Yazarlar minnetle Neil Whitehouse (TEFE, Higgins Makine Atölyesi), CNC işleme ile yaptığı yardım için kabul etmiş sayılırsınız. Ayrıca, biz Camtasia yardım için MATLAB programlama yanı sıra Kate İçecek ve Joseph Cotnoir (TEFE Akademik Teknoloji Merkezi) ile ona yardım için Adriana Hera (TEFE Bilgisayar ve İletişim Merkezi) teşekkür etmek istiyorum. Sophie Burke ve Jacleen Becker (TEFE Akademik Teknoloji Merkezi) tamamlayıcı video görüntüleri sağladı. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (R15 HL097332), UMass Tıp Fakültesi-TEFE Pilot Araştırma Girişimi, Amerikan Kalp Derneği (JZH Lisans Araştırma Bursu) ve Worcester Politeknik Enstitüsü (JZH ve kurumsal Yaz Lisans Araştırma Bursu tarafından finanse edildi ) MWR fon start-up.

1. Hücre tohumlama kalıp imalat 2 mm bir merkez sonrası çapı 15, yuvarlak tabanlı, anüler kuyuları oluşturmak için polikarbonat 1 / 2 &quot;kalın parça öğütülmesi ile başlayın. Öğütülmüş kanal 6 derin mm ve 3,75 mm geniş. Temizlik ve polikarbonat kalıp kuru. öğütme işlemi herhangi bir plastik pislikleri temizleyin. Mix polidimetilsiloksan tüm hava kabarcıkları ve polikarbonat kalıp üzerine dökmek için kür ajanı, gazını tabanının 10:1 oranını (w / w) (PDMS). Degas, herhangi bir kalan kabarcıklar tekrar kaldırmak ve 60 ° C&#39;de 4 saat boyunca fırında tedavi. Kürünü polikarbonat yavaş yavaş soyma tarafından dikkatle PDMS şablonu kaldırmak, su ve sabun ile yıkayın ve otoklav. Ayrıca iki yüzde agaroz (w / v) Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle orta (DMEM) içinde çözünmüş bir çözüm otoklavda. PDMS şablonu, düz bir yüzeye yerleştirin ve erimiş aga ile doldurun.<html> merkezi yazılan kalıp her birine ilk pipetleme agaroz yükseldi ve daha sonra etrafındaki uzaya pipetleme. Agaroz (yaklaşık 15 dakika) sağlamlaştırmak için izin ver, sonra PDMS agaroz serbest kalıp ters çevirin. Kuyuların her biri dört bir yanından gelen aşırı agaroz Kes ve agaroz kuyulardan 12 kuyucuğu içine yerleştirin. 2. Hücre kültürü ve halka tohumlama Kalıp üst kapsayan, agaroz kalıp dış çevresindeki hücre kültür ortamı (% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile DMEM) ekleyin. Inkübatör tabak yerleştirin ve hücreleri hazırlamak için yaklaşık 15 dakika denge sağlaması için izin verir. % 90 izdiham, sıçan aort düz kas hücreleri (rSMCs) trypsinize ve 5x10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon tekrar süspansiyon. Anüler agaroz kuyuların her birine hücre süspansiyonu her bir kuyunun hücreleri uygulamak için bir dairesel hareket kullanarak Pipet 100 mcL. içerik &quot;&gt; emin inkübatör raflar düzeyde olduğundan emin olun, sonra inkübatör tabak yerleştirin ve onları 24 saat boyunca rahatsız edilmeden oturmak için izin Exchange orta, her iki gün sonra iyi dört bir yanından gelen medya aspire, ve yeniden doldurma her bir kuyunun kadar agaroz tamamen sular altında. 3. Doku halka toplama ve kalınlık ölçümleri Bitiminde kültür merkezi yazılan üstünden kaydırarak agaroz kalıp halka çıkarın. Fosfat ile küçük bir Petri kabındaki halka koyun salin (PBS), merkez örnek tamponlu ve bir dijital görüntüleme sistemi kullanılarak bir görüntü elde. Kenar algılama için bir görüntü analiz programı kullanın ve çevresi yaklaşık 4 pozisyonları (üst, alt, sol ve sağ) halka kalınlığı ölçmek. Her bir halka için ortalama kalınlığı (t) değeri hesaplayın ve kesit alanı hesaplamak için bu değeri kullanın(2π (t / 2) 2). 