Die Autoren bedanken sich bei Joe Owen in der biomedizinischen Instrumenten-und Machine Shop danken für seinen unermüdlichen Einsatz bei der Bearbeitung und Montage der Flusskammer Teile und Matt Maudsley von Leica Microsystems zur Unterstützung in Techniken zur Bild-Zellen durch Strömungskammern. Wir danken Kevin Collins von der Duke Perfusion Services und Dr. Steve Wallace in der Abteilung für Biomedizinische Technik für hilfreiche Anregungen fließen Schaltungsdesign. Wir möchten auch die National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program zur Unterstützung von Alexandra Jantzen und der NIH für die Unterstützung durch Grant &quot;Autologe EPC-Futter auf die Biokompatibilität von Herz-Kreislauf verbessern assist devices&quot; RC1HL099863-01 danken.

<ol>
	<li>Bhat, V. D., Truskey, G. A., Reichert, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+and+avidin-biotin+as+a+heterogeneous+ligand+system+for+enhanced+endothelial+cell+adhesion.">Fibronectin and avidin-biotin as a heterogeneous ligand system for enhanced endothelial cell adhesion.</a> J. Biomed. Mater. Res. 41, 377-385 (1998).</li><li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+stem+and+progenitor+cells.">Cord blood stem and progenitor cells.</a> Methods Enzymol. 419, 439-473 (2006).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. , (2010).</li><li>Brown, M. A., Wallace, C. S., Angelos, M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+umbilical+cord+blood-derived+late+outgrowth+endothelial+progenitor+cells+exposed+to+laminar+shear+stress.">Characterization of umbilical cord blood-derived late outgrowth endothelial progenitor cells exposed to laminar shear stress.</a> Tissue. Eng. Part. A. 15, 3575-3587 (2009).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+titanium+ventricular+assist+device+surfaces+after+gold/palladium+coating+for+scanning+electron+microscopy.">Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy.</a> Microsc. Res. Tech. 73, 71-76 (2010).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+titanium+cardiovascular+devices+seeded+with+autologous+blood-derived+endothelial+progenitor+cells:+EPC-seeded+antithrombotic+Ti+Implants.">The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants.</a> Biomaterials. 32, 10-18 (2011).</li><li>Rinker, K. D., Prabhakar, V., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+contact+time+and+force+on+monocyte+adhesion+to+vascular+endothelium.">Effect of contact time and force on monocyte adhesion to vascular endothelium.</a> Biophys. J. 80, 1722-1732 (2001).</li><li>Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F., Horton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Transport Phenomena in Biological Systems. , (2004).</li><li>Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F., Horton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Transport Phenomena in Biological Systems. , (2009).</li><li>Allen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+nitrite+response+and+arterial+reactivity+differentiate+vascular+health+and+performance.">Plasma nitrite response and arterial reactivity differentiate vascular health and performance.</a> Nitric Oxide. 20, 231-237 (2009).</li><li>Xiao, Y., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+receptor-ligand+affinity+on+the+strength+of+endothelial+cell+adhesion.">Effect of receptor-ligand affinity on the strength of endothelial cell adhesion.</a> Biophys. J. 71, 2869-2884 (1996).</li><li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Adhesion+and+Aggregation+Under+Flow+using+Microfluidic+Flow+Cells.">Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1644-e1644 (2009).</li><li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. W. e. l. