Gli autori desiderano ringraziare Joe Owen nello strumento Biomediche e Centro di lavorazione per il suo instancabile impegno nella lavorazione e l&#39;assemblaggio delle parti flusso da camera e Matt Maudsley da Leica Microsystems per aiutare nelle tecniche di celle di immagine attraverso camere di flusso. Siamo in debito con Kevin Collins da Servizi perfusione Duke e il dottor Steve Wallace presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica per i suggerimenti utili su progettazione del flusso di circuito. Vorremmo anche ringraziare la National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program per il supporto Alexandra Jantzen e il NIH per il loro sostegno attraverso Grant &quot;rivestimento EPC autologhe per migliorare la biocompatibilità dei dispositivi di assistenza circolatoria&quot; RC1HL099863-01.

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Il nostro circuito di flusso e camera di flusso permettono di soggetto cellule aderenti, EPC per esempio, alle sollecitazioni di taglio fluido definito. Dal momento che la parte superiore della camera e in basso sono trasparenti, l&#39;adesione cellulare e la morfologia possono essere valutati sia in tempo reale, attraverso la camera stessa, o dopo un esperimento di flusso e lo smontaggio della camera di flusso. A quel punto, le cellule possono essere raccolte in condizioni sterili e sia ri-placcato, o utilizzati per raccogliere il loro DNA o RNA, ecc, per ulteriori analisi. Per ottenere flusso laminare, il design della camera deve essere tale che diverse condizioni siano soddisfatte. In primo luogo, il flusso deve essere laminare, che può essere verificata calcolando il numero di Reynolds (Re), che è il rapporto di forze inerziali a forze viscose. (Se le forze viscose predominano, Re è piccolo e il flusso è laminare o &#39;completamente sviluppato&#39; - di solito per Re &lt;2300.Se le forze inerziali predominano, il flusso diventa sempre più casuale fino a quando non è turbolento, come nel caso di Re&gt; 4000.) Possiamo calcolare Re secondo l&#39;equazione 3 8, <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" /> Dove ρ è la densità del fluido, Q è la portata, μ è la viscosità, w e h sono la larghezza e l&#39;altezza della camera, rispettivamente, e D h è il diametro idraulico, definito secondo l&#39;equazione 4 8, <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" /> Il numero di Reynolds delle nostre camere flusso tre, con altezze che vanno dal 166-267 micron, range 13,9-34,6 ai tassi di flusso calculated per ottenere un sforzo di taglio di 15 dyne / cm 2. A portate calcolate per un sforzo di taglio di 100 dyne / cm 2, il numero di Reynolds delle camere variava dal 90,4-234. Tutti questi numeri di Reynolds sono molto inferiori a 2300 e soddisfare il criterio di flusso laminare. In secondo luogo, per il campo di velocità e di sforzo di taglio deve essere indipendente dalla distanza lungo il canale di flusso (cioè completamente sviluppate), la distanza dalla presa di scorrere fluido deve essere più lungo rispetto alla lunghezza d&#39;ingresso, e L. Questo può essere soddisfatta calcolando la lunghezza d&#39;ingresso, secondo l&#39;equazione 5 9. <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" /> Per i valori di cui sopra, la lunghezza d&#39;ingresso varia 0,01-0,25 cm. In terzo luogo, al fine di assicurare che la velocità e lo stress di taglio in direzione laterale non varianosignificativamente dal valore di unidimensionale del flusso del canale (Ph Δ / 2L), il rapporto h / w deve essere molto minore di 1. Per il carico medio di taglio a parete sotto bidimensionale condizioni di flusso per il 95% della sollecitazione di taglio muro con una dimensione di flusso, h / w deve essere uguale a 0,10, e per lo sforzo di