Yazarlar, işleme ve akış odaları aracılığıyla görüntü hücrelere teknikleri konusunda yardımcı olmak için Leica Microsystems akışını odası parçaları ve Matt Maudsley montaj onun yorulmak bilmeyen çabaları için Biyomedikal Alet ve Makine Dükkanı Joe Owen teşekkür etmek istiyorum. Biz Duke Perfüzyon Hizmetler Kevin Collins ve akış devre tasarımı yararlı önerileri için Biyomedikal Mühendisliği Bölümü Dr. Steve Wallace borçluyuz. Ayrıca, RC1HL099863-01 &quot;Otolog EPC astar dolaşım, biyouyumluluk yardımcı cihazlar geliştirmek için&quot; Hibe yoluyla verdikleri destek için Alexandra Jantzen ve NIH Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>Bhat, V. D., Truskey, G. A., Reichert, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+and+avidin-biotin+as+a+heterogeneous+ligand+system+for+enhanced+endothelial+cell+adhesion.">Fibronectin and avidin-biotin as a heterogeneous ligand system for enhanced endothelial cell adhesion.</a> J. Biomed. Mater. Res. 41, 377-385 (1998).</li><li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+stem+and+progenitor+cells.">Cord blood stem and progenitor cells.</a> Methods Enzymol. 419, 439-473 (2006).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. , (2010).</li><li>Brown, M. A., Wallace, C. S., Angelos, M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+umbilical+cord+blood-derived+late+outgrowth+endothelial+progenitor+cells+exposed+to+laminar+shear+stress.">Characterization of umbilical cord blood-derived late outgrowth endothelial progenitor cells exposed to laminar shear stress.</a> Tissue. Eng. Part. A. 15, 3575-3587 (2009).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+titanium+ventricular+assist+device+surfaces+after+gold/palladium+coating+for+scanning+electron+microscopy.">Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy.</a> Microsc. Res. Tech. 73, 71-76 (2010).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+titanium+cardiovascular+devices+seeded+with+autologous+blood-derived+endothelial+progenitor+cells:+EPC-seeded+antithrombotic+Ti+Implants.">The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants.</a> Biomaterials. 32, 10-18 (2011).</li><li>Rinker, K. D., Prabhakar, V., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+contact+time+and+force+on+monocyte+adhesion+to+vascular+endothelium.">Effect of contact time and force on monocyte adhesion to vascular endothelium.</a> Biophys. J. 80, 1722-1732 (2001).</li><li>Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F., Horton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Transport Phenomena in Biological Systems. , (2004).</li><li>Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F., Horton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Transport Phenomena in Biological Systems. , (2009).</li><li>Allen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+nitrite+response+and+arterial+reactivity+differentiate+vascular+health+and+performance.">Plasma nitrite response and arterial reactivity differentiate vascular health and performance.</a> Nitric Oxide. 20, 231-237 (2009).</li><li>Xiao, Y., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+receptor-ligand+affinity+on+the+strength+of+endothelial+cell+adhesion.">Effect of receptor-ligand affinity on the strength of endothelial cell adhesion.</a> Biophys. J. 71, 2869-2884 (1996).</li><li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Adhesion+and+Aggregation+Under+Flow+using+Microfluidic+Flow+Cells.">Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1644-e1644 (2009).</li><li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. W. e. l. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plate-coupled+microfluidic+devices+designed+for+facile+image-based+cell+adhesion+and+transmigration+assays.">plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).</li><li>Conant, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+well-plate+microfluidic+devices+to+conduct+shear-based+thrombosis+assays.">Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays.</a> J. Lab. Autom. 16, 148-152 (2011).</li><li>Metaxa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide-dependent+stimulation+of+endothelial+cell+proliferation+by+sustained+high+flow.">Nitric oxide-dependent stimulation of endothelial cell proliferation by sustained high flow.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 295, H736-H742 (2008).</li><li>Radel, C., Carlile-Klusacek, M., Rizzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Participation+of+caveolae+in+beta1+integrin-mediated+mechanotransduction.">Participation of caveolae in beta1 integrin-mediated mechanotransduction.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 358, 626-631 (2007).</li><li>Wang, X. L., Fu, A., Spiro, C., Lee, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Vascular+Endothelial+Cells-Effects+of+Laminar+Shear+Stress+and+High+Glucose.">Proteomic Analysis of Vascular Endothelial Cells-Effects of Laminar Shear Stress and High Glucose.</a> J. Proteomics. Bioinform. 2, 445-445 (2009).</li><li>Elfervig, M. K., Minchew, J. T., Francke, E., Tsuzaki, M., Banes, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1beta+sensitizes+intervertebral+disc+annulus+cells+to+fluid-induced+shear+stress.">IL-1beta sensitizes intervertebral disc annulus cells to fluid-induced shear stress.</a> J. Cell. Biochem. 82, 290-298 (2001).</li><li>Archambault, J. M., Elfervig-Wall, M. K., Tsuzaki, M., Herzog, W., Banes, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+tendon+cells+produce+MMP-3+in+response+to+fluid+flow+without+significant+calcium+transients.">Rabbit tendon cells produce MMP-3 in response to fluid flow without significant calcium transients.</a> J. Biomech. 35, 303-309 (2002).</li><li>Patton, J. T., Menter, D. G., Benson, D. M., Nicolson, G. L., McIntire, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computerized+analysis+of+tumor+cells+flowing+in+a+parallel+plate+chamber+to+determine+their+adhesion+stabilization+lag+time.">Computerized analysis of tumor cells flowing in a parallel plate chamber to determine their adhesion stabilization lag time.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 26, 88-98 (1993).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium.">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009-e1009 (2009).</li><li>Kaper, H. J., Busscher, H. J., Norde, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+poly(ethylene+oxide)+brushes+on+glass+surfaces+and+adhesion+of+Staphylococcus+epidermidis.">Characterization of poly(ethylene oxide) brushes on glass surfaces and adhesion of Staphylococcus epidermidis.</a> J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 14, 313-324 (2003).</li><li>Bakker, D. P., Plaats, A. v. a. n. d. e. r., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces.">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).</li><li>Angelos, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+adhesion+of+umbilical+cord+blood+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+shear+stress.">Dynamic adhesion of umbilical cord blood endothelial progenitor cells under laminar shear stress.</a> Biophys. J. 99, 3545-3554 (2010).</li><li>Baker, G. R., Sullam, P. M., Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+fluorescent+method+to+internally+label+platelets+suitable+for+physiological+measurements.">A simple, fluorescent method to internally label platelets suitable for physiological measurements.</a> Am. J. Hematol. 56, 17-25 (1997).</li></ol>

