Biz özellikle Monique Nenniger onun mükemmel teknik destek için Tosato yanı sıra Jean-Yves Chatton yaptığı bilimsel tavsiye ve mikroskop ekipman için UNIL görüntüleme CIF platformu için teşekkür etmek istiyorum. Finansman, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından sağlanmıştır.

1. Fare VNO diseksiyonu <ol><li> Erişkin farelerde kullanın. Feromon algılama multimodalities karışmış olduğundan, dikkatli suşlar genotipleri, cinsiyet ve yaş arasındaki ayrım önemlidir ve sonuçları etkileyecek. Burada, daha önce bir feromon-reseptör çift (2-heptanon-V1rb2) 31 (Şekil 1A) belirlenmesi için kullanılan yetişkin VG fareler 30 seçin. </li><li> NaCl 118 mM, NaHCO 3 25 mM, 10 mM D-Glikoz, KCl 2 mM, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1.2 mM CaCl 2, 2; diseksiyonu başlamadan önce, (ACSF taze soğuk yapay beyin-omurilik sıvısı hazırlamak mM; oxycarbon (% 95 O 2 ile doymuş pH 7.4):% 5 CO 2). Bunun için, CaCl 2 hariç tüm ACSF bileşenleri karıştırın. Doymuş ile doğrudan oxycarbon köpürme tarafından çözüm. Sonunda, CaCl 2 2 0 GKD ile istenilen hacim ayarlayabilirsiniz. U kadar buz üzerinde ACSF çözümü tutunse. </li><li> Fare Ötenazi tercihen deney hemen önce servikal dislokasyon veya CO 2 inhalasyon yoluyla yapılmalıdır. </li><li> Farenin kafasını kesin. Sürekli oxycarbonated soğuk ACSF bir diseksiyon mikroskobu altında yerleştirin. </li><li> Kesme alt çene ve damak (Şekil 1B) görselleştirmek için baş pozisyonu. </li><li> Mikro makas ile damağın üst kısmına (Şekil 1B) yatay bir kesi yapın ve mikro diseksiyon forseps ile damak membran kaldırmak. Hidrat ve ACSF (Şekil 1C) maruz boşluğuna temiz. </li><li> Üst Kes ve alt kısmında nazal septum (Şekil 1C). İncelikli VNO içeren burun septum özü ve buz (Şekil 1D) ACSF doğrudan yerleştirin. </li><li> Dikey mikro diseksiyon forseps kullanarak VNO iki parça ayırın ve ince VNO kıkırdak kapsül (kaldırmakŞekil 1E). Tüm kıkırdak parçalarını temizlendiğinden emin olun. </li></ol> 2. VNO doku dilim hazırlık Bu bölümde 2) açıklanan VNO doku dilim hazırlık ağırlıklı olarak kalsiyum görüntüleme araştırmalar için. VNO dilimleri de doku yapısal bütünlüğünü doğrulamak için protokol (Bölüm 3 e bakınız)) kayan dilimleri immunohistostainings için kullanılabilir. <ol><li> Düşük erime agar (standart PBS içinde% 3) ve çalışma ortamı hazırlayın. Kalıpları gömme ACSF, mikrotom ve destekler, mikro diseksiyon forseps gerekecektir (22 x 22 x 20 mm), hassas mendil, fırça, doku kültürü tabak, cyanacrylat tutkal, buz ve bir termometre. </li><li> % 3 düşük erime agar ile gömme kalıp doldurun. Sıcaklık 41 daha yüksek olduğunu emin olun ° C dikey koronal dilim elde edebilmek için kısa bir süre sildi VNO (Şekil 2A) yerleştirmeden önce. </li><li> Buz üzerinde gömme kalıp yerleştirin.katılaşma kadar sonra 1 dakika için agar blok ayrı. Agar bloğu bir piramit şeklinde kesin ve mikrotom destek (Şekil 2B) yapıştırıcı