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plate-coupled+microfluidic+devices+designed+for+facile+image-based+cell+adhesion+and+transmigration+assays.">plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).</li><li>Conant, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+well-plate+microfluidic+devices+to+conduct+shear-based+thrombosis+assays.">Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays.</a> J. Lab. Autom. 16, 148-152 (2011).</li><li>Metaxa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide-dependent+stimulation+of+endothelial+cell+proliferation+by+sustained+high+flow.">Nitric oxide-dependent stimulation of endothelial cell proliferation by sustained high flow.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 295, H736-H742 (2008).</li><li>Radel, C., Carlile-Klusacek, M., Rizzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Participation+of+caveolae+in+beta1+integrin-mediated+mechanotransduction.">Participation of caveolae in beta1 integrin-mediated mechanotransduction.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 358, 626-631 (2007).</li><li>Wang, X. L., Fu, A., Spiro, C., Lee, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Vascular+Endothelial+Cells-Effects+of+Laminar+Shear+Stress+and+High+Glucose.">Proteomic Analysis of Vascular Endothelial Cells-Effects of Laminar Shear Stress and High Glucose.</a> J. Proteomics. Bioinform. 2, 445-445 (2009).</li><li>Elfervig, M. K., Minchew, J. T., Francke, E., Tsuzaki, M., Banes, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1beta+sensitizes+intervertebral+disc+annulus+cells+to+fluid-induced+shear+stress.">IL-1beta sensitizes intervertebral disc annulus cells to fluid-induced shear stress.</a> J. Cell. Biochem. 82, 290-298 (2001).</li><li>Archambault, J. M., Elfervig-Wall, M. K., Tsuzaki, M., Herzog, W., Banes, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+tendon+cells+produce+MMP-3+in+response+to+fluid+flow+without+significant+calcium+transients.">Rabbit tendon cells produce MMP-3 in response to fluid flow without significant calcium transients.</a> J. Biomech. 35, 303-309 (2002).</li><li>Patton, J. T., Menter, D. G., Benson, D. M., Nicolson, G. L., McIntire, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computerized+analysis+of+tumor+cells+flowing+in+a+parallel+plate+chamber+to+determine+their+adhesion+stabilization+lag+time.">Computerized analysis of tumor cells flowing in a parallel plate chamber to determine their adhesion stabilization lag time.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 26, 88-98 (1993).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium.">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009-e1009 (2009).</li><li>Kaper, H. J., Busscher, H. J., Norde, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+poly(ethylene+oxide)+brushes+on+glass+surfaces+and+adhesion+of+Staphylococcus+epidermidis.">Characterization of poly(ethylene oxide) brushes on glass surfaces and adhesion of Staphylococcus epidermidis.</a> J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 14, 313-324 (2003).</li><li>Bakker, D. P., Plaats, A. v. a. n. d. e. r., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces.">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).</li><li>Angelos, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+adhesion+of+umbilical+cord+blood+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+shear+stress.">Dynamic adhesion of umbilical cord blood endothelial progenitor cells under laminar shear stress.</a> Biophys. J. 99, 3545-3554 (2010).</li><li>Baker, G. R., Sullam, P. M., Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+fluorescent+method+to+internally+label+platelets+suitable+for+physiological+measurements.">A simple, fluorescent method to internally label platelets suitable for physiological measurements.</a> Am. J. Hematol. 56, 17-25 (1997).</li></ol>