Üretim ve bu video makale Ücretsiz Erişim Cole-Parmer Instrument Co tarafından desteklenen

Akım devresi ve akış odası tanımlanan sıvı kayma gerilmeleri yapışık hücreleri, örneğin EPC, bize konu ile izin verir. Odanın alt ve üst şeffaf, hücre yapışması ve morfolojisi, odanın kendisi aracılığıyla ya da gerçek zamanlı olarak değerlendirilir ya da demontaj akış odasının bir akış deney ve sonra olabilir. Bu noktada, hücreler steril koşullar altında hasat edilebilir ve yeniden kaplama ya, ya da daha fazla analiz için DNA veya RNA, vb. Toplamak için kullanılıyor. Laminar akım elde etmek için, odasının tasarımı, çeşitli koşulların yerine getirildiğinden emin olmalıdır. İlk olarak, akış, laminer, atalet kuvvetlerini viskoz kuvvetlere oranı Reynolds sayısı (Re), hesaplanmak suretiyle kontrol edilebilir olmalıdır. (Viskoz kuvvetler baskın olursa, Yeniden küçük ve akış laminer ya da &#39;tam gelişmiş&#39; - genellikle Re &lt;2300 için.Biz, atalet kuvvetlerini egemen çalkantılı kadar, akış daha fazla rastgele olur, Re&gt; 4000 için geçerlidir.) Denklemi 3 8 göre Ynt hesaplamak <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" /> Ρ akışkan yoğunluğu, Q debisi, μ viskozite, w ve h sırasıyla odanın genişliği ve yüksekliği, ve D h denklemi 4 8 göre tanımlanan hidrolik çapı <img alt="Denklem 4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" /> Reynolds sayısı 166 arasında değişen yükseklikleri ile üç akış odaları, - 267 mm aralığı 13,9 - 34,6 c akış hızlarında15 dynes / cm 2 kayma gerilmesi elde etmek alculated. 234 - 100 dynes / cm 2 bir kayma gerilmesi için hesaplanan akış hızlarında, odaları Reynolds sayısı 90.4 arasında değişmektedir. Bütün bu Reynolds sayıları 2300 den çok daha düşük olduğu ve laminer akış için kriterleri karşılamadığı. İkincisi, hız alanı ve kayma gerilmesi için, (yani tam gelişmiş), akış kanalı girişinde uzunluğu, L e daha uzun olmalıdır slayt akışkan giriş uzaklık boyunca mesafe bağımsız olması . Bu denklem 5 9 göre, girişinde uzunluğu hesaplanırken memnun olabilirler. <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" /> Yukarıda sıralanan değerleri için, giriş uzunluğu 0.01 &#39;den 0.25 cm arasında değişmektedir. Üçüncü olarak, lateral yönde hız ve kayma gerilmesi farklılık olmadığını sağlamak amacıylatek boyutlu kanal akışı için önemli değeri (Δ Ph / 2L), h / w oranı 1 den daha az olmalıdır. H / w, tek boyutlu akış altında duvar kayma gerilmesi% 95 için iki boyutlu akış koşulları altında ortalama duvar kayma gerilmesi için, 0,10 eşit olması gerekir, ve iki boyutlu akış koşulları altında duvar kayma gerilmesi için % 97,5 &#39;tek boyutlu akış altında duvar kayma gerilmesi, h / w 0.05 eşit olması gerekir. Tasarlanmış akış haznesi 1,7 cm genişliğinde ve 166 boyutları ile yüksekliği 267 mm, bu kriterleri yerine. Girişinde herhangi bir yanal basınç farkları varsa, basınç, akış yönü değişecektir. Bu akış yolu boyalar veya parçacıklar kullanılarak değerlendirilebilir. Ayrıca, sürekli akış deneyleri için, bir darbe dampener akım devresi eklenir. Darbe dampener darbe alıratility devrede roller pompa ile neden ve bize sürekli akış yaklaşık varsayımı sağlar. Notu, etkin roller pompa belirli frekanslar için çıkış akım titreşimlerle ortadan kaldırmak, böylece kullanılan darbe tav devresinde kullanılan pompa ve boru ile uyumlu olmalıdır. I / P 26 tüp herhangi bir Masterflex L / S serisi pompası (600 RPM&#39;ler 0) ile deşarj hattı üzerinde kullanılan gösteriye Masterflex L / S darbe dampener laminar akım elde. Pulsatil akış için, programlanabilir bir pompa çeşitli dalga şekilleri oluşturmak için kullanılabilir. Pulsatil akış için, programlanabilir bir pompa çeşitli dalga şekilleri oluşturmak için