taglio muro sotto bidimensionale condizioni di flusso da 97,5% dello sforzo di taglio muro con una dimensione di flusso, h / w deve essere uguale a 0,05. Con le dimensioni della nostra camera di flusso progettato 1,7 centimetri in larghezza e 166-267 micron di altezza, questi criteri sono soddisfatti. La pressione varia solo nella direzione del flusso se non ci sono gradienti di pressione laterale all&#39;ingresso. Questo può essere valutato utilizzando coloranti o particelle nel percorso del flusso. Inoltre, per esperimenti di flusso costante, un attenuatore delle pulsazioni è inserita nel circuito del flusso. L&#39;attenuatore delle pulsazioni tira fuori la maggior parte della pulsatility causato dalla pompa rullo nel circuito, e ci permette di approssimare l&#39;ipotesi di flusso costante. Da notare che il attenuatore delle pulsazioni utilizzati devono essere compatibili con la pompa e il tubo utilizzato nel circuito, in modo che possa effettivamente eliminare pulsazioni nel flusso di output per le frequenze specifiche della pompa rullo. Nella nostra dimostrazione L / S Masterflex ammortizzatore di pulsazioni raggiunge flusso laminare quando utilizzato sulla linea di scarico con qualsiasi M / L pompa serie Masterflex (0-600 RPM) e I / P 26 tubi. Per un flusso pulsatile, una pompa programmabile può essere utilizzato per generare forme d&#39;onda diverse. Per un flusso pulsatile, una pompa programmabile può essere utilizzato per generare forme d&#39;onda diverse. Inoltre, il circuito è progettato in modo tale che i campioni di perfusato possono facilmente essere raccolti in tempi diversi senza rischio di contaminazione delle cellule o media portata. Nel nostro esempio, la concentrazione di NO 2 - è stata misurata mediante chemiluminescenza conuno Ionics / Sievers Analizzatore di ossido di azoto (NOA 280, Strumenti Sievers, Boulder, CO), come descritto in precedenza 10. Il riducente utilizzato per l&#39;analisi è stata nitrito di ioduro di potassio in acido acetico (14,5 M di acido acetico e 0,05 M KI), che ha il potenziale di riduzione di convertire nitrito di NO, ma non è sufficiente a ridurre eventuali ossidi di azoto superiore come il nitrato ed è quindi relativamente specifici per nitriti. Il nitrito importo totale prodotta è stato calcolato come il prodotto della concentrazione prodotta e il volume totale del circuito durante la regolazione del volume perso, mentre il prelievo di campioni 6. I seguenti passaggi sono fondamentali per la riuscita di esperimenti di flusso: <ol class="lroman"><li> È auspicabile per evitare la formazione di bolle durante il flusso di set-up, dal momento che le bolle hanno il potenziale per strappare le cellule dalla loro superficie. Questo può essere evitato facendo attenzione a quando si posiziona la parte superiore della camera di flusso sulla parte inferiore, che è megliocompiuta tenendo entrambe parallele l&#39;una all&#39;altra e abbassando la parte superiore sul fondo in un unico movimento senza modifiche. In tal modo, piccole bolle d&#39;aria che possono essere presenti e / o galleggiante nel canale di flusso, sarà deviato nelle trappole bolla alle due estremità del contenitore in alluminio. </li><li> E &#39;importante assicurarsi che il tubo deflusso nel bacino raggiunge fino al fondo del serbatoio è. In caso contrario, l&#39;aria può essere risucchiato nel tubo che porta dal serbatoio alla camera se il livello scende leggermente al di sotto perfusato fine tubo. </li><li> Il ricercatore deve avere familiarità con la direzione del flusso della pompa in modo che la pompa non accidentalmente correre nella direzione opposta con l&#39;inizio del flusso, il che si tradurrebbe in aria risucchiata nel circuito e da camera. </li><li> Per evitare la formazione di schiuma (a