Produktions-und Free Access dieses Video-Artikel ist von Cole-Parmer Instrument Co. gesponsert

Unsere Flow-Schaltung und Flusskammer es uns ermöglichen, adhärente Zellen, z. B. EPC, definiert Flüssigkeit Schubspannungen Thema. Da die Kammer oben und unten sind transparent, Zelladhäsion und Morphologie kann entweder in Echtzeit ausgewertet werden, durch die Kammer selbst, oder nach einer Flow Experiment und Demontage der Flusskammer. An diesem Punkt können die Zellen unter sterilen Bedingungen geerntet und entweder neu verchromt oder verwendet werden, um ihre DNA oder RNA, etc., zur weiteren Analyse zu sammeln. Um dies zu erreichen laminare Strömung, muss der Aufbau der Kammer sein, dass mehrere Bedingungen erfüllt sind. Erstens muss die Strömung laminar, die durch die Berechnung ihrer Reynolds-Zahl (Re), die das Verhältnis der Trägheitskräfte zu viskosen Kräften überprüft werden kann. (Wenn viskosen Kräfte dominieren, ist Re klein und die Strömung laminar oder &quot;voll entwickelt&quot; - in der Regel für Re &lt;2300.Wenn Trägheitskräfte überwiegen, die Strömung mehr und mehr zufällig wird, bis es turbulent wird, wie es der Fall für Re&gt; 4000). Wir berechnen Re nach Gleichung 3 8, <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" /> Wo ρ die Dichte der Flüssigkeit ist, Q die Flussrate, μ die Viskosität ist, werden w und h die Breite und die Höhe der Kammer, bzw., und D h ist der hydraulische Durchmesser, definiert nach Gleichung 4 8, <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" /> Die Reynolds-Zahl von unseren drei Strömungskammern, mit Höhen zwischen 166 bis 267 mu m, Reichweite von 13,9 bis 34,6 bei Flussraten cerechnet zu einer Schubspannung von 15 dyn / cm 2 zu erhalten. Bei Flussraten für eine Schubspannung von 100 dyn / cm 2 berechnet, lagen die Reynolds-Zahl der Kammern von 90,4 bis 234. Alle diese Reynolds-Zahlen sind viel niedriger als 2300 und das Kriterium für die laminare Strömung. Zweitens, für die Geschwindigkeit ein und Schubspannung werden unabhängig von der Entfernung entlang der Strömungskanal (dh voll entwickelten), der Abstand von der Fluideinlass zu rutschen muss länger sein als der Eingang Länge, L e. Dies kann durch die Berechnung der Eingang Länge zufrieden sein, nach Gleichung 5 9. <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" /> Für die oben aufgeführten Werte liegt der Eingang Länge von 0,01 bis 0,25 cm. Drittens, um sicherzustellen, dass die Geschwindigkeit und Schubspannung in der seitlichen Richtung nicht ändernwesentlich von dem Wert für eindimensionale Gerinne (Δ Ph / 2L), muss das Verhältnis h / w sehr viel weniger als 1 ist. Für den durchschnittlichen Wandschubspannung unter zweidimensionalen Strömungsverhältnisse zu 95% der Wandschubspannung unter eindimensionale fließen kann, muss h / w gleich 0,10, und für die Wandschubspannung unter zweidimensionalen Strömungsverhältnisse zu sein 97,5% der Wandschubspannung unter eindimensionale fließen kann, muss h / w gleich 0,05. Mit den Dimensionen unserer konzipiert Flusskammer 1,7 cm in der Breite und 166 bis 267 mu m Höhe, sind diese Kriterien erfüllt. Der Druck wird nur unterschiedlich in der Fließrichtung, wenn es keine seitlichen Druckgradienten am Eingang sind. Dies kann unter Verwendung von Farbstoffen oder Partikel in den Strömungsweg werden. Weitere, für die stetigen Versuche, ist ein Pulsationsdämpfer in den Fluss Schaltung eingefügt. Die Pulsationsdämpfer nimmt den größten Teil der pulsgibt Auskunft über die durch die Rollenpumpe in der Schaltung, und ermöglicht es uns, etwa die Übernahme der stetigen Fluss. Zu beachten ist, sollte der Pulsationsdämpfer eingesetzt werden mit der Pumpe und Schlauch in der Schaltung verwendet, so dass es effektiv beseitigen können Pulsationen in den Förderstrom für die spezifischen Frequenzen der Rollenpumpe. In unserer Demonstration der Masterflex L / S Pulsationsdämpfer erreicht laminare Strömung, wenn auf der Druckleitung mit einem Masterflex L / S-Serie Pumpe (0 bis 600 RPMs) und I / P 26 Schläuche. Für pulsatilen Fluss kann eine programmierbare Pumpe verwendet, um verschiedene Wellenformen erzeugen. Für pulsatilen Fluss kann eine programmierbare Pumpe verwendet, um