kullanılabilir. Ayrıca, devre perfüzat gibi bu örnekleri tasarlanmıştır kolayca hücreleri veya akış ortamı bulaşma riski olmadan farklı zaman noktalarında toplanabilir. Bizim örneğimizde, NO 2 konsantrasyonu ile chemiluminescence ile ölçüldüiyonlar / Sievers Nitrik Oksit Analyzer (NOA 280, Sievers Aletleri, Boulder, CO), daha önce açıklanan 10. Nitrit analizi için kullanılan indirgeyici NO nitrit dönüştürmek için azaltma potansiyeline sahiptir, ancak herhangi bir yüksek nitrat gibi azot oksitler azaltmak için yeterli asetik asit (14.5 M asetik asit ve 0.05 M KI) potasyum iyodür ve böylece nispeten nitrit için özel. Örnekleri 6 alırken kayıp hacmi için düzeltme sırasında üretilen toplam miktarın nitrit konsantrasyon ve devrenin toplam hacmi üretilen ürün olarak hesaplandı. Aşağıdaki adımları akış deneylerin başarılı bir şekilde yürütülmesi için kritik öneme sahiptir: <ol class="lroman"><li> Kabarcıkları, yüzey hücreleri yırtma potansiyele sahip çünkü akış set-up sırasında kabarcık oluşumunu önlemek için arzu edilen bir durumdur. Bu akış odasının üst kısmında en iyi alt kısmı, üstüne yerleştirirken dikkatli alarak önlenebilirher ikisi de birbirine paralel tutulması ve yeniden düzenlemeler olmadan bir hareket üzerine en alt düşürücü tarafından gerçekleştirilir. Bunu yaparken, akış kanalı mevcut ve / veya kayan küçük hava kabarcıkları, alüminyum gövdesi iki ucundaki balonu tuzaklar içine yönlendirilir olacak. </li><li> Rezervuar rezervuar alt çıkış hortumu aşağı ulaştığı sağlamak için önemlidir. Aksi takdirde, hava perfüzat seviyesi hortumun ucuna hafifçe altına düşerse rezervuar odasına açar tüp içine çekilir. </li><li> Araştırmacı, yanlışlıkla devre ve odasına emilir hava akış başlaması, pompa üzerine ters yönde çalışmaz böylece pompa akış yönü ile bilgi sahibi olması gerekir. </li><li> (Denatüre serum içerdiği proteinler nedeniyle) köpük oluşumunu önlemek için, biz perfusa üzerinde yaklaşık bir inç odasından rezervuar yol açan boru düşürücü tavsiye ederizrezervuar içinde te seviyesi. Ancak, akış orta seviyesinin üzerinde tutarak deney sırasında rezervuar içine akışını kontrol etmek için izin verir. </li><li> Odası parçaları bir araya vidalama, elektrikli tornavida çalışırken diğer elinizle sıkıca bir yandan konut kavramak önemlidir. Hareket elektrikli tornavida, vida sıkılır sonra &#39;etrafında odasına fırlatmak&#39; potansiyeline sahiptir tork çevrilen unutmayın. </li><li> Devre şekillendirme ve kendi yüzeyinden hücrelerin kaldırma herhangi bir basınç dalgaları önlemek için, tüm stopcocks akışı başlamadan önce açık olduğundan emin olun. </li><li> Özellikle, uzun vadeli akış çalışmalar için (&gt; 48 saat) hortumun kırılmasını önlemek için pompa kafası eklenecek daha sert ve daha esnek bir boru kullanmanızı öneririz. </li><li> Tüp kötü ayarlanmış pompa kafası dişleri nedeniyle pompa kafası içinde &#39;göç&#39; mümkündür. Bu nedenle, nasıl küvet yakından ilgilenerek öneririzing pompa kafası güvenli ve boru, boru &#39;çekti&#39; veya deney sırasında yerinden ise kolayca fark edebilirsiniz böyle bir işaretleme kalemi ile her iki ucunda işaretleme. </li><li> Hatalı bir bağlantı nedeniyle bir deney sırasında perfüzat kaçağı önlemek için her zaman dikkatli bir şekilde perfüzyon başlamadan önce, devre ve odasının her tek bağlayıcı kontrol edin. Bu darbe dampeners giriş ve çıkış konnektörleri için özellikle önemlidir! </li><li> Floresan etiketleri kullanmayın ışık maruz kalma sınırı unutmayın. </li></ol> Akış odasının olası bir sınırlama alüminyum içine işlenmiş kanal yükseklik yükseklik sabit olmasıdır. Ancak, bu her bir deney için önce kanal yüksekliği doğrulamak ve ayarlamak için bir avantaja sahiptir ve bu nedenle pompa akış