 회전 순서를 식별합니다. illus으로그림 3 trated, 우리는 (i) 사전 마이그레이션하고, (ii) 개시은 (III) 경로 - 탐험, (IV)가, (V) 대상 - exloration와 (VI) 후 이주를 주행로에 대해 설명합니다. 수신 챔버에서 스핀들 모양의 세포는 성장 나누어 점진적으로 마이그레이션 할 수 있습니다 대량 종양에서와 같이 무대은 (i)에있어. 그들은 microchannel 입구에 접근함에 따라, 몇 전지는 무대를 진행 (II)는 접착제 돌출부를 확장하고 생성 할 때. 그 중 하나가 입구를 점유하고 마이그레이션 방향을 탐색 할 수 무대 (3)으로 이동 할 수 있습니다. 셀 마이그레이션 방향을 결정하면, 그것은 전체 microchannel을 통해 수행됩니다 지속적으로 높은 속도에서 microchannel을 통해 크루즈에 (IV) 단계로 진행. 단계 (VI) 그 다음에 챔버를받은 열린 공간을 탐험하고,하는 단계 (V)에 microchannel, 셀 수익의 끝에서. microchannel에서 마이그레이션 전력은 대부분,도 4에 도시 된 바와 같이 활동을 blebbing하여 amoeboid cel과 비슷 생성리터. 셀 blebbing와 막 변형이 완전히 여기에 기록됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 마이크로 유체 장치의 제조의 설계도. 전체 과정은 소프트 리소그래피의 수정 기술을 통해 3 인치 실리콘 핸들 웨이퍼에 수행됩니다. 3 μm 높이 microchannels 및 정렬 마커는 첫 번째 레이어로 구성되어 있습니다. 정렬 마커는 스카치 테이프로 가득하는 동안 다음 250 μm 두께 스와-8은 나중에 두꺼운 포토 레지스트에 의해 시력을 차단하지 않고 aligner를 마스크에 액세스 할 수 있습니다 것과 같은, 스핀 - 코팅입니다. 따라서, 챔버 기능은 두 번째 레이어로 만들 수하고 정확하게 첫 번째 레이어에 정렬. PDMS 스탬프는 결국 결과 마스터를 성형하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 장치 어셈블리 및 세포 심는 과정의 설계도. PDMS와 GL에 의해 둘러싸여엉덩이 coverslip은 3D 배양 공간이 챔버, 저수지 및 microchannels로 구성되어 있습니다. 수신 챔버가 처음 셀 - 무료 미디어로 가득되는 동안 시딩 챔버는 세포 배양으로 가득합니다. 그들 사이에 연결 microchannels는 측면을받는에 심는 측에서 셀 마이그레이션 길을 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig3.jpg" alt="그림 3" /> microchannel을 통해 그림 3. BTSC 마이그레이션. 어퍼 : 시간 ​​경과의 스냅 샷은 하나의 셀 (녹색으로 강조 표시) 시딩 측에서 수신 측에 400 μm를 통해 마이그레이션을 보여줍니다. 전체 여행은 세포 형태학의 변경 순서를 포함, 약 2 일이 소요됩니다. 규모 바는 40 μm이다. 밑으로 여섯 가지 마이그레이션 단계의 만화 표현합니다. 사전 마이그레이션는 (i) : 시딩 챔버에서 스핀들 - 모양 dividable 세포는 점차 서로 함께 마이그레이션. 전지 본체 및 전자 편광으로 서로 microchannel 입학 경주 근처에있는 세포<html> lamellipodia의 돌출부를 xerting. 가입 (II) : 경쟁이 후퇴하는 동안 최고 용량과 철새 셀 채널 입구에 자리 잡고 있습니다. 경로 - 탐구 (III) : 약간의 극성과 amoeboid 모드로 철새 셀 변경됩니다. 이 마이그레이션 모드는 매우 운동성 작은 ​​막 돌출부를 blebbing하여 모든 방향으로 경로를 탐색 할 수 있습니다. 크루즈 (IV) : 마이그레이션 경로가 결정되면, 세포 앞으로 제목 추가 큰 돌출부를 유지하여 적응 amoeboid 모드로 변환합니다. 이 방법은 셀은 높은 운동성뿐만 아니라 지속적으로 방향과 속도를지지. 대상 - 탐색 (V) : 경로 엔드시, 셀은 속도가 느려 및 공격 대상에 대한 수신 챔버를 둘러 filopodias을 개발하고 있습니다. 후 마이그레이션 (VI) : 수신 챔버를 입력 한 후 셀은 별 모양으로 변하기 높은 운동성 있지만 결정 방향을 유지합니다. &quot;/&gt; . (AB) : 시간 경과의 그림 4 스냅 샷은 BTSC의 활동과 막 변형을 blebbing의 사이클을 보여줍니다. 개시 (BD). 확장 (DF). 철회. 화살표와 곡선 - 라인 방향과 막 변형의 위치, 각각을 나타냅니다. 스냅 샷은 모든 팔초를 수집하고 있습니다.