causa di proteine ​​denaturate contenute nel siero), si consiglia di abbassare il tubo che porta dalla camera al serbatoio a circa un centimetro al di sopra del perfusate livello all&#39;interno del serbatoio. Tuttavia, mantenendolo al di sopra del livello medio di flusso consente di verificare il flusso nel serbatoio durante l&#39;esperimento. </li><li> Al momento di collegare le parti della camera insieme, è importante afferrare saldamente la custodia con una mano durante l&#39;utilizzo del cacciavite elettrico con l&#39;altra mano. Si noti che il movimento del cacciavite elettrico si tradurranno in una coppia che ha il potenziale di &#39;scagliare la camera intorno&#39; una volta che la vite è serrata. </li><li> Per evitare la formazione di onde di pressione nel circuito e il sollevamento delle cellule i loro superficie, in modo che tutti i rubinetti sono aperti prima di iniziare il flusso. </li><li> Soprattutto per gli studi di flusso a più lungo termine (&gt; 48 ore) si consiglia di utilizzare il tubo più duro e più resistente di essere inserito nella testa della pompa per evitare rottura dei tubi. </li><li> E &#39;possibile che i tubi&#39; migra &#39;all&#39;interno della testa della pompa a causa di denti pompa mal regolata testa. Pertanto si consiglia attenzione a come la vascaING è fissato nella testa della pompa e la marcatura ogni estremità del tubo con un pennarello in modo tale che si può facilmente notare se il tubo è &#39;tirato in&#39; o staccato durante l&#39;esperimento. </li><li> Sempre verificare attentamente ogni singolo connettore del circuito e da camera prima di iniziare la perfusione al fine di evitare perdite di perfusato durante un esperimento a causa di un collegamento difettoso. Ciò è particolarmente importante per i connettori di afflusso e deflusso di smorzatori di impulsi! </li><li> Ricordatevi di limitare l&#39;esposizione alla luce se si utilizzano etichette fluorescenti. </li></ol> Una limitazione possibile della nostra camera di flusso è che l&#39;altezza è fissata per l&#39;altezza del canale lavorati in alluminio. Tuttavia, questo ha il vantaggio di non dover verificare e regolare l&#39;altezza del canale prima di ogni esperimento e semplifica quindi i calcoli sforzo di taglio, semplicemente regolando la portata della pompa al valore desiderato. A seconda degli obiettivi della ricerca, può essere auspicabileaumentare la tensione di taglio senza aumentare la velocità della pompa. In questo caso si consiglia di aumentare la viscosità del perfusato è, ad esempio l&#39;aggiunta di destrano al medium 11. Una possibile limitazione del circuito flusso è il grande volume di mezzo utilizzato, che può essere problematico quando si tenta di quantificare le concentrazioni molto piccole di metaboliti cellulari. Anche se non qui, è possibile ridurre considerevolmente il livello del circuito utilizzando un serbatoio più piccolo e attenuatore delle pulsazioni e diminuire lunghezza del tubo e il diametro. Inoltre, ci sono parecchi altri sistemi disponibili in commercio che possono essere utilizzati per applicare liquidi shear stress alle cellule in coltura. Microfluidica sistemi basati, ad esempio il sistema BioFlux da flussione, consentono analisi simultanea di cellule in diversi canali di flusso microfluidica caricato con soluzione in pozzetti in qualità di ingresso e di uscita serbatoi per questi canali 12,13,14. Tuttavia, queste e altre microsistemi fluidici non sono compatibili con vetrini da microscopio standard e non consentono il recupero di un numero sufficientemente ampio di celle per ulteriori esperimenti, come la RT-PCR o Western Blot. Inoltre, sono meno user-friendly, un costo minimo di $ 40.000 e possono raggiungere un totale di più di 100.000 dollari, a seconda del materiale