verschiedene Wellenformen erzeugen. Darüber hinaus ist die Schaltung so, dass Proben von Perfusat konzipiert leicht zu unterschiedlichen Zeitpunkten, ohne die Gefahr einer Verunreinigung der Zellen oder Flow Medium gesammelt werden. In unserem Beispiel ist die Konzentration von NO 2 - wurde durch Chemilumineszenz mit gemessenenein Ionics / Sievers Stickstoffoxid Analyzer (NOA 280, Sievers Instruments, Boulder, CO), wie zuvor 10 beschrieben. Das Reduktionsmittel für Nitrit-Analyse verwendet wurde Kaliumiodid in Essigsäure (14,5 M Essigsäure und 0,05 M KI), die das Reduktionspotenzial zu Nitrit zu NO konvertiert hat, aber nicht ausreicht, um einem höheren Stickstoffoxide wie Nitrat zu reduzieren und somit relativ spezifisch für Nitrit. Der Gesamtbetrag Nitrit produziert wurde als das Produkt der Konzentration produziert und das Gesamtvolumen der Schaltung berechnet während der Einstellung für die Lautstärke verloren während der Einnahme von Proben 6. Die folgenden Schritte sind entscheidend für die erfolgreiche Durchführung von Flow-Experimente: <ol class="lroman"><li> Es ist wünschenswert, um eine Blasenbildung während des Durchflusses Set-up zu vermeiden, da Blasen das Potenzial zum Abreißen Zellen von ihrer Oberfläche besitzen. Dies kann durch die Betreuung bei der Platzierung im oberen Teil der Flusskammer auf das Unterteil, das am besten vermieden werdenerreicht, indem sie beide parallel zueinander und Senken der Spitze auf den Boden in einer Bewegung ohne Anpassungen. Dabei kleinen Luftbläschen, die vorhanden sein und / oder variabel in den Strömungskanal kann, wird in den Blasenfallen an jedem Ende des Aluminium-Gehäuse abgeleitet werden. </li><li> Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass der Abfluss-Schlauch in den Behälter nach unten reicht, um das Reservoir der Unterseite. Andernfalls kann Luft in den Schlauch, die aus dem Reservoir in die Kammer führt, wenn das Perfusat sinkt leicht unter dem Schlauchende angesaugt werden. </li><li> Die Forscher sollten mit der Leitung von der Pumpe fließen, so dass die Pumpe nicht versehentlich in die entgegengesetzte Richtung mit Beginn der Strömung, die würden in Luft in den Kreislauf und gesaugt Ergebnis führen. </li><li> Zur Vermeidung der Bildung von Schaum (wegen denaturierter Proteine ​​im Serum enthalten sind), raten wir Absenken der Rohre, die von der Kammer zum Reservoir führt zu etwa einem Zentimeter über dem perfusate Ebene innerhalb des Reservoirs. Allerdings halten sie über den Fluss mittlerer Ebene können Sie fließen in das Reservoir während des Experiments zu überprüfen. </li><li> Beim Einschrauben der Kammer Teile zusammen, ist es wichtig, fest zu ergreifen das Gehäuse mit einer Hand während des Betriebs der elektrischen Schraubenzieher mit der anderen Hand. Beachten Sie, dass die Bewegung der elektrischen Schraubendreher in Drehmoment, welches das Potenzial zu &quot;werfen die Kammer rund &#39;, wenn die Schraube angezogen hat, wird übersetzt werden. </li><li> Zur Vermeidung von Druckwellen die Bildung von in der Schaltung und heben Zellen aus ihrer Oberfläche, sicherzustellen, dass alle Hähne offen vor Beginn der Strömung sind. </li><li> Besonders für längerfristige Flow-Studien (&gt; 48 Stunden) empfehlen wir die Verwendung der härter und widerstandsfähiger Schlauch in den Pumpenkopf eingesetzt werden, um zu verhindern Bruch der Rohre. </li><li> Es ist möglich, dass der Schlauch &quot;wandert&quot; im Innern der Pumpe Kopf durch schlecht eingestellten Pumpenkopf Zähne. Deshalb empfehlen wir, mit Aufmerksamkeit, wie die WanneIng. ist in den Pumpenkopf gesichert und Kennzeichnung jedes Ende des Schlauches mit einem Filzstift, so dass Sie leicht feststellen, ob der Schlauch &quot;eingezogen&quot; oder verdrängt während des Experiments. </li><li> Immer sorgfältig prüfen jeden einzelnen Anschluss der Schaltung und Kammer vor Beginn der Perfusion, um Austreten von Perfusat während eines Experiments durch eine fehlerhafte Verbindung zu verhindern. Dies ist besonders wichtig für die Zu-und Abfluss-Anschlüsse der Pulsationsdämpfer! </li><li> Denken Sie daran, Belichtung Limit, wenn Sie Fluoreszenzmarkierungen verwenden. </li></ol> Eine mögliche