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여기에 제시된 마이크로 유체 장치와 이미지 레코딩 기술은 마이그레이션하는 동안 세포 형태의 시각적 특성 수 있습니다. 기존의 기존의 방법에 비해, 마이크로 유체 플랫폼은 비용 효율성, 높은 처리량 및 설계 유연성의 장점을 제공합니다. 제시 미세 시각화 시스템은 장기 라이브 세포 이주의 연구와 기록을 할 수 있습니다. 렌즈 모터 기능은 샘플을 방해하지 않으면 서 이미지 해상도가 높은 여러 마이그레이션 경로를 추적 할 수있게. 장치의 조립 동안 PDMS 스탬프은 비 영구적으로 PDL 코팅의 편의 (단계 3.4)의 유리 coverslip에 접착합니다. 그것은이 프로토콜의 성공을 위해 좋은 인감를 달성하는 것이 중요합니다. 예를 기판에 도장이나 먼지 / 파편에 기포와 같은 장치 제조,에서 도입 오염 누출 유체의 결합과 결과를 위태롭게 할 수 있습니다. 따라서, treatiNG는 먼지없는 방식으로 장치는 장치 실패를 방지하는 것이 중요합니다. 이전 PDL 코팅에, 유리 coverslips는 질산이 취급하고 PDL 솔루션은 먼지 / 파편을 제거하기 위해 centrifuged 있습니다. 클린 룸에 액세스 할 수없는 경우 우리는, 알코올 린스, 스카치 테이프를 찾고, PDMS 스탬프의 먼지 / 이물질 제거에 물통 매우 도움이. PDMS 스탬프가 유리 coverslip과 접촉 한 후 핀셋으로 부드럽게 우표를 활용하면 인감을 용이하게한다. BTSCs은 10 정상적인 신경 줄기 세포의 문화와 비슷한 줄기 세포 매체의 영역 문화를 통해 인간의 운영 객실 표본에서 풍부하게 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 풍부한 BTSCs는 줄기 세포 마커의 표현 (CD133, nestin), 여러 신경 lineages (glial 및 neuronal)에 차별화, 100처럼 몇과 orthotopic immunodeficient 마우스 모델에서 종양 개시 등의 줄기 세포와 같은 속성을 보여줍니다 세포 18. 일부 논쟁이 purifi에 대해 존재하지만양이온과 BTSCs 1 19-21의 정비, 영역 자체 BTSCs 더 부모 종양 22-24의 표현형 및 유전자형을 유지합니다. compartmentalized 공간은 셀 마이그레이션에 대한 생리적 환경을 모방 한 것이 었지요. 우리 장비에서 BTSC 세포 형태를 조절하여 크기 제약이 공간을 통해 이전의 강한 능력을 나타냅니다. 세포 형태학의 변화 우리의 특성은 인접한 뇌의 BTSC 침략의 가능한 새로운 자세한 설명을 모델링 할 수 있습니다 여섯 단계 순서 모드 - 변환을 나타냅니다. 초기 단계에서 전지 극성의 상당한 금액을 얻을 수 있으며 효율적으로 microchannel 내부에 자신을 고정 접착제 돌출부를 생성합니다. microchannel에서 셀 수용 인원이 이루어지면, 그것은 주행 모드로 변환하고 microchannel을 통해 전체 여행을 위해이 모드를 유지합니다. 이 단계에서, BTSC 높은 운동성하고 일관된 방향을 유지하지만, 에너지를 절약. 에terestingly, 그것은 microchannel 하나 그러한 한 번에 하나의 크루즈 세포로 제한되어 나타나면이 단계에 단세포 진행, microchannel에서 다른 세포의 휴양지. 이 메커니즘은 가능성이 확산 종양의 효율성을 보장하고 microchannel에 영양 overconsumption을 방지합니다. microchannel에서 마이그레이션을 완료 한 후, 셀 multidirectional 돌출부와 공격 대상 또는 새 마이그레이션 경로에 대한 자세한 탐사의 성향에 회복합니다. compartmentalizing 마이크로 유체 장치는 체외에서 소설은 뇌 실질의 BTSC 침투를 공부에 microenvironment을 만드는 것을 의미합니다. 이 방법은 쉽게 암 줄기 세포 (CSC) 및 기타 종양 유형에서 파생 된 철새 세포 라인의 연구에 적용 할 수 있습니다. 마이크로 유체 장치에서 배양 세포는 보육 및 조직 문화 전문 지식을 갖추고 있습니다 모든 현대 생물학 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 스와-8 마스터, PDMS가 장착주조 및 장치 조립은 부드러운 리소그래피의 일부 기본 훈련 가능합니다. 또한이 플랫폼은 또한 그라데이션 믹서, 표면 패터닝, 유체 제어 및 microelectrode과 같은 다른 기능 모듈을 통합으로 다른 응용 프로그램 연장 될 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM), 높은 혈당 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11,965 </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> 햄의 F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31,765 </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> B27 보충 마이너스 비타민 A </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> 항생제 - Antimycotic (PSA) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15,240 </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> 표피 성장 인자 (EGF), 인간 재조합 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0313 &lt;/ TD&gt; <td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF), 인간 재조합 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0021 </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> 돼지의 장 점막에서 헤파린 나트륨 소금, </td><td> 시그마 </td><td> H1027-250KU </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> Laminin (천연 마우스) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td> 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC) 문화 용품 </td></tr><tr><td> 셀 매체를 줄기 </td><td></td><td></td><td><ul><li> 30% 햄 F12 </li><li> 70% DMEM </li><li> 1퍼센트 항생제 - antimycotic </li><li> 비타민 A가없는 2퍼센트 B27 </li><li> EGF (20 NG / ML)와 bFGF / 헤파린 (20 NG/ ML bFGF, 5 MG / ML 헤파린) 믹스 재료 및 사용 전에 무균 필터 </li></ul></td></tr><tr><td> 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) / 헤파린 </td><td></td><td></td><td><ul><li> 나누어지는 농도 20 μg / ML </li><li> 25 μg의 경우 : 25 μg의 bFGF에 5mg/mL 헤파린의 1.25 ML을 추가합니다. </li><li> 250 μg의 경우 : 250 μg의 bFGF에 1 ML 5mg/mL의 헤파린을 추가합니다. 원뿔형 15 ML에 갈아 원추형으로 11.5 ML 5 MG / ML 헤파린을 추가합니다. </li><li> -80에서 50 μl 또는 250 μl aliquots ° C.로 저장 </li></ul></td></tr><tr><td> 표피 성장 인자 (EGF) </td><td></td><td></td><td><ul><li> 나누어지는 농도 20 μg / ML </li><li> 200 μg의 경우 : 200 μg의 EGF에 1 ML 멸균 DMEM (Gibco 11965-118)을 추가합니다. 15 ML 원뿔으로 갈아과 9 ML DMEM을 추가합니다. </li><li> 500 μg의 경우 : 200 μg의 EGF에 1 ML 멸균 DMEM (Gibco 11965-118)을 추가합니다. 50 ML 원뿔으로 갈아과 24 ML DMEM을 추가합니다. <li> 50 &amp; 무로 저장, L 또는 -80 250 μl aliquots ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td></td><td></td><td><ul><li> 나누어지는 농도 5 MG / ML </li><li> 100 MG의 헤파린을 무게. </li><li> 20 ML (70 %) DMEM-(30 %) F12-(1 %) PS​​A (14 ML DMEM, 6 ML F12, 200 μL PSA)에 100 MG의 헤파린을 추가 </li><li> 살균 필터 </li><li> -80 ° C에서 50 μl 또는 250 μl aliquots로 저장 </li></ul></td></tr><tr><td> 스와-8 포토 레지스트 </td><td> MicroChem </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 핸들 웨이퍼 </td><td> WRS 자료 </td><td> 3P01-5SSP - 인보이스 </td><td></td></tr><tr><td> trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 448931 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS Sylgard 184 </td><td> 다우 코닝 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> laminin </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td> 50 μg /최종 농도에 대한 PBS 버퍼에 ML </td></tr><tr><td> Biostation IM </td><td> 니콘 악기 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging

지난 40 년 동안 미국은 사망률 만 5 % 감소의 결과로, 암 연구에 억 200여 달러를 투자했습니다. 환자 결과를 개선하기위한 주요 장애물은 공격적인 암 세포 침입, 전이 및 치료 저항 1과 관련된 세포의 이주를 근간 메커니즘의 가난한 이해입니다. Glioblastoma Multiforme (GBM), 가장 널리 주요 악성 성인 뇌 종양이이 어려움을 예시. 표준 수술, 방사선 및 chemotherapies에도 불구하고, 환자의 평균 생존은 인접한 뇌 및 신속한 암 재발이에 적극적인 GBM의 침투로 인해 만 십오개월입니다. 비정상 세포 철새 메커니즘과 종양 microenvironment의 상호 작용 가능성이 세 정상 세포에서 암을 차별화. 따라서, GBM에 대한 치료 방법을 개선하는 것은 암 세포 이주 메커니즘에 대한 이해를 필요로합니다. 최근 작품 THA 제안GBM 내에서 세포의 타 작은 subpopulation, 뇌 종양의 줄기 세포 (BTSC)는 치료 저항 및 재발에 대한 책임 수 있습니다. BTSC 철새 용량의 근간이 메커니즘은 특징 1,4로 시작합니다. 육안 검사 및 기하학적 조작, 기존의 마이그레이션 assays 5 제한으로 인해 전체 세포 인구를 정량화으로 제한됩니다. 반면, 마이크로 유체 장치 때문에 현대적인 현미경과 미세 환경에 6-9 제어와의 호환성의 단일 세포 분석을 허용합니다. 우리는 compartmentalizing 마이크로 유체 장치를 사용하여 BTSC 마이그레이션에 대한 자세한 특성화를위한 방법을 제시한다. 이 PDMS 만든 장치는 세 연결된 구획에 조직 배양 환경을 캐스팅 : 챔버을 퍼 뜨리고 챔버을 받고 microchannels를 연결. 우리 둘 다 방 4-5 다에 대해 가능한 BTSC을 지원하기 위해 충분한 미디어를 개최하는 등의 장치를 맞는미디어 교환없이 YS. 처음 심는 챔버 내로 유입이 높은 모바일 BTSCs는 병렬 수신 챔버에 microchannels를 연결하지만 마이그레이션 후 절연되어 있습니다. 이 마이그레이션은 뇌의 중간 공간을 통해 암 세포의 확산을 시뮬레이션한다. 마이그레이션하는 동안 세포 형태학의 위상 라이브 이미지는 며칠 동안 기록됩니다. 높은 철새 BTSC 따라서, recultured 격리되고, 더 분석 할 수 있습니다. Compartmentalizing microfluidics는 BTSCs 및 기타 암 줄기 세포의 이동 동작을 연구 할 수있는 다양한 플랫폼이 될 수 있습니다. 기울기 발전기, 유체 취급, 마이크로 전극 및 기타 비유동 모듈을 결합하여 이러한 장치는 약물 검사 및 질병 진단 6 사용하실 수 있습니다. 철새 세포의 공격적인 subpopulation의 절연은 분자 메커니즘의 기초 연구를 수있게 될 것입니다.

