PAC è parzialmente sostenuto da una sovvenzione del NIH T32 a Università degli Studi di cellule staminali di formazione Wisconsin (PA Clark). JSK è stato in parte sostenuto dalla cattedra Headrush Brain Research Tumor, Roger Loff Memorial GBM Fondo di ricerca, e la Fondazione UW / Brain Research Neurochirurgia del tumore e Education Fund. JCW e YH sono parzialmente supportati dalla sovvenzione del NIH NIBIB 1R01EB009103-01.

1. Cella BTSC di dissociazione BTSCs sono derivati ​​da preesistenti colture coltivate in terreno privo di siero cellule staminali come neurosfere. cultura di cui è descritto in precedenza 10, 11. <ol><li> Preparare sospensione di cellule derivate da BTSC neurosfere. BTSC derivati ​​neurosfere sono raccolti in una provetta conica da 15 ml e centrifugati a 900 rpm per 5 minuti. Più veloce centrifugazione può taglio e / o danneggiare il neurosfere. Supernatante viene aspirato e cultura neurosfere viene risospeso in 0,5 ml di pre-riscaldato Accutase. Questa soluzione è incubata per 5-10 minuti a 37 ° C consentendo alle neurosfere per allentare. Le cellule sono meccanicamente perturbato con 10-20 movimenti delicati di una pipetta P100 e poi 1,5 ml di mezzo sulle cellule staminali è aggiunto alle cellule di neutralizzare l&#39;Accutase. </li><li> Le BTSCs viene poi centrifugato a 1300 rpm per 5 minuti e risospese in 1 ml di mezzo di cellule staminali. </li><li> A 50 microlitri aliquota viene rimosso dalle suspension e posta in una provetta da microcentrifuga per la conta cellulare. 50 pl di trypan blu viene aggiunto alla provetta Eppendorf e la sospensione viene posto in un emocitometro per la conta cellulare. </li><li> Se richiesto dopo il conteggio delle cellule, cellule staminali ulteriore mezzo viene aggiunto alla sospensione BTSC dare una densità cellulare di 20.000 cellule vive / media pl. </li></ol> 2. Fabbricazione di bi-strati SU-8 master e stampaggio di timbro PDMS (vedi figura 1) Usiamo litografia ottica e litografia morbida per fabbricare SU-8 master e PDMS timbro, che sono essenziali per il montaggio dei dispositivi microfluidici. Leggermente diversa rispetto alla procedura standard 12, la SU-8 master è composto da due strati. Le 3-micron-alte microcanali sono fusi nel primo / basso livello precoce del processo, mentre i 250 micron-alte camere di semina e la ricezione sono nel secondo strato / superiore. Al fine di un corretto collegamento tra due compartimenti coltura (microcanalis e camere), i due strati devono essere accuratamente allineati in posizione. Tuttavia, lo spessore e l&#39;opacità del secondo strato sono grandi abbastanza per bloccare il fiducial / ottica allineatore di accedere alle caratteristiche del fondale. Qui progettiamo le maschere con marker fiduciali in remoto posizionato. Così, questi marcatori nel primo strato può essere selettivamente schermati, mentre gira il secondo strato. Come risultato, entrambi gli strati di caratteristiche sono realizzati in un master e pronto per lo stampaggio in bassorilievo del timbro PDMS. <ol><li> Progettare e preparare due foto-maschere. Una maschera consiste di due marker fiduciali e una serie di microcanali (400 micron di lunghezza e 10-50 micron di larghezza) per il primo strato. Un&#39;altra maschera consiste di semina e ricezione camere (2 mm di lunghezza e 600 micron di larghezza) per il secondo strato. Entrambe le maschere sono state progettate in Illustrator (Adobe, California), laser stampato su lucidi (parti metalliche sottili, Colorado), puliti con isopropanolo e aria secca. </li><li> Fare il primo strato conSU-8 photoresist (MicroChem, Massachusetts) in base al manuale del prodotto dal fornitore. Primo, spin-coat wafer maniglia (Materiali WRS, California) con 3-micron di spessore di photoresist SU-8 (5), seguito da soft-cottura. Il photoresist è quindi ultravioletta-esposta e curata con la maschera corrispondente in stretto contatto, seguito da post-cottura e di sviluppo. </li><li> Spin-coat il secondo strato di 250 micron di spessore su-8 (2100). Per evitare photoresist di spessore da bloccare i marker fiduciali dal primo strato, copriamo queste aree con nastro adesivo nella prima spin-coating del secondo strato. Il nastro viene poi staccata per rivelare i marcatori per scopo l&#39;allineamento. </li><li> UV-esporre il secondo strato con la seconda maschera. Con i segni di allineamento ha rivelato, è semplice per allinearli a quelli della seconda maschera con allineatore ottico maschera. Il secondo strato di fotoresist viene quindi ultravioletta-esposta e curate in stretto contatto, seguito da post-cottura e sviluppo. &lt;/ Li&gt; <li> Anti-stick mano