istenen değere ayarlayarak sadece kayma gerilmesi hesaplamaları kolaylaştırır. Araştırma hedeflerine bağlı olarak istenebilirartan pompa hızını olmadan kayma gerilmesi artar. Bu durumda biz perfüzat viskozite arttırıcı öneririz, örneğin orta 11 dekstran ekleyerek. Akım devresi, çok küçük konsantrasyonlarda hücre metabolitleri ölçmek için çalışırken sorunlu olabilir kullanılan orta büyük hacimli, olası bir sınırlama. Burada gösterilen olmasa da, büyük ölçüde, küçük bir rezervuar ve nabız tav kullanarak devre hacmi azaltmak ve boru uzunluğu ve çapı azaltmak mümkündür. Ayrıca, kültür hücrelere sıvı kayma gerilmesi uygulamak için kullanılabilecek birkaç piyasada mevcut diğer sistemler vardır. Mikroakışkan tabanlı sistemler, hücre eş zamanlı analizler 12,13,14 bu kanallar için giriş ve çıkış rezervuarlar gibi davranan iyi tabak içine çözüm yüklü farklı mikroakışkan akış kanalları etkinleştirmek Fluxion BioFlux sistemi örneğin. Bununla birlikte, bu ve diğer mikroakışkan sistemlerinin standart mikroskop lamı ile uyumlu değildir ve RT-PCR ve Western Blot gibi başka deneyler, hücrelerin yeterli sayıda kurtarma için izin vermez. Ayrıca, daha az kullanıcı dostu 40.000 $ minimum maliyet ve aksesuar ekipmanları bağlı olarak, toplam 100.000 $ &#39;dan fazla ulaşabilirsiniz. Tıkla FlexCell International Corporation, Tıkla FlexCell Çıtası ve FlexFlow sistemleri İki macrofluidic sistemleri, başarıyla, endotel hücreleri 15,16,17, sıvı akışını koşullar altında insan annulus hücreleri 18 ve fibroblastlarının 19 çalışma kullanılmaktadır . GlycoTech yoluyla üçüncü bir sistem, tümör hücre adezyon 20 ve endotel mono tabakaları lökosit adezyonu 21 çalışma kullanılmıştır. Çıtası sistemi birkaç slayt tek seferde aynı kayma stres koşulları altında çalışmasına olanak sağlar, fakat bizim farklı bir görüntüleme penceresi ve yoksuntasarım - akış altında hücrelerin gerçek zamanlı görselleştirme için izin vermiyor. FlexFlow sistem bir görüntüleme penceresi var, ama dik bir mikroskop, çoğu laboratuvarlarda kullanılan standart bir mikroskop olmayabilir gerektirir. Ayrıca, FlexFlow sistemi akış odasına yerleştirildiği zaman ters bir hücre kaplı bir kapak kayma gerektirir. Bu bizim çalışma göstermektedir titanyum kaplı cam gibi, donuk bir yüzey üzerinde floresan hücreleri, görselleştirme engellemektedir. Son olarak, özel kapak fişleri Tıkla FlexCell Çıtası sistemine benzer çok bin dolar fiyat aralığında FlexFlow sistemi, özellikle satın alınması gerekir. GlycoTech önemli ölçüde daha az pahalı, ama rahatlıkla Odamızın gibi otoklava kök olamaz akrilik döküm imal dairesel ve dikdörtgen plaka paralel akış odaları sunmaktadır. Not tarif edilmiştir diğer akış odaları otoklav içinmikroskobik özel lensler 22,23 gerektirdiğinden pratik görünür. GlycoTech sistemi tekrar kullanımı ile kalınlık değiştirmek ve bu nedenle zaman (üretici her on kullanımdan sonra yenilerini satın önerir) üzerinde oda yüksekliğini değiştirmek alt ve üst plakalar arasında yer silikon kauçuk contalar, kullanır. Dahili O-ring ile alüminyum odası, alt ve üst plakalar tam muhalefet sağlar ve deneyler arasında sürekli odası yüksekliği sağlar. Son olarak, vakum pompaları, tasarım gerekli değildir GlycoTech odaları da dahil olmak üzere birçok akış oda tasarımları sızdırmaz mühür, başarmak için gerekli. Oysa burada gösterilmemiştir, akış odası, hücre yapışması ve / veya davranış gerçek zamanlı görüntüleme için tüm akış deney sırasında mikroskop altında tutulmalıdır. Bu istenirse, biz 37 perfüzat ısısını korumak için odanın altında ısı lambaları veya ısıtılmış bir yastık kullanmanızı öneririz ° C Kürkhücreleri veya metabolitleri veya araştırılan ilaçlar veya ajanlar, ya hiç &#39;devridaim&#39; 