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Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

암 줄기 세포 이주를 조사하기위한 compartmentalizing 마이크로 유체 장치가 설명되어 있습니다. 이 소설 플랫폼은 가능한 세포 microenvironment를 생성 및 라이브 세포 운동의 미세 시각화 할 수 있습니다. 높은 운동성 암 세포는 잠재적으로보다 효과적인 미래의 치료로 이어지는 공격적인 침투 분자 메커니즘을 공부 절연되어 있습니다.

Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

evaluation-cancer-stem-cell-migration-using-compartmentalizing

Research

JoVE Journal

Medicine

25.2K 조회수.  University of Wisconsin-Madison. 암 줄기 세포 이주를 조사하기위한 compartmentalizing 마이크로 유체 장치가 설명되어 있습니다. 이 소설 플랫폼은 가능한 세포 microenvironment를 생성 및 라이브 세포 운동의 미세 시각화 할 수 있습니다. 높은 운동성 암 세포는 잠재적으로보다 효과적인 미래의 치료로 이어지는 공격적인 침투 분자 메커니즘을 공부 절연되어 있습니다.

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

연구

의학

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

정렬 줄기 세포 Assays 및 흐름에 대한 기본 뇌 종양 조직의 처리

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

In organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is indispensable for proper physiological function, and the formation and maintenance of these structures is a highly regulated process. The analysis of these complex, 3-dimensional structures has greatly depended on either 2-dimensional examination in section or on dye injection studies. These techniques, however, are not able to provide a complete and quantifiable representation of the ductal or vascular structures they are intended to elucidate. Alternatively, the nature of 3-dimensional plastic resin casts generates a permanent snapshot of the system and is a novel and widely useful technique for visualizing and quantifying 3-dimensional structures and networks.
A crucial advantage of the resin casting system is the ability to determine the intact and connected, or communicating, structure of a blood vessel or duct. The structure of vascular and ductal networks are crucial for organ function, and this technique has the potential to aid study of vascular and ductal networks in several ways. Resin casting may be used to analyze normal morphology and functional architecture of a luminal structure, identify developmental morphogenetic changes, and uncover morphological differences in tissue architecture between normal and disease states. Previous work has utilized resin casting to study, for example, architectural and functional defects within the mouse intrahepatic bile duct system that were not reflected in 2-dimensional analysis of the structure1,2, alterations in brain vasculature of a Alzheimer's disease mouse model3, portal vein abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic mice4, developmental steps in rat lymphatic maturation between immature and adult lungs5, immediate microvascular changes in the rat liver, pancreas, and kidney in response in to chemical injury6.
Here we present a method of generating a 3-dimensional resin cast of a mouse vascular or ductal network, focusing specifically on the portal vein and intrahepatic bile duct. These casts can be visualized by clearing or macerating the tissue and can then be analyzed. This technique can be applied to virtually any vascular or ductal system and would be directly applicable to any study inquiring into the development, function, maintenance, or injury of a 3-dimensional ductal or vascular structure.

A method of visualizing and quantifying the 3-dimensional structure of mouse hepatic portal vein or intrahepatic bile duct is described. This resin cast technique can also be applied to other ductal or vascular systems and allows for in situ visualization or quantification of a system's intact communicating architecture.

3 차원 수지 주조 및 마우스 포털 정맥 또는 Intrahepatic의 담즙 덕트 시스템의 이미징

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

인간 세포주에서 Chemoresistant 난소 암 줄기 세포에 대한 심화 학습

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.