il master risultato. Per aiutare nella rimozione di PDMS indurito, il SU-8 master può essere silanizzate tramite deposizione di vapore per rendere la superficie di un rivestimento antiaderente tipo. Semplicemente posto in un essiccatore per almeno un&#39;ora, con alcune gocce di tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano soluzione sotto vuoto. </li><li> Mold PDMS con il master. Mix di base prepolimero e curatore di PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) in rapporto 10:1 accuratamente. Metterla in un essiccatore per degasaggio sotto vuoto fino a quando non bolla d&#39;aria si vede. Versare il composto sulla maschera e degassare ancora se nuova bolla d&#39;aria viene introdotta. Curare lo stampo su una piastra di livello per 2 ore a 90 C. Una volta raffreddata a temperatura ambiente, lentamente rilasciare il timbro PDMS. Così, i canali coltura sono incisi in PDMS e pronto per il montaggio del dispositivo. Il master è riutilizzabile per lo stampaggio fino a quando non è rotto o usurato. Il rivestimento antiaderente deve essere eseguita di nuovo quando la viscosità riacquista. </li></ol> 3.Assemblaggio dei dispositivi microfluidici e coltura cellulare (figura 2) Per cellule di coltura, caratteristica inciso timbro PDMS è attaccato ad un vetrino coprioggetto per formare canali chiusi. Ingressi e le uscite vengono creati per il caricamento della cultura / media. Nel frattempo, la pulizia e altre procedure per il substrato di vetro e il timbro PDMS sono necessarie per garantire la cellula-compatibilità. <ol><li> Fai serbatoi attraverso il timbro PDMS con perforatrice biopsia. Abbiamo scelto il loro diametro pari a 6 mm. Questi serbatoi servono per due scopi. Uno è quello di tenere nutriente supplementare per la crescita cellulare. L&#39;altro è per l&#39;accesso di carico pipetta e aspirazione a vuoto. </li><li> Immergere il timbro PDMS in 70% di etanolo per 30 minuti e poi risciacquate con acqua deionizzata per 10 min. Lo scopo è quello di eliminare eventuali residui organici introdotti durante il processo di fabbricazione, e non reticolato contaminazione PDMS. Processi di pulizia più intensa e profonda come l&#39;estrazione organica 13 </sup&gt; E l&#39;estrazione Soxhlet 14 sono stati utilizzati altrove. Tuttavia, abbiamo trovato inutile nella cultura BTSC. </li><li> Sterilizzare il timbro PDMS con autoclave (121 ° C, 35 min). Questo passaggio completa ulteriormente la reazione di reticolazione di PDMS. Partendo da questo punto e fino passo 3,6, tutte le procedure sono prese in modo sterile. </li><li> Il timbro PDMS, viene applicata su un vetrino di vetro, che viene preventivamente rivestito con poli-L-lisina. 15-17 Il dispositivo viene quindi rivestito con laminina riempiendo il canale con soluzione laminina notte a 37 ° C. Laminina viene aspirato dal dispositivo e il dispositivo viene lavato con supporto di cellule staminali. </li><li> Caricare sospensione cellulare dal punto 1 in serbatoi e canali. 11 microlitri di cellule dissociate sono collocati in un serbatoio semina. Aspirazione a vuoto viene utilizzato per forzare le cellule nella camera di semina, se necessario. Un ulteriore 7 microlitri di cellule sono collocati il ​​serbatoio adiacente semina. Nota: la densità delle cellule medio è di 20.000 cellule / media pl. A poppaer cinque minuti, la semina e serbatoi che ricevono sono inondati con i media. </li><li> Inserire un 0,5-1 mm pre-sterilizzato foglio PDMS sulla parte superiore. Il coefficiente di aderenza in natura si è verificato tra due pezzi PDMS farà la coltura cellulare sigillato e pronto per il trasporto, l&#39;incubazione e di imaging microscopico. </li></ol> 4. A lungo termine time-lapse imaging di BTSC migrazione con BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, USA). Combinando fotocamera, software e incubatore in un unico pacchetto, questo sistema microscopico permette di cultura dell&#39;immagine cella senza disturbo per giorni. Inoltre, il suo design unico motore sposta la lente obiettivo e mantiene fase stazionaria campione nel punto in visita funzione. Questo lo rende pratico per esperimenti immagine parallele e cellule locomozione traccia in saggio ad alta prestazione. <ol><li> Pre-equilibrare la IM Biostation per 45 minuti per stabilizzare la temperatura di mandata, l&#39;umidità e l&#39;aria. Aggiunta di diversi acqua-CONTpiatti ained in camera del campione viene utilizzato per mantenere l&#39;umidità adeguata. </li><li> Caricare il cellulare ad alimentazione nella camera campione di microscopio, e centrarlo con una pinzetta micro. </li><li> Impostare le posizioni di messa a fuoco, punti e tempo-punti nel software Biostation e avviare il time-lapse. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Esempi di ispezione visiva e caratterizzazione della migrazione delle cellule tumorali, utilizzando un dispositivo microfluidico compartimentazione sono illustrati nella Figura 3 e Figura 4. La cellula-line è BTSC. Con la nostra configurazione attuale, immagini fase di coltura cellulare può essere registrata in continuo per il tempo 5 giorni (Figura 3) e frequente come ogni 2 secondi (Figura 4). 5 giorni solo, terreni di coltura devono essere sostituiti per il rifornimento dei nutrienti e rifiuti rimossi. La nostra lunga time-lapse identifica una sequenza di rotazione di sei fasi cellulari durante la sua migrazione in base ai cambiamenti morfologici. Come illustrati nella figura 3, li descrivono come (i) pre-migrazione, (ii) l&#39;iniziazione, (iii) percorso di esplorazione, (iv) di crociera, (v)-destinazione exloration e (vi) post-migrazione. Nella camera di ricezione, cellule fusiformi rimanere nello stadio (i), come nei tumori sfusi che sono in grado di crescere, dividere e migrano gradualmente. Mentre si avvicinano all&#39;entrata microcanali, alcune cellule procedere alla fase (ii) quando si espandono e generano protrusione adesivo. Solo uno di essi è in grado di occupare l&#39;ingresso e procedere alla fase (iii), che può esplorare la direzione di migrazione. Una volta che la cella determina la direzione di migrazione, si procede alla fase (iv) per crociera attraverso il microcanale in una velocità costante ed elevata, che viene effettuata attraverso l&#39;intera microcanali. Alla fine di microcanali, procede cellule allo stadio (v) per esplorare lo spazio aperto della camera di ricevimento, e quindi alla fase (vi). A microcanali, potenza migrazione è principalmente generata da blebbing attività come illustrato in figura 4, simile a quella di ameboide cell. Blebbing cellulare e deformazione della membrana sono registrati integralmente qui. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Schema di fabbricazione del dispositivo microfluidica. L&#39;intero processo viene eseguito su un 3-inch wafer di silicio manico attraverso una tecnica modificata di litografia morbida. 3-micron-alti microcanali e marcatori di allineamento sono come nel primo strato. Poi 250-micron di spessore su-8 è spin-rivestito, mentre i segni di allineamento sono coperti con nastro adesivo, in modo tale che essi possono poi essere accessibile a mascherare allineatore senza vista-blocco da photoresist di spessore. Pertanto, le caratteristiche della camera può essere fatto come secondo strato e accuratamente allineato al primo strato. Timbro PDMS viene infine stampato fuori il maestro risultante. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Schema di montaggio del dispositivo e semina processo cellulare. Circondata da PDMS e glcoprioggetto culo, lo spazio di coltura 3D è composto da camere, serbatoi e microcanali. La camera di semina è riempito con colture cellulari, mentre la camera di ricezione è inizialmente riempito con cellule libere media. I microcanali che collegano tra di loro fornire sentiero cella migrazione da parte semina a lato per ricevere. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. BTSC migrazione attraverso microcanali. Tomaia: istantanee di time-lapse mostra una singola cella (evidenziato in verde) migra oltre 400 micron dal lato semina al lato ricevente. L&#39;intero percorso è di circa 2 giorni, che coinvolge una serie di cambiamenti morfologici delle cellule. La barra della scala è di 40 micron. Bassa: una rappresentazione del fumetto di sei fasi di migrazione. Pre-migrazione (i): In camera di semina, le cellule fusiformi e divisibile gradualmente migrare lungo l&#39;altro. Le cellule vicino race ingresso microcanali con l&#39;altro di polarizzazione corpo cellulare e e<html> xerting sporgenza lamellipodi. Apertura (ii): La cella migratorio con la maggiore capacità occupa l&#39;ingresso del canale mentre i suoi concorrenti si ritirerà. Path-esplorazione (iii): Le alterazioni cellulari migratori verso una modalità ameboide con polarità poco. Questa modalità di migrazione è estremamente mobili e capaci di esplorare percorso in tutte le direzioni da blebbing piccole sporgenze membrana. Crociera (iv): Una volta che il percorso di migrazione è determinato, la cellula si trasforma in una modalità ameboide adattato mantenendo una sporgenza complementare intestazione grande avanti. In questo modo, sostiene una motilità cellulare elevata nonché una direzione e velocità costante. Destinazione-esplorazione (v): Al percorso-end, il cellulare rallenta e si sviluppa filopodias per esplorare la camera di ricezione per qualsiasi destinazione invasione. Post-migrazione (vi): Dopo essere entrati nella camera ricevente, si trasforma in cellula a forma di stella e mantiene alta la motilità, ma senza una direzione determinata. &quot;/&gt; . Istantanee Figura 4 su time-lapse mostrano il ciclo di blebbing deformazione attività e membrana di un BTSC: (AB). iniziazione; (BD). Espansione; (DF). Svincolo. Le frecce e la curva-linee rappresentano la direzione e la posizione della deformazione della membrana, rispettivamente. Le istantanee vengono raccolti ogni 8 secondi.