24 isteniyorsa, orada roller pompa, bir şırınga pompası ile değiştirilir olabilir. Konfluent EPC bir katman üzerinde yapışık hücreler, örneğin flüoresan trombositler (trombosit tahlil kullanarak Achneck ve arkadaşları tarafından açıklanan 6,25) üzerinde sıvı kayma stres altında hücre-hücre etkileşimi değerlendirmek için farklı etiketli hücreleri akışı da mümkündür. Bizim akış odası gibi, bir perfüzat örnekleme liman ve bir görüntüleme penceresi gibi diğer akış odaları, değerli özelliklerini birleştiriyor ve ya ters ya da dik bir mikroskop ile uyumluluk önemli bir avantaja sahiptir. Otoklavlanabilir ve sızdırmaz bir sızdırmazlık elde etmek için sabit odası yüksekliği ve vakum pompaları gerek kalmadan tekrarlanan deneyler için izin verir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Ürünler / Reaktifler </td><td> Şirket </td><td> Ürün # </td></tr><tr><td> 10 ml Şırınga </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07940-12 </td></tr><tr><td> 1-Way Stopcoks </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-00 </td></tr><tr><td> 30 ml Şırınga </td><td> BD Tıp </td><td> 309650 </td></tr><tr><td> 4-Way Stopcocks </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-04 </td></tr><tr><td> Alüminyum Alaşımlı </td><td> N / A </td><td> 6061 </td></tr><tr><td> Hücre Kültür Yemekleri (4-iyi, dikdörtgen) </td><td> Thermo Scientific; Nunc </td><td> 267061 </td></tr><tr><td> Hücre Tracker Orange </td><td> Invitrogen </td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Araştırma Organics </td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM-2 Singlequots </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Kadın Luer Adaptör </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> SI-45500-04 </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> Sigma </td><td> F0895-2MG </td></tr><tr><td> Kapaklı Cam Şişe (250ml) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 34594-24 </td></tr><tr><td> Sabit Boru </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06508-16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td></tr><tr><td> Histopaque </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td></tr><tr><td> Hoechst Leke solüsyonu </td><td> Sigma </td><td> H6024 </td></tr><tr><td> Hyclone FBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Lonza </td><td> 17-605E </td></tr><tr><td> Erkek Luer Adaptör </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> EW-45.505-04 </td></tr><tr><td> MCDB-131, 1X Orta </td><td> Cellgro </td><td> 15-100-CV </td></tr><tr><td> Dikenli Polipropilen Rekorları </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06365-90 </td></tr><tr><td> O-Ringler </td><td> N / A </td><td> AS568A </td></tr><tr><td> Darbe-Tav </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07596-20 </td></tr><tr><td> Pompa-Drive (Masterflex L / S değişken hızlı ekonomisi sürücü) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 7524-40 </td></tr><tr><td> Pompa-Head (Masterflex Kolay Yükleme Pompa Kafası) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07518-60 </td></tr><tr><td> Slayt </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 48500-00 </td></tr><tr><td> Yumuşak Boru </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 96400-16 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Şırınga filtre </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 02915-12 </td></tr><tr><td> Sytox Turuncu Nükleik Acid Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S-11.368 </td></tr><tr><td> Tripsin EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Tripsin Nötralleştirme solüsyonu </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td></tr></tbody></table>

parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress

Bu yöntemin genel amacı, yapışık hücrelere laminer akış koşullarına tabi ve iyi ölçülebilir sıvı kesme 1 vurguluyor tepki değerlendirmek için bir tekniği tanımlamaktır . Bizim akış odası tasarımı ve akış devresi (Şekil 1) (Şekil 11C) akış sırasında çeşitli zaman noktalarında (Şekil 11A, B) akış önce hemen hücre morfolojisi hücre yapışması ve görüntüleme testleri sağlayan şeffaf bir görüş bölgeyi içeren ve sonra akışı (Şekil 11D). Bu deneyler, insan göbek kordonu ile gösterilmiştir kan elde edilen endotelyal progenitör hücreleri (EPC) ve domuz EPC 2,3. Bu yöntem aynı zamanda diğer yapışık hücre tipleri, örneğin düz kas hücreleri (SMC&#39;lere) veya fibroblastlar için geçerli. Odası ve devrenin tüm parçaları kolayca buhar otoklav ile sterilize edilir. Buna karşılık diğerodaları, örneğin mikroakışkan odaları, hücreleri (hücre büyüklüğüne göre 1 milyon), çok sayıda, hücre kültürü veya diğer deneyler, örneğin, DNA veya RNA ekstraksiyonu, ya da immünhistokimya (Şekil 11E) steril koşullar altında akış deney sonucunda kurtarıldı. ya da tarama elektron mikroskobu 5 . Kayma gerilmesi perfüzat, akışkanın viskozite, veya kanal yükseklik ve genişlik debisi değişen ayarlanabilir. Tek boyutlu akış muhafaza edilmesini sağlarken ikincisi sıvı hacmi ya da hücrenin ihtiyacı azaltabilir. Odanın yüksekliği büyük ölçüde birden fazla deneyler kolaylığını artırır conta kullanımı, bağlı değildir, çünkü deneyler arasındaki oda yüksekliğini ölçmek için gerekli değildir. Ayrıca, devre tasarımı, kolayca analiz ve / veya sıvı kayma gerilmesi pozlama altında hücreleri tarafından salgılanan metabolitlerin ölçümü, örneğin nitrik oksit (Şekil 12) 6 perfüzat örneklerin toplanmasını sağlar </sup&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress at JoVE.com