accessorio. Due sistemi macrofluidic disponibili dall&#39;Aeroporto Internazionale di Flexcell Corporation, lo Streamer Flexcell ei sistemi FlexFlow, sono stati utilizzati con successo per studiare le cellule endoteliali 15,16,17, cellule umane anello 18 e 19 fibroblasti in condizioni di flusso del fluido. Un terzo sistema, disponibile attraverso GlycoTech, è stato utilizzato per studiare l&#39;adesione delle cellule tumorali 20 e l&#39;adesione dei leucociti da 21 a monostrati endoteliale. Il sistema Streamer consente diverse diapositive per essere eseguito nelle stesse condizioni di stress di taglio in una sola volta, ma manca di un valore e - a differenza dei nostridesign - non consente visualizzazione in tempo reale delle cellule in condizioni di flusso. Il sistema FlexFlow ha una finestra di visualizzazione, ma richiede un microscopio verticale, che potrebbe non essere il microscopio standard utilizzato nella maggior parte dei laboratori. Inoltre, il sistema FlexFlow richiede una cella rivestita vetrino per essere invertita, quando sono immessi nella camera di flusso. Questo impedisce la visualizzazione di cellule fluorescenti su una superficie opaca, come il titanio rivestita di vetro, che dimostriamo nel nostro studio. Infine, il copri-specialistici devono essere acquistati appositamente per il sistema FlexFlow, che si trova nella multi-mille dollari fascia di prezzo, simile al sistema Streamer Flexcell. GlycoTech offre circolari e rettangolari a piatti paralleli camere di flusso, che sono significativamente meno costoso, ma realizzati in acrilico, colato, che non possono essere comodamente staminali in autoclave come la nostra camera. Da segnalare, camere flusso altre che sono state descritte da autoclavabiliapparire impraticabile perché richiedono particolari lenti microscopiche 22,23. Il sistema utilizza GlycoTech guarnizioni in gomma di silicone interposto tra le piastre superiore e inferiore, che cambierà di spessore con l&#39;uso ripetuto e quindi modificare l&#39;altezza della camera nel corso del tempo (il produttore consiglia l&#39;acquisto di nuovi dopo ogni dieci usa). La nostra camera di alluminio con built-in o-ring permette di opposizione completa di piastre superiore e inferiore e garantisce un&#39;altezza costante camera tra esperimenti. Infine, pompe a vuoto sono necessari per ottenere una tenuta guarnizione in molti disegni camera di flusso, tra cui le camere GlycoTech, che non sono necessarie nel nostro design. Considerando che non qui, la camera di flusso può essere tenuta sotto un microscopio durante l&#39;esperimento intero flusso di imaging in tempo reale di adesione cellulare e / o comportamenti. Se questo è desiderato, si consiglia di utilizzare lampade a calore o un tappetino riscaldato sotto la camera per mantenere la temperatura perfusato a 37 ° C. Pelliccialì, la pompa rullo può essere sostituita con una pompa a siringa, se no &#39;riciclo&#39; di due cellule o metaboliti o farmaci sperimentali o agenti si desidera 24. E &#39;anche possibile flusso di cellule diversamente etichettato più di cellule aderenti, ad esempio le piastrine fluorescenti su uno strato di EPC confluenti (usando il test delle piastrine descritto da Achneck et al. 6,25) per valutare cellula-cellula interazione in condizioni di stress di taglio fluido. La nostra camera di flusso combina caratteristiche di valore delle altre camere di flusso disponibili, ad esempio una porta di campionamento perfusato e una finestra di visualizzazione e ha l&#39;importante vantaggio di compatibilità sia con un microscopio invertito o verticale. E &#39;completamente autoclavabile e permette di esperimenti ripetuti in altezza della camera costante e senza la necessità di pompe per vuoto ad ottenere una tenuta stagna.