ile yerleştirin. </li><li> 0,5 mm / s, 0,7 mm genlik ve soğuk ACSF 100 mikron kalınlığında bir hız ile, mikrotom ile koronal VNO dilim kesin ve soğuk ile dolu bir doku kültürü plaka yerleştirmeden önce bir fırça ile doku dilimleri toplamak ACSF. </li><li> Eğer dilim GFP gibi endojen floresan (gen-hedefli nöron) içeren bir floresan stereomikroskopta (Şekil 2C) altında seçebilirsiniz. </li></ol> 3. VNO kayan dilimleri üzerinde İmmünohistokimya Bu prosedürün amacı, bölüm 2 elde VNO doku dilim) bütünlüğünü doğrulamak için. Asetillendirilmiş-tubulin VNO duyusal nöronların dendrit ve mikrovilluslar ifade mikrotübül / hücre iskeletinin işaretleyici. Kalsiyum görüntüleme deneyleri için, Direc gitmektly için protokol bölüm 4). Kayan VNO dilimleri immunohistostaining yöntem ilgi herhangi bir protein ifade değerlendirme adapte edilebilir. Bu amaçla, biz 4 1s VNO düzeltmek olduğunu ° C (PBS, pH 7.6 paraformaldehid,% 4), sabitleştirici bir çözüm noktası sonra 1.7) protokol ve kullanımı bu noktada PBS pH 7.6 &#39;daki yerine tavsiye ACSF çözüm. <ol><li> Doku kültürü plakası, sabitleştirici bir çözüm ilgi dilimleri (PBS, pH 7.6 paraformaldehid,% 4) 4 1s ° C düzeltmek </li><li> % 0,5 NGS (serum normal keçi)% 10 ve triton X-100 içeren bir PBS solüsyonunda 4 geceleme doku dilimleri ° C Blok. </li><li> 16h için oda sıcaklığında (RT)% 0.25 NGS% 5 ve Triton X-100 içeren bir PBS çözüm dilim primer antikor ile inkübe (anti-asetillenmiş-tubulin, Fare, 1:2000). </li><li> NGS% 2 içeren PBS çözeltisi ile 5 dakika boyunca 3 kere yıkayın. </li><li> Seco ile karanlıkta inkübeRT 1s için NGS% 2 içeren PBS çözüm ndary antikor (Cy5-konjuge keçi anti-Fare, 1:200). </li><li> NGS içeren PBS% 2 ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın, PBS,% 1 ve sadece PBS NGS. </li><li> Floresan montaj medya (DAPI içeren ya da değil), hidrofobik ayrılmış bölgeleri (hidrofobik bir kalem kullanın) merkezine yerleştirerek dilim Dağı ve lamelleri ile dilimlerini kapsayacak. </li><li> Konfokal mikroskopi ve 3D rekonstrüksiyonlar (Şekil 2D-F) sağlayan bir yazılım ile gözlem ve satın almalar olun. </li></ol> 4. VNO dilimleri Kalsiyum görüntüleme <ol><li> Aşağıdaki prosedürler karanlıkta yer alacaktır. 37 1s inkübe VNO dilim ° C ve soğuk ACSF Fura-02:00 (7 mcM DMSO 1 mM stok solüsyonu) ile oluşan bir yükleme çözümü pluronic% 0.1 (w / v% 20 oranında GKD 2 stok solüsyonu Ç). </li><li> Kullanana kadar oxycarbonation buz üzerinde yüklü dilim tutun. Yüklü dilimler için tutulabilir3-4h. </li><li> ACSF içeren bir perfüzyon odasında bir fırça ile yüklenen dilimleri yerleştirin ve bir doku dilim çapa (Şekil 3A) ile dilimleri korumak. </li><li> Bir kalsiyum görüntüleme mikroskobu (Şekil 3B) sahnede perfüzyon odasına yerleştirin ve sürekli RT oxycarbonated ACSF serpmek. Sıcaklık, iki kutuplu bir sıcaklık kontrolörü ile adapte edilebilir. </li><li> 25x veya 63x objektif ve CooL SNAP-HD