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il dispositivo microfluidico e registrazione dell&#39;immagine tecnica qui presentata consente una caratterizzazione visiva di morfologia cellulare durante la migrazione. Rispetto ai metodi convenzionali esistenti, la piattaforma microfluidica offre vantaggi di costo-efficacia, ad alta velocità e flessibilità di progettazione. Il sistema presentato permette visualizzazione microscopica studio e registrazione di lungo termine migrazione cellulare vivo. L&#39;obiettivo motorizzato funzione consente di monitorare i percorsi di migrazione più in una immagine ad alta risoluzione senza disturbare il campione. Durante l&#39;assemblaggio del dispositivo, il timbro PDMS è non permanentemente legato alla coprioggetto per la comodità di rivestimento PDL (passo 3.4). E &#39;fondamentale per ottenere una buona tenuta per il successo di questo protocollo. Contaminazione introdotta dalla fabbricazione del dispositivo, quali bolle d&#39;aria nella timbro o polvere / detriti sul substrato, può compromettere il legame e causare fuoriuscita di liquido. Pertanto, TREATIng il dispositivo in un locale senza polvere modo è importante per evitare guasti al dispositivo. Prima della PDL-coating, i vetrini sono acido nitrico e la soluzione trattata PDL viene centrifugata per eliminare la polvere / detriti. Troviamo scotch, alcool risciacquo, e bagno di acqua molto utile nella rimozione di polvere / detriti dal timbro PDMS, se una camera pulita non è accessibile. Dopo il timbro PDMS in contatto con il coprioggetto di vetro, toccando il timbro delicatamente con una pinzetta facilita la tenuta. BTSCs può essere arricchito da campioni umani sala operatoria attraverso la cultura sfera nel mezzo delle cellule staminali, simile alla cultura delle normali cellule staminali neurali 10. BTSCs arricchiti in questo modo dimostrano di cellule staminali proprietà simili, come ad esempio l&#39;espressione di marcatori di cellule staminali (CD133, nestina), la differenziazione a più linee neurali (gliale e neuronale), e l&#39;iniziazione tumorale in un modello di topo ortotopico immunodeficienti con un minimo di 100 cellule 18. Anche se alcuni dibattito esiste riguardo depurazionezione e manutenzione di BTSCs 1, 19-21, sfera coltivate BTSCs meglio mantenere il fenotipo e genotipo del tumore parentale 22-24. Lo spazio compartmentalized riproduce l&#39;ambiente fisiologico per la migrazione cellulare. Nel nostro dispositivo, BTSC mostrano una forte capacità di migrazione attraverso una dimensione spazio-vincolata regolando morfologia cellulare. La caratterizzazione dei cambiamenti morfologici delle cellule indica la modalità-trasformazioni in una sequenza fase sei che possono modellare un eventuale nuova descrizione dettagliata di invasione BTSC del cervello adiacenti. Nelle prime fasi, le cellule guadagnare una quantità significativa di polarità e generare sporgenze adesive efficacemente si ancorano all&#39;interno del microcanale. Una volta che l&#39;occupazione cella nella microcanale è stabilito, lo converte in una modalità crociera e mantiene questo modo per tutto il percorso attraverso un microcanali. In questa fase, BTSC mantenere alta la motilità e la direzione coerente, ma risparmiare energia. Interestingly, sembra che uno microcanale è limitato a una cella crociera alla volta, in modo che quando una cella singola procede a questa fase, altre cellule ritirata dal microcanali. Questo meccanismo garantisce probabile efficacia di tumore impedisce la diffusione e consumo eccessivo di sostanze nutritive in microcanali. Dopo aver completato la migrazione attraverso il microcanali, una cellula ritrova la sua propensione per le sporgenze multidirezionali e un&#39;ulteriore esplorazione per gli obiettivi di invasione o di nuovi percorsi di migrazione. Il dispositivo di compartimentazione microfluidica offre un romanzo in vitro mezzi di creare un microambiente per studiare BTSC infiltrazione del parenchima