4. Yüzük Mekanik test Yatay konumda çekme test makinesi (Instron EPS 1000) ayarlayın. 1N ± 1dk yük hücresi ve özel ince tel sardı (paslanmaz çelik tel bükme tarafından oluşturulan) takın. Iki ince tel kulpları halka örnek monte edin. Kancalar 5 mN dara yükü örnek uygulanana kadar uzatın. Kesit alanı (kalınlığı ölçümleri hesaplanan) girin ve ölçü uzunluğu kaydetmek. Ön döngüsü 10 mm / dak hızında dara yükü ve 50 kPa stres arasında 8 kez çalar. Sekizinci ön döngüsü sonra, 10 mm / dak &#39;da başarısızlığa çekin. Başarısızlık,% 40 oranında bir ölçüm sonraki yürürlüğe bir azalma olduğunu kaydetti. Her bir halka örnek için, nihai çekme gerilimi (UTS) ve başarısızlık gerginlik ölçmek ve elde edilen veriler maksimum Tanjant modülü (MTM) hesaplamak. 5. Doku halka olaraksembly doku tüpler imal Özel palplanşların yuvarlak dikdörtgen kesikler (2 cm x 3 cm) 5 cm polikarbonat diskler işlenmiştir. Bu disk ile birlikte iki sahipleri vidalı izin vermek için dişli delikler delin. Özel tüp sahipleri Otoklav ve ardından biyogüvenlik kabini ve boş bir Petri kabı yerine transfer. 1.9 mm çapında silikon tüplerin uçları Eğimli kenarları oluşturmak için bir açıyla kesmek ve sonra silikon tüpler otoklavda cerrahi makas kullanın. Tüpler otoklava edilirken, medya ile bir Petri kabı doldurun. Agaroz kuyulardan halkalar çıkarın ve medya ile Petri kabı koyun. Yeri kullanmadan önce ıslak aynı Petri kabındaki silikon tüpler otoklava. Bir silikon tüp kesik ucunu, bir halkanın merkezi içine yerleştirin ve hafifçe silikon tüp üzerine halka slayt forseps kullanın. Ri, istediğiniz numarayı tekrarlayınNGS. Birbiri ile temas halkaları hafifçe tüp boyunca her iki yönde de gittikçe onları iterek kaydırın. Bu yöntem, kültür sadece bir gün sonra hasat halkaları için kullanılabilir. Bir kez yüzük polikarbonat sahipleri içinde silikon tüpler hizalamak ve sahibinin iki parça birbirine vida monte edilir. 100 mm Petri kabındaki sahibi yerleştirin ve 55 ml medya ekleyebilirsiniz. Exchange medya her kültür süresi 3 gün. Doku tüpleri kaldırmak için, polikarbonat sahibinden silikon tüpler bırakın ve silikon tüp kapalı ve PBS ile dolu bir Petri kabı içine doku tüpleri slayt forseps kullanmak. 6. Temsilcisi Sonuçlar: Protokolü doğru yapıldığında, hücrelerin iç çapı ile ilgili kalıp sonrası 24 saat içinde çapına eşit bir doku halkaları oluşturmak için agrega. Halka kenarlar genellikle görünüş olarak düzgün ve (eğer kültüred), düz bir yüzey üzerinde tüm çevresi kalınlığı tekdüze. Doku çaldığında kolay ve daha sonraki mekanik ve histolojik analiz için kuyu (Gwyther et al, 2011 8) çıkarılabilir. Doku halka morfoloji, matris kompozisyon ve mekanik özellikler numaralı seribaşı hücrelerinin sayısı ve türüne göre değişir. , Hücre tipleri, değişen koşulları tohumlama ve kültür süresini doku halkaları Temsilcisi sonuçlar Tablo 1&#39;de gösterilmiştir. 5x10 5 rSMCs oluşturulan iki mm ID halkaları, bizim daha önce yayınlanmış 2 mm halkalar (6.6x10 5 rSMCs yapılan) oluşturulmuş bir yüzük daha yüksek UTS sergiledi. Sıçan hücreleri, insan düz kas hücreleri (HSMC) 8 kolayca doku oluşturmak için toplanmış kültürde sadece 14 gün (veriler gösterilmemiştir) sonra büyük miktarda kolajen içeren halkaları. İnsan