kamera ile yüklü VNO dilimleri (Şekil 3C-E) Gözlemler, ters bir floresan mikroskop ile yapılır. Işık (340/380 nm) bir Polikromatör alet ile sırayla yapılır ve 5Hz bir oranda kaydedildi. Filtreli emisyonu 510 nm dalga boyunda yapılır. Hücre içi kalsiyum oranı değişiklikleri (mesafe kadar taşınmış = 340 nm/380 nm) uygun bir yazılım ile izlenmektedir. </li><li> Chemostimulation kendi deney amacına göre seçilmelidir. Burada, ACSF bir perfüzyonları içeren bir feromon mix (isobutylamine, 2 heptanon, 4 heptanon, 2 heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farnesen, 10 -6 M), 2-heptanon (10 -6 M) ya da taze (erkek ve dişi 1 toplanır : 1) fare idrar (1:100) 32 yapılmaktadır. ATP (125 mcM) Perfüzyon deneyler sonunda canlılığı testi olarak kullanılır (Şekil 3F) ve yaklaşık% 80 canlı nöronların oranı belirtmelidir. Bu koşullar altında, dilim 2 saat kadar kullanılmış olabilir. </li><li> Duyu nöronlarının GFP etiketli alt popülasyonlar özel aydınlatma (burada V1rb2 ifade nöronlar) ile görünür (Şekil 3G) tam olarak analiz edilebilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Çok transdüksiyon fare VNO yer alarak, ya da yeni feromon-reseptör çiftleri tespit etmek yolaklar araştırmak için fonksiyonel bir tahlil kurmak için, biz VG fare hattı (Şekil 1A yararlanmak </strong&gt;). Bu doğrultuda, 240 V1Rs reseptörlerin biri, V1Rb2 reseptör vomeronasal duyusal nöronlar belirli bir ICSI&#39;nin kolay görsellik sağlayan GFP etiketlenir. VNO (Şekil 1E) çıkarılması ve diseksiyon sonra, akut VNO dilimleri (Şekil 2C) hazırlar. Biz asetillenmiş tubulin protein (Şekil 2D-F) karşı immunohistostainings gerçekleştirerek hazırlık dokusal bütünlüğünü kontrol etmek ve doğrulamak için, bunların bir kısmını düzeltin. Dilim diğer fraksiyon, kalsiyum görüntüleme deneyleri için kullanılır. Bunun için, dilimler Fura-02:00 (Şekil 3C-E) ile yüklenir ve her bir nöronun hücre içi kalsiyum düzeyi bir mesafe kadar taşınmış oranı (Şekil 3F) olarak izlenir. Nöronların Canlılık mesafe kadar taşınmış oranının hızlı ve geçici bir artış beklenmektedir (Şekil 3F) sonra ATP (125 mcM), perfüzyon tarafından değerlendirilir . Feromonlar önemli bir kaynak olan idrar, taze perfüzyonly toplanan fare idrar (1:100) endojen bir kontrol olarak kullanılır. Bu kaydedilen nöron (hücre 1 ve 2, Şekil 3F) yaklaşık% 50 kalsiyum transientler tetikler. GFP aydınlatma altında, V1Rb2 pozitif nöron gözlemlenebilir ve bilinen pheromonal ligand, 2-heptanon, perfüzyon hücresel aktivasyonu (hücre 1, Şekil. 3I) başlatır. İlginçtir, nöronal aktivasyonlar VNO kodlama feromon karmaşıklığını gösteren V1Rb2 reseptör (GFP negatif nöronlar) (hücre 2, Şekil. 