cerebrale. Questo metodo può essere facilmente adattato per lo studio delle cellule staminali del cancro (CSC) e linee cellulari derivate da migratori altri tipi di tumore. Coltura di cellule nel dispositivo microfluidico può essere eseguita in qualsiasi laboratorio biologia moderna che è dotato di un incubatore e coltura tissutale competenze. Dotato di un su-8 master, PDMScasting e montaggio del dispositivo sono realizzabili con una formazione fondamentale nella litografia soft. Inoltre, questa piattaforma può anche essere esteso per altre applicazioni con integrazione di altri moduli funzionali come mixer gradiente, patterning superficie, controllo dei fluidi e microelettrodo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Mezzo di Dulbecco Eagle modificato (DMEM), glucosio </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Cervello di cellule staminali tumorali (BTSC) forniture cultura </td></tr><tr><td> Ham F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31765 </td><td> Cervello di cellule staminali tumorali (BTSC) forniture cultura </td></tr><tr><td> B27 supplemento minus vitamina A </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td> Cervello di cellule staminali tumorali (BTSC) forniture cultura </td></tr><tr><td> Antibiotico-antimicotica (PSA) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15240 </td><td> Cervello di cellule staminali tumorali (BTSC) forniture cultura </td></tr><tr><td> Fattore di crescita epidermico (EGF), ricombinante umano </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0313 &lt;/ Td&gt; <td> Cervello di cellule staminali tumorali (BTSC) forniture cultura </td></tr><tr><td> basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), ricombinante umana </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0021 </td><td> Cervello di cellule staminali tumorali (BTSC) forniture cultura </td></tr><tr><td> Sale di sodio eparina, dalla mucosa intestinale suina </td><td> Sigma </td><td> H1027-250KU </td><td> Cervello di cellule staminali tumorali (BTSC) forniture cultura </td></tr><tr><td> Laminina (mouse naturale) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td> Cervello di cellule staminali tumorali (BTSC) forniture cultura </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td> Cervello di cellule staminali tumorali (BTSC) forniture cultura </td></tr><tr><td> Staminali media cella </td><td></td><td></td><td><ul><li> 30% Prosciutti F12 </li><li> 70% DMEM </li><li> 1% di antibiotico-antimicotico </li><li> 2% B27 senza vitamina A </li><li> EGF (20 ng / mL) e bFGF / eparina (20 ng/ Ml bFGF, 5 mg / ml di eparina) Mescolare gli ingredienti e il filtro sterili prima dell&#39;uso </li></ul></td></tr><tr><td> Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) / eparina </td><td></td><td></td><td><ul><li> Aliquotare concentrazione di 20 mg / ml </li><li> Per 25 mg: aggiungere 1,25 ml di eparina 5mg/ml a 25 mg bFGF. </li><li> Per 250 mcg: Aggiungere 1 ml di eparina 5mg/ml a 250 mg bFGF. Trasferimento a 15 mL conico e aggiungere 11,5 ml 5 mg / ml di eparina a conica. </li><li> Memorizza come 50 pl o pl 250 aliquote a -80 ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> Fattore di crescita epidermico (EGF) </td><td></td><td></td><td><ul><li> Aliquotare concentrazione di 20 mg / ml </li><li> Per 200 mg: aggiungere 1 ml sterile DMEM (Gibco 11965-118) a 200 mg FEG. Trasferimento a 15 ml conico e aggiungere 9 ml DMEM. </li><li> Per 500 mg: aggiungere 1 ml sterile DMEM (Gibco 11965-118) a 200 mg FEG. Trasferimento a 50 ml conica e aggiungere 24 ml DMEM. <li> Conservare il 50 &amp; mu, L o 250 pl aliquote a -80 ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> Eparina </td><td></td><td></td><td><ul><li> Aliquotare concentrazione 5 mg / ml </li><li> Pesare 100 mg di eparina. </li><li> Aggiungere 100 mg di eparina 20 mL (70%)-DMEM (30%) F12-(1%) PSA (14 ml DMEM, 6 mL F12, 200 ml PSA) </li><li> Filtro sterile </li><li> Memorizza come 50 pl o pl 250 aliquote a -80 ° C </li></ul></td></tr><tr><td> SU-8 fotoresist </td><td> MicroChem </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Silicon maniglia wafer </td><td> WRS Materiali </td><td> 3P01-5SSP-INV </td><td></td></tr><tr><td> tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448931 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS Sylgard 184 </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> laminina </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> 50 ug /ml in tampone PBS per la concentrazione finale </td></tr><tr><td> Biostation IM </td><td> Nikon Instruments </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging

Negli ultimi 40 anni, gli Stati Uniti hanno investito più di 200 miliardi di dollari per la ricerca sul cancro, causando solo una diminuzione del 5% del tasso di mortalità. Uno dei principali ostacoli per migliorare i risultati dei pazienti è la scarsa comprensione dei meccanismi alla base della migrazione cellulare associato a cellule di cancro aggressiva invasione, metastasi e la resistenza terapeutica 1. Glioblastoma Multiforme (GBM), la più diffusa maligno primitivo tumore al cervello adulto 2, esemplifica questa difficoltà. Nonostante standard di chirurgia, radioterapia e chemioterapia, il paziente sopravvivenza media è di soli quindici mesi, a causa di infiltrazioni GBM aggressiva nel cervello adiacente e recidiva tumorale rapida 2. Le interazioni di meccanismi cellulari aberranti migratori e il microambiente tumorale probabile differenziare il cancro dalle cellule normali 3. Pertanto, migliorando approcci terapeutici per GBM richiedono una migliore comprensione dei meccanismi di migrazione di cellule tumorali. Un recente lavoro suggerisce thata piccola sottopopolazione di cellule all&#39;interno GBM, il tumore cerebrale cellule staminali (BTSC), può essere responsabile della resistenza terapeutica e recidiva. I meccanismi alla base BTSC capacità migratoria stanno solo cominciando a essere caratterizzati 1,4. A causa di una limitazione di ispezione visiva e la manipolazione geometrica, saggi di migrazione convenzionali 5 sono limitato a quantificare popolazioni cellulari in generale. Al contrario, i dispositivi microfluidici consentire l&#39;analisi singola cellula a causa della compatibilità con la microscopia moderna e il controllo micro-ambiente 6-9. Vi presentiamo un metodo per la caratterizzazione dettagliata della migrazione BTSC utilizzando compartimentare dispositivi microfluidici. Questi dispositivi PDMS-made lanciare l&#39;ambiente coltura di tessuti in tre compartimenti collegati: semina camera, camera di ricevimento e bridging microcanali. Abbiamo adattato il dispositivo in modo che entrambe le camere contengono supporti sufficienti per sostenere BTSC vitali per 4-5 days senza supporto di scambio. BTSCs altamente mobili inizialmente introdotti nella camera di semina sono isolati dopo la migrazione se bridging microcanali paralleli alla camera ricevente. Questa migrazione simula cancro diffusione cellulare attraverso gli spazi interstiziali del cervello. Le immagini di fase diretta di morfologia cellulare durante la migrazione sono registrati nell&#39;arco di diversi giorni. BTSC altamente migratorie può quindi essere isolato, recultured, e analizzato ulteriormente. Microfluidica compartimentazione può essere una piattaforma versatile per studiare il comportamento migratorio degli BTSCs e di altre cellule staminali del cancro. Grazie alla combinazione di generatori di pendenza, la gestione dei fluidi, micro-elettrodi e altri moduli di microfluidica, questi dispositivi possono essere utilizzati anche per lo screening di stupefacenti e la diagnosi delle malattie 6. Isolamento di una sottopopolazione di cellule migratorie aggressiva possono consentire lo studio di meccanismi molecolari alla base.