Einschränkung unserer Flusskammer ist, dass die Höhe von der Höhe des Kanals maschinell in die Aluminium befestigt ist. Dies hat jedoch den Vorteil, nicht zu überprüfen, und stellen Sie die Höhe des Kanals vor jedem Experiment und vereinfacht somit die Schubspannung Berechnungen lediglich die Anpassung der Pumpenleistung auf den gewünschten Wert. Abhängig von Ihrer Forschungsziele, kann es wünschenswert sein,Erhöhung der Schubspannung ohne Erhöhung Pumpendrehzahl. In diesem Fall werden wir die Erhöhung der Perfusat die Viskosität zu empfehlen, indem z. B. Dextran, um das Medium 11. Eine mögliche Einschränkung der Strömung Schaltung ist die große Menge des verwendeten Mediums, was problematisch sein kann, wenn versucht wird, um sehr kleine Konzentrationen von Zelle Metaboliten zu quantifizieren. Obwohl hier nicht gezeigt, ist es möglich, eine deutliche Senkung der Schaltung Volumen durch einen kleineren Behälter und Pulsationsdämpfer und Abnahme Schlauch Länge und Durchmesser. Darüber hinaus gibt es mehrere andere kommerziell erhältliche Systeme, die verwendet werden, um Flüssigkeit Schubspannung an Zellen in Kultur gelten kann. Mikrofluidik-basierten Systemen, wie zB die BIOFLUX System von Fluxion, ermöglichen die gleichzeitige Analyse von Zellen in verschiedenen mikrofluidischen Strömungskanäle mit Lösung in Well-Platten, die als Input-und Output Reservoirs für diese Kanäle 12,13,14 geladen. Doch diese und andere Mikro-Fluidik-Systeme sind nicht kompatibel mit Standard-Mikroskop-Objektträger und nicht für die Wiederherstellung einer ausreichend großen Anzahl von Zellen für weitere Experimente, wie z. B. RT-PCR oder Western Blot zu ermöglichen. Außerdem sind sie weniger benutzerfreundlich, kostengünstig ein Minimum von $ 40.000 und kann insgesamt mehr als $ 100.000 zu erreichen, abhängig von Zusatzgeräten. Zwei macrofluidic Systeme aus der Flexcell International Corporation, die Flexcell Streamer und die FlexFlow Systeme wurden erfolgreich eingesetzt, um Endothelzellen 15,16,17, menschliche Zellen Ringraum 18 und Fibroblasten 19 unter Strömung Bedingungen zu studieren. Ein drittes System, erhältlich durch GlycoTech, wurde verwendet, um Tumorzelladhäsion 20 und Leukozytenadhäsion 21 bis endothelialen Monolayer zu studieren. Die Streamer-System ermöglicht mehrere Seiten unter den gleichen Schubspannung Bedingungen auf einmal ausgeführt werden, aber es fehlt ein Sichtfenster und - im Gegensatz zu unserenDesign - nicht für Echtzeit-Visualisierung von Zellen unter fließen zu lassen. Die FlexFlow System hat ein Sichtfenster, sondern erfordert eine aufrechte Mikroskop, das nicht dem Standard-Mikroskop in den meisten Labors verwendet werden könnte. Weiterhin erfordert die FlexFlow System einer Zelle beschichtete Deckglas invertiert, wenn in die Strömungskammer platziert werden. Dies schließt Visualisierung von fluoreszierenden Zellen auf einer undurchsichtigen Oberfläche, wie Titan-beschichteten Gläsern, die wir zeigen in unserer Studie. Schließlich müssen die spezialisierten Deckgläser speziell für den FlexFlow System, das in der multi-Tausend-Dollar-Preisklasse ist, ähnlich wie die Flexcell Streamer-System erworben werden. GlycoTech bietet runden und rechteckigen Platte-Platte Strömungskammern, die deutlich weniger teuer, aber gefertigt aus Acryl, die nicht bequem Stammzellen wie unsere Kammer autoklaviert werden. Zu beachten ist, an andere Strömungskammern, die beschrieben worden sind autoklavierbarerscheinen nicht praktikabel, weil sie spezielle mikroskopische Linsen 22,23 erfordern. Die GlycoTech System nutzt Silizium Gummidichtungen zwischen oberen und unteren Platten dazwischen, die in der Dicke bei wiederholter Anwendung zu ändern und wird sich daher ändern Kammer Höhe im Laufe der Zeit (der Hersteller empfiehlt den Kauf neuer, nachdem alle zehn verwendet). Unsere Aluminium-Kammer mit integriertem O-Ringe ermöglicht eine vollständige Gegenüberstellung von oberen und unteren Platten und sorgt für eine konstante Kammer Höhe zwischen den Experimenten. Schließlich sind Vakuumpumpen erforderlich sind, um eine auslaufsichere Dichtung in vielen Flusskammer Designs, einschließlich der GlycoTech Kammern, die nicht in unser Design