3I) ifade yoktur nöronların bir kısmı da gözlemlenebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" /> Şekil 1 fare vomeronasal organ Diseksiyon. (A), VG çizgi fare. (B), fare ötanazi sonra, damak görselleştirmek için tam bir baş binoküler mikroskop altında yerleştirilir ve alt çene kaldırılır. Küçük yatay bir kesi yapılır(Siyah kesikli çizgi). (C) çıkarıldıktan sonra damak, nazal septum VNO ile kaplı üst kesilir ve alt kısmı (beyaz kesik çizgiler) VNO ekstraksiyonu kolaylaştırmak için. (D) VNO ACSF çözüm konumlandırılmış ve (ekleyin: iki parça daha yüksek güç görünümü) ayrılmış. (E) VNO kıkırdak kapsül incelikle kaldırılır ve kıkırdak kapsül olmadan VNO deneyler geri kalanı için kullanılır. Ölçek barlar: BE, 1 mm. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" /> Şekil 2: Fare vomeronasal akut dilim hazırlanması ve dokusal bütünlüğü. (A) fare VNO dikey bir agar% 3 çözüm yerleştirilmiştir. Agar sıcaklığı 41 ° C&#39;den daha düşük olmalı (B) agar bloğu bir piramit şeklinde kesilir ve 100 mikron VNO bölümler (siyah kesikli çizgi) ACSF oluşturulur. (C) VNO dilimleri belirli bir görselleştirmek için bir floresan stereomikroskopta altında seçilebilirEtiketli duyusal nöronlar nüfus. (DF) Dokusal bütünlüğünü asetillenmiş-tubulin protein, hazırlık mükemmel bir koruma gösteren V1rb2 gen hedefli nöronlar yüksek bir güç görünümü karşı immunohistostainings değerlendirilebilir. Uzun dendritler lümen (E) yanı sıra, dendritik topuzlar ve mikrovilluslar yapısal protein ifadesi yüzeyine ulaşan Nöronlar (F) görülebilir. Ölçek barlar şunlardır: B, 5 mm, C, 60 mm D 40 mm, EF, 20 mikron. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" /> Şekil 3. Kalsiyum görüntüleme ve vomeronasal akut doku dilimleri feromon algılama. (A) Fura-02:00 yükleme aşamasından sonra, perfüzyon odasında VNO dilimleri yerleştirilir ve uyarlanmış bir çapa (yüksek güç görünümü) ile korunur. (B) deneyler karanlık ve VNO dilim yapılmaktadır ACSF sürekli bir vakum sistemi ile RT ile perfüze. Sıcaklık chos olabiliriki kutuplu bir Pelletier elemanı ve bir termal prob ile oluşan bir sıcaklık kontrol sistemi kullanarak tr. Bu özel deney RT yapıldı. (CE) (D) ve nöronal aktivasyon (E, burada ATP) sırasında VNO dilimleri önce Hoffman, faz kontrast (C, Hv) veya Fura 380 nm aydınlatma altında gözlemlenebilir. (F) nöronal canlılığı ATP (125 mcM) perfüzyon ile değerlendirilir. Burada chemostimulation idrar (idrar, 1:100) veya 165 ml / saat sabit bir akış hızında bir fare feromonlar karışımı (mix ph, 10 -6 M) ile yapılır Hücre içi kalsiyum düzeyleri (mesafe kadar taşınmış) (Hücre 1 - 3) her hücre için ayrı ayrı kaydedilebilir. (G) A V1Rb2 nöron GFP aydınlatma (1) altında görüntülenmiştir. (H) bu nöron (1) yanı sıra dışı bir V1rb2 ifade nöron (2) yükleme gösterilmiştir. (I) V1rb2 nöron, bir hücre içi kalsiyum artışı ile 2-heptanon cevap verebilmek. Bu özel olmayan V1rb2 ifade nöron da 2-heptanon (hücre 2) cevap verir. Ölçek barlar: CE, 20 mikron, GH,15 mm mesafe kadar taşınmış = 340 nm / 380 nm. (F ve I) uyaran uygulama süresi her iz küçük çubuklarla gösterilir. Rasgele bir renk skalası floresans şiddeti temsil eder.