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Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

Dispositivo compartimentazione microfluidi staminali per studiare la migrazione delle cellule tumorali è descritto. Questa nuova piattaforma crea un microambiente vitale cellulare e consente la visualizzazione microscopica di locomozione cellule vive. Altamente mobili le cellule tumorali sono isolate per lo studio dei meccanismi molecolari di infiltrazione aggressivi, che possono portare a terapie più efficaci in futuro.

Valutazione della migrazione delle cellule staminali del cancro mediante compartimentazione dispositivi microfluidici e Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

25.2K Views.  University of Wisconsin-Madison. Dispositivo compartimentazione microfluidi staminali per studiare la migrazione delle cellule tumorali è descritto. Questa nuova piattaforma crea un microambiente vitale cellulare e consente la visualizzazione microscopica di locomozione cellule vive. Altamente mobili le cellule tumorali sono isolate per lo studio dei meccanismi molecolari di infiltrazione aggressivi, che possono portare a terapie più efficaci in futuro.

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Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modellazione e imaging 3-Dimensional Invasion cella Collettiva

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Ricerca

Medicina

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

Modelli per MAME 4D Live-Imaging cellule di tumore: Interazioni microambiente che Impact progressione maligna

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Lavorazione dei tessuti primaria tumore al cervello per saggi su cellule staminali e flusso di Ordinamento

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

In organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is indispensable for proper physiological function, and the formation and maintenance of these structures is a highly regulated process. The analysis of these complex, 3-dimensional structures has greatly depended on either 2-dimensional examination in section or on dye injection studies. These techniques, however, are not able to provide a complete and quantifiable representation of the ductal or vascular structures they are intended to elucidate. Alternatively, the nature of 3-dimensional plastic resin casts generates a permanent snapshot of the system and is a novel and widely useful technique for visualizing and quantifying 3-dimensional structures and networks.
A crucial advantage of the resin casting system is the ability to determine the intact and connected, or communicating, structure of a blood vessel or duct. The structure of vascular and ductal networks are crucial for organ function, and this technique has the potential to aid study of vascular and ductal networks in several ways. Resin casting may be used to analyze normal morphology and functional architecture of a luminal structure, identify developmental morphogenetic changes, and uncover morphological differences in tissue architecture between normal and disease states. Previous work has utilized resin casting to study, for example, architectural and functional defects within the mouse intrahepatic bile duct system that were not reflected in 2-dimensional analysis of the structure1,2, alterations in brain vasculature of a Alzheimer's disease mouse model3, portal vein abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic mice4, developmental steps in rat lymphatic maturation between immature and adult lungs5, immediate microvascular changes in the rat liver, pancreas, and kidney in response in to chemical injury6.
Here we present a method of generating a 3-dimensional resin cast of a mouse vascular or ductal network, focusing specifically on the portal vein and intrahepatic bile duct. These casts can be visualized by clearing or macerating the tissue and can then be analyzed. This technique can be applied to virtually any vascular or ductal system and would be directly applicable to any study inquiring into the development, function, maintenance, or injury of a 3-dimensional ductal or vascular structure.

A method of visualizing and quantifying the 3-dimensional structure of mouse hepatic portal vein or intrahepatic bile duct is described. This resin cast technique can also be applied to other ductal or vascular systems and allows for in situ visualization or quantification of a system's intact communicating architecture.

3-Dimensional Casting resina e imaging di Vena mouse portale o sistema biliare intraepatica Duct

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

Cella della morte associata a mitosi anomalo osservato da Imaging confocale in cellule vive di cancro

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Arricchimento per chemioresistente Ovarian Cancer Stem Cells da linee cellulari umane

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

La valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano Utilizzo multi e single cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.