notwendig zu erreichen. Während hier nicht gezeigt, kann die Flusskammer unter einem Mikroskop während des gesamten Flow Experiment zur Echtzeit-Bildgebung von Zell-Adhäsion und / oder Verhalten gehalten werden. Wenn dies gewünscht ist, empfehlen wir die Verwendung einer Wärmelampe oder ein Heizkissen unter die Kammer zu dem Perfusat Temperatur bei 37 ° C zu halten Pelzdort können die Rollenpumpe mit einer Spritze Pumpe ersetzt werden, wenn keine &quot;Rückführung&quot; von Zellen oder Metaboliten oder Prüfpräparate oder Agenten 24 gewünscht wird. Es ist auch möglich, unterschiedlich markierter Zellen über adhärente Zellen, z. B. fluoreszierende Thrombozyten über eine Schicht von konfluenten EPCs (mit Hilfe der Thrombozyten-Assay durch Achneck et al. 6,25) fließen, um Zell-zu-Zell-Interaktion unter Schubspannung bewerten. Unsere Flusskammer kombiniert wertvolle Funktionen von anderen verfügbaren Strömungskammern, wie ein Perfusat Probenahme-Port und ein Sichtfenster und hat den wichtigen Vorteil der Kompatibilität mit einer umgekehrten oder aufrechten Mikroskop. Es ist voll autoklavierbar und ermöglicht wiederholten Versuchen bei konstanter Kammer Höhe und ohne die Notwendigkeit von Vakuumpumpen, um eine dichte Abdichtung zu erreichen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Produkte / Reagenzien </td><td> Firma </td><td> Product # </td></tr><tr><td> 10 ml Spritze </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07940-12 </td></tr><tr><td> 1-Way Stopcoks </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-00 </td></tr><tr><td> 30 ml Spritze </td><td> BD Medical </td><td> 309650 </td></tr><tr><td> 4-Way Hähne </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-04 </td></tr><tr><td> Aluminum Alloy </td><td> N / A </td><td> 6061 </td></tr><tr><td> Cell-Culture Dishes (4-gut, rechteckig) </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 267061 </td></tr><tr><td> Zell-Tracker orange </td><td> Invitrogen </td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Research Organics </td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM-2 Singlequots </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Female Luer-Adapter </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> SI-45500-04 </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> Sigma </td><td> F0895-2MG </td></tr><tr><td> Glasflasche (250ml) mit Cap </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 34594-24 </td></tr><tr><td> Harte Tubing </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06508-16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td></tr><tr><td> Histopaque </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td></tr><tr><td> Hoechst Färbelösung </td><td> Sigma </td><td> H6024 </td></tr><tr><td> Hyclone FBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Lonza </td><td> 17-605E </td></tr><tr><td> Luer-Adapter </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> EW-45505-04 </td></tr><tr><td> MCDB-131, 1x Medium </td><td> CellGro </td><td> 15 bis 100-CV </td></tr><tr><td> Barbed Polypropylen Fittings </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06365-90 </td></tr><tr><td> O-Ringe </td><td> N / A </td><td> AS568A </td></tr><tr><td> Pulse-Dämpfer </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07596-20 </td></tr><tr><td> Pump-Drive (Masterflex L / S mit variabler Drehzahl Sparkurs) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 7524-40 </td></tr><tr><td> Pump-Head (Masterflex Easy Load Pumpenkopf) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07518-60 </td></tr><tr><td> Rutsche </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 48500-00 </td></tr><tr><td> Soft-Tubing </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 96400-16 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Spritzenfilter </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 02915-12 </td></tr><tr><td> Sytox orange Nucleic Acid Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S-11368 </td></tr><tr><td> Trypsin EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Trypsin neutralisierende Lösung </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td></tr></tbody></table>

parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, eine Technik, um anhaftenden Zellen zu Laminar-Flow-Bedingungen unterliegen und bewerten ihre Reaktion auf gut quantifizierbar Flüssigkeit Schubspannungen 1 beschreiben. Unsere Flow-Design und Flow-Schaltung (Bild 1) enthält eine transparente Anzeige Region, die Erprobung von Zell-Adhäsion und Bildgebung von Zell-Morphologie ermöglicht unmittelbar vor Strömung (Abb. 11A, B), zu verschiedenen Zeitpunkten während der Strömung (Abb. 11C) und nach Strömung (Abb. 11D). Diese Experimente sind mit humanen Nabelschnur dargestellt Blut gewonnene endothelialen Vorläuferzellen (EPC) und Schweinen EPCs 2,3. Diese Methode ist auch anwendbar auf andere Anhänger Zelltypen, wie zB glatten Muskelzellen (SMC) oder Fibroblasten. Die Kammer und alle Teile der Schaltung sind leicht mit Dampf Autoklavieren sterilisiert. Im Gegensatz zu anderenKammern, kann z. B. Mikrofluid Kammern, eine große Anzahl von Zellen (&gt; 1 Mio. je nach Größe der Zellen) nach dem Flow Experiment unter sterilen Bedingungen für die Zellkultur oder andere Experimente, zB DNA-oder RNA-Extraktion oder Immunhistochemie (Abb. 11E) wiederhergestellt werden, oder Rasterelektronenmikroskopie 5. Die Schubspannung kann durch Variation der Strömungsgeschwindigkeit des Perfusat, der Viskosität der Flüssigkeit oder des Kanals in Höhe und Breite angepasst werden. Letzteres kann zu reduzieren Flüssigkeitsvolumen oder Zelle muss gleichzeitig sicherstellen, dass eindimensionale Tempo beibehalten wird. Es ist nicht notwendig, Kammer Höhe zwischen den Experimenten zu messen, da die Kammer Höhe nicht auf die Verwendung von Dichtungen, das erhöht die Leichtigkeit von mehreren Experimenten ab. Darüber hinaus das Schaltungsdesign leicht ermöglicht die Sammlung von Perfusat Proben für die Analyse und / oder Quantifizierung von Stoffwechselprodukten von Zellen unter Schubspannung Exposition ausgeschieden, z. B. Stickstoffmonoxid (Abb. 12) 6 </sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress at JoVE.com

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Wir beschreiben eine Methode, um unter adhärenten Zellen eine laminare Strömung Schubspannung in einem sterilen kontinuierlichen Kreislauf. Die Zellen &quot;Haftung kann Morphologie durch die transparente Kammer untersucht werden, Proben aus der Schaltung für Metabolit-Analyse und-Zellen nach Scher-Belastung für zukünftige Experimente oder Kultur geerntet wurden.

Parallel-Platten-Flow-Kammer und Continuous Flow Circuit endothelialen Vorläuferzellen unter Laminar Flow Schubspannung Bewerten

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

parallel-plate-flow-chamber-continuous-flow-circuit-to-evaluate

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Civil Engineering

Bioengineering

Unit 1

Differential Analysis of Fluid Flow

SCIENTISTS IN ACTION

43.1K Aufrufe.  Duke University Medical Center. Wir beschreiben eine Methode, um unter adhärenten Zellen eine laminare Strömung Schubspannung in einem sterilen kontinuierlichen Kreislauf. Die Zellen "Haftung kann Morphologie durch die transparente Kammer untersucht werden, Proben aus der Schaltung für Metabolit-Analyse und-Zellen nach Scher-Belastung für zukünftige Experimente oder Kultur geerntet wurden.