<ol>
	<li>Karlson, P., L&#252;scher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Pheromones"+a+new+term+for+a+class+of+biologically+active+substances.">"Pheromones" a new term for a class of biologically active substances.</a> Nature. 183, 55-56 (1959).</li><li>Cavaggioni, A., Mucignat-Caretta, C., Redaelli, M., Zagotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scent+of+urine+spots+of+male+mice,+Mus+musculus:+Changes+in+chemical+composition+over+time.">The scent of urine spots of male mice, Mus musculus: Changes in chemical composition over time.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3741-3746 (2006).</li><li>Novotny, M., Harvey, S., Jemiolo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+male+dominance+in+the+house+mouse,+Mus+domesticus.">Chemistry of male dominance in the house mouse, Mus domesticus.</a> Experientia. 46, 109-113 (1990).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ.">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li><li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides.">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li><li>Jemiolo, B., Xie, T. M., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Socio-sexual+olfactory+preference+in+female+mice:+attractiveness+of+synthetic+chemosignals.">Socio-sexual olfactory preference in female mice: attractiveness of synthetic chemosignals.</a> Physiol. Behav. 50, 1119-1122 (1991).</li><li>Achiraman, S., Archunan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+urinary+volatiles+in+Swiss+male+mice+(Mus+musculus):+bioassay+of+identified+compounds.">Characterization of urinary volatiles in Swiss male mice (Mus musculus): bioassay of identified compounds.</a> J. Biosci. 27, 679-686 (2002).</li><li>Dulac, C., Torello, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals:+from+genes+to+behaviour.">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li><li>Brennan, P. A., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+communication+in+vertebrates.">Pheromonal communication in vertebrates.</a> Nature. 444, 308-315 (2006).</li><li>Mondor, E. B., Roitberg, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusive+fitness+benefits+of+scent-marking+predators.">Inclusive fitness benefits of scent-marking predators.</a> Proc. Biol. Sci. 271, 341-343 (2004).</li><li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli.">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li><li>Keverne, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vomeronasal+Organ.">The Vomeronasal Organ.</a> Science. 286, 716-720 (1999).</li><li>Weiler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+the+rat+vomeronasal+organ.">Postnatal development of the rat vomeronasal organ.</a> Chem. Senses. 30, 127-128 (2005).</li><li>Zufall, F., Kelliher, K. R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Microsc. Res. Tech. 58, 251-260 (2002).</li><li>Ciges, M., Labella, T., Gayoso, M., Sanchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+the+organ+of+Jacobson+and+comparative+study+with+olfactory+mucosa.">Ultrastructure of the organ of Jacobson and comparative study with olfactory mucosa.</a> Acta. Otolaryngol. 83, 47-58 (1977).</li><li>Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsystem+organization+of+the+mammalian+sense+of+smell.">Subsystem organization of the mammalian sense of smell.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).</li><li>Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors.">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Cell. 19, 371-379 (1997).</li><li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li><li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographycally+organized+and+sexually+dimorphic+distribution.">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographycally organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li><li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li><li>Young, J. M., Massa, H. F., Hsu, L., Trask, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+variability+among+mammalian+V1R+gene+families.">Extreme variability among mammalian V1R gene families.</a> Genome. Res. 20, 10-18 (2009).</li><li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats.">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li><li>Levai, O., Feistel, T., Breer, H., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+vomeronasal+organ+express+odorant+receptors+but+project+to+the+accessory+olfactory+bulb.">Cells in the vomeronasal organ express odorant receptors but project to the accessory olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 498, 476-490 (2006).</li><li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors.">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li><li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ.">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li><li>Liman, E. R., Corey, D. P., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP2:+A+candidate+transduction+channel+for+mammalian+pheromone+sensory+signaling.">TRP2: A candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5791-5796 (1999).</li><li>Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+recognition+memory+induced+by+TRPC2-independent+vomeronasal+sensing.">Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li><li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system.">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li><li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor.">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li><li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice.">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan kalsiyum görüntüleme yöntemi, akut bir dilim hazırlık, fare VNO nöronların pheromonal yanıtları kaydetmenize olanak tanır. Bu yaklaşımla, vomeronasal nöronlar hayvan diseksiyonu, bazı uygulama ile kolayca ulaşılabilir ve uzun yaşayan bir doku hazırlık sağlar. Farmakolojik pheromonal kodlama soruşturma ya da çalışma gibi zaman alıcı deneyler sağlar. Bu fizyolojik tekniği ile, büyük nüfusları kesin nöronal alt popülasyonlar yanı sıra özel olarak analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu yöntem kolayca diğer kalsiyum boyalar dayalı immünohistokimyasal yaklaşımlar veya deneylere adapte olabilir. Bu kombine metodolojilerin kullanımı kesinlikle fare vomeronasal organ ifade edilen çok sayıda yetim kemoreseptörlerin için yeni pheromonal ligandların kimlik sağlayacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Adenozin 5&#39;-trifosfat disodyum tuz solüsyonu (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100G </td><td> Tercihan immünohistokimya için </td></tr><tr><td> Agar (düşük erime) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25G </td><td> Tercihan kalsiyum görüntüleme için </td></tr><tr><td> CL-100 Bipolar Sıcaklık Kontrolör </td><td> Warner Aletleri </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokal Mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor </td><td></td></tr><tr><td> Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> Işıktan koruyun </td></tr><tr><td> DMSO (dimetil sülfoksit) </td><td> Merck </td><td> 317.275-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Kalıpları gömülmesi, Peel-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 mm </td></tr><tr><td> Floresan montaj medya (10 ml DAPI ile Vectashield) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-02:00 </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> Işıktan koruyun </td></tr><tr><td> Glisseal N (vakum gres yağı, 60 g) </td><td> Freze Chemie </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> Büyük banyo kayıt odası (RC-26g) </td><td> Warner Aletleri </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (kalsiyum görüntüleme yazılımı; v.7.6.5.0) </td><td> Visitron Sistemleri </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monoklonal Anti-tubulin, acetylated Fare antikor </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> Normal keçi serumu (NGS, 10 ml) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> Odaları için bir platform (P-1) </td><td> Warner Aletleri </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127, 2 g </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (Dozaj şişe, 10 gr) </td><td> Carl Roth </td><td> 0258,1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 Dual In-line Çözüm ısıtıcı / Soğutucu </td><td> Warner Aletleri </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> Dilim çapa (SHD 26GKIT) </td><td> Warner Aletleri </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Stereofluorescence mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> Süper PAP PEN (hidrofobikkalem) </td><td> Pelco Uluslararası </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93.420-250ML </td><td></td></tr><tr><td> Titreşimli bıçak mikrotom VT 1200S </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome yüksek hız Polikromatör sistemi </td><td> Visitron Sistemleri </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D Veri Görselleştirilmesi (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane Bilimsel Yazılımı </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation

Peter Karlson ve Martin Lüscher tür içi iletişim için kullanılan kimyasallar tanımlamak için ilk kez 1959 1 terimi feromon kullandı. Feromonlar, uçucu veya uçucu olmayan kısa ömürlü moleküllerdir 2 salgılanan ve / veya idrar, feromonlar 3 ana kaynak olduğu bilinen bir sıvı gibi biyolojik sıvılarda 3,4, içerdiği . Pheromonal iletişim kin etkileşimleri 5,6, hiyerarşik örgütler 3 ve cinsel etkileşimleri 7,8 gibi önemli hayvan yöntemlerinin çeşitli karıştığı ve dolayısıyla belirli bir türün 9,10,11 sağkalım ile doğrudan ilişkilidir. Farelerde, feromonları algılamak için yeteneği esas vomeronasal organ (VNO) 10,12, burun boşluğunun tabanında bulunan eşleştirilmiş bir yapı tarafından aracılık ve kıkırdak kapsül içine. Her VNO harici ile temas sağlayan bir lümen 13,14 ile tübüler bir şekilkimyasal dünya. Duyusal neuroepithelium esas vomeronasal bipolar duyu nöronları (VSNs) 15 oluşur. Her VSN kimyasal algılama 16 karıştığı 100 mikrovilluslar kadar taşıyan büyük bir dendritik topuzu ile biten lümen tek bir dendrit uzanır. VSNs, çok sayıda alt popülasyonlar mevcuttur. 17,18 farkındayız ligand (ler) tarafından muhtemelen bu nedenle ifade ve kemoreseptör ile ayırt edilirler. İki ana vomeronasal reseptör aileler, V1Rs ve V2Rs 19,20,21,22, 240 23 ve 120 24 üye sırasıyla oluşur ve neuroepithelium ayrı katmanlar olarak ifade edilir. Olfaktör reseptörleri (OO) 25 ve formil peptid reseptörleri (FPRs) 26,27 VSNs da ifade edilir. Bu algılama feromonlar nöronal alt popülasyonlar için olsun ya da olmasın aynı downstream sinyal yolağı bilinmemektedir. Geçirgen bir kalsiyum kanal (tarafından oynanan önemli bir rol rağmenOlgun nöronlar, 28 TRPC2 bağımsız transdüksiyon kanal mikrovilluslar TRPC2) 6,29 öne sürülmüştür . Nöronal alt popülasyonlar ve organın kendine özgü morfoloji sayısının yüksek olması nedeniyle, farmakolojik ve fizyolojik araştırmalar VNO sinyal elemanlarının karmaşıktır. Burada, kalsiyum görüntüleme incelemeler yapmak için fare VNO akut doku dilim hazırlık mevcut. Bu fizyolojik bir yaklaşım, daha önce Fura-02:00, kalsiyum boya yüklü VSNs genel veya bireysel alt popülasyonlar, doğal ortamda yaşayan bir doku, gözlem sağlar. Bu yöntem, herhangi bir GFP etiketli feromon reseptör eğitim için de uygundur ve diğer floresan kalsiyum problar kullanım için uyarlanabilir. Örnek olarak, biz burada, feromon V1rb2 reseptör çeviri GFP ifade polycistronic stratejisi ile bağlantılı olduğu VG fare hattı 30, kullanırlar . </p&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation at JoVE.com