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Steril bir sürekli akış devresi, laminer akış kayma gerilmesi tabi yapışık hücrelere için bir yöntem tarif. Hücrelerin yapışma, morfoloji, şeffaf oda ile devre metaboliti analizi ve gelecek deneyler ya da kültür için kayma maruz kaldıktan sonra hasat hücreleri için alınan numuneler incelenmiştir olabilir.

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

parallel-plate-flow-chamber-continuous-flow-circuit-to-evaluate

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Civil Engineering

Bioengineering

Unit 1

Differential Analysis of Fluid Flow

SCIENTISTS IN ACTION

43.2K Görüntüleme.  Duke University Medical Center. Steril bir sürekli akış devresi, laminer akış kayma gerilmesi tabi yapışık hücrelere için bir yöntem tarif. Hücrelerin yapışma, morfoloji, şeffaf oda ile devre metaboliti analizi ve gelecek deneyler ya da kültür için kayma maruz kaldıktan sonra hasat hücreleri için alınan numuneler incelenmiştir olabilir.

Video: Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

Çok kanallı mikroakışkan Cihazlar ayırmak Boncuk ve Hücreler Dielectrophoresis ve Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Biyomühendislik

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

Sürekli Akış Microspotter kullanma Modifiye yüzeye hücrelerin Batık Baskı

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Odası Deneyi

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

Stres birden çok paralel-plaka akışı Chambers kullanarak yamultmak için maruz endotel hücrelerinin gen ifade Analizi

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and size distribution of nanoparticles is of utmost importance for various applications. The size range is also important, as it defines the most &#8220;active&#8221; component of a nanoparticle dose.
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4) is a powerful technique for sizing of particles in suspension in the size range of approximately 1&#8211;1000 nm. There are several ways to derive size information from an AF4 experiment. Besides coupling AF4 online with size-sensitive detectors based on the principles of Multi-Angle Light Scattering or Dynamic Light Scattering, there is also the possibility to correlate the size of a sample with its retention time using a well-established theoretical approach (FFF theory) or by comparing it with the retention times of well-defined particle size standards (external size calibration).
We here describe the development and in-house validation of a standard operating procedure (SOP) for sizing of an unknown gold nanoparticle sample by AF4 coupled with UV-vis detection using external size calibration with gold nanoparticle standards in the size range of 20&#8211;100 nm. This procedure provides a detailed description of the developed workflow including sample preparation, AF4 instrument setup and qualification, AF4 method development and fractionation of the unknown gold nanoparticle sample, as well as the correlation of the obtained results with the established external size calibration. The SOP described here was eventually successfully validated in the frame of an interlaboratory comparison study highlighting the excellent robustness and reliability of AF4 for sizing of nanoparticulate samples in suspension.

This protocol describes the use of Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation coupled with UV-vis detection for the determination of the size of an unknown gold nanoparticle sample.

Süspansiyonda Altın Nanopartiküllerin Boyutlandırılması için Asimetrik Akış Alanı-Akış Fraksiyonasyonu

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Ultra Hızlı Doppler ile Kan Akışı Görüntüleme

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...