<table border="1"><tbody><tr><td> Prodotti / reagenti </td><td> Azienda </td><td> Prodotto # </td></tr><tr><td> Siringa da 10 ml </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07940-12 </td></tr><tr><td> 1-Way Stopcoks </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-00 </td></tr><tr><td> 30 ml Siringa </td><td> BD Medical </td><td> 309650 </td></tr><tr><td> 4-Way Rubinetti </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-04 </td></tr><tr><td> In lega di alluminio </td><td> N / A </td><td> 6061 </td></tr><tr><td> Cell-Cultura Piatti (4-bene, rettangolare) </td><td> Thermo Scientific; Nunc </td><td> 267061 </td></tr><tr><td> Cellula Tracker Arancio </td><td> Invitrogen </td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Ricerca Organics </td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM-2 Singlequots </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Femmina Adattatore Luer </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> SI-45500-04 </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Sigma </td><td> F0895-2MG </td></tr><tr><td> Bottiglia di vetro (250 ml) con Cap </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 34594-24 </td></tr><tr><td> Tubi duro </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06508-16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td></tr><tr><td> HISTOPAQUE </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td></tr><tr><td> Hoechst Soluzione Stain </td><td> Sigma </td><td> H6024 </td></tr><tr><td> Hyclone FBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Lonza </td><td> 17-605E </td></tr><tr><td> Adattatore Maschio Luer </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> EW-45505-04 </td></tr><tr><td> MCDB-131, 1X Media </td><td> Cellgro </td><td> 15-100-CV </td></tr><tr><td> Raccordi in polipropilene spinato </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06365-90 </td></tr><tr><td> O-Ring </td><td> N / A </td><td> AS568A </td></tr><tr><td> Pulse-Dampener </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07596-20 </td></tr><tr><td> Pompa-Drive (Masterflex L / S azionamento a velocità variabile economia) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 7524-40 </td></tr><tr><td> Pompa-Head (Masterflex Facile testa della pompa di carico) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07518-60 </td></tr><tr><td> Scivolo </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 48500-00 </td></tr><tr><td> Tubo morbido </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 96400-16 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Siringa filtro </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 02915-12 </td></tr><tr><td> Sytox Nucleic Acid Orange Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S-11368 </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Tripsina soluzione neutralizzante </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td></tr></tbody></table>

parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di descrivere una tecnica per soggetto cellule aderenti alle condizioni di flusso laminare e valutare la loro risposta al taglio fluido ben quantificabili sottolinea 1. Il nostro design camera di flusso e flusso del circuito (Fig. 1) contiene una regione trasparente visualizzazione che consente la sperimentazione di adesione cellulare e l&#39;imaging di morfologia cellulare immediatamente prima del flusso (Fig. 11A, B), in vari momenti durante il flusso (Fig. 11C) , e dopo che il flusso (Fig. 11D). Questi esperimenti sono illustrate con cordone ombelicale umano derivati ​​dal sangue le cellule progenitrici endoteliali (EPC) e suina EPC 2,3. Questo metodo è applicabile anche ad altri tipi di cellule aderenti, ad esempio, cellule muscolari lisce (SMC) o fibroblasti. La camera e tutte le parti del circuito sono facilmente sterilizzati in autoclave a vapore. A differenza di altriCamere, ad esempio camere di microfluidica, un gran numero di cellule (&gt; 1 milione a seconda delle dimensioni della cella) può essere recuperato dopo l&#39;esperimento di flusso in condizioni sterili per colture cellulari o di altri esperimenti, come ad esempio l&#39;estrazione del DNA o RNA, o immunoistochimica (Fig. 11E), o microscopia elettronica a scansione 5. La tensione di taglio può essere regolata variando la portata del perfusato, la viscosità del fluido, o l&#39;altezza e la larghezza del canale. Quest&#39;ultima può ridurre il volume di liquidi o ha bisogno di cellule assicurando nel contempo che unidimensionale del flusso viene mantenuta. Non è necessario misurare l&#39;altezza della camera tra esperimenti, dal momento che l&#39;altezza della camera non dipende l&#39;uso di guarnizioni, che aumenta notevolmente la facilità di esperimenti multipli. Inoltre, il design del circuito consente facilmente la raccolta di campioni perfusato per l&#39;analisi e / o la quantificazione di metaboliti secreti dalle cellule del liquido sotto esposizione shear stress, ad esempio, l&#39;ossido nitrico (fig. 12) 6 </sup&gt;.

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Stiamo descrivendo un metodo per soggetto cellule aderenti alle sollecitazioni di taglio a flusso laminare in un circuito sterile flusso continuo. L&#39;adesione delle cellule &#39;, morfologia possono essere studiati attraverso la camera trasparente, campioni ottenuti dal circuito per l&#39;analisi metabolita e le cellule raccolte dopo l&#39;esposizione di taglio per gli esperimenti futuri o della cultura.

Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

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