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Farelerde, feromonları algılamak için yeteneği esas vomeronasal organ (VNO) tarafından aracılık eder. Burada, kalsiyum görüntüleme yapmak için VNO akut doku dilim hazırlık açıklanmıştır. Bu fizyolojik bir yaklaşımdır alt popülasyonlar ve / veya bireysel nöronlar gözlemleri yaşayan bir doku sağlar ve reseptör-ligand tanımlanması için uygundur.

Görüntüleme Feromon Fare Vomeronasal Akut Doku Dilim Hazırlama içinde Algılama

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

imaging-pheromone-sensing-mouse-vomeronasal-acute-tissue-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.1K Görüntüleme.  University of Lausanne. Farelerde, feromonları algılamak için yeteneği esas vomeronasal organ (VNO) tarafından aracılık eder. Burada, kalsiyum görüntüleme yapmak için VNO akut doku dilim hazırlık açıklanmıştır. Bu fizyolojik bir yaklaşımdır alt popülasyonlar ve / veya bireysel nöronlar gözlemleri yaşayan bir doku sağlar ve reseptör-ligand tanımlanması için uygundur.

Video: Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Vomeronasal Epitel Multielectrode Dizi Kayıtlar

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Nörobilim

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Dilim hazırlanması, Organotipik Doku ekimi ve suprakiazmatik nükleus Saat Gen Faaliyet Lusiferaz Kayıt

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

Kalsiyum Görüntüleme için akut subventricular dilimi Dilimleri hazırlanması

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: Fizyolojik Sıcaklık Akut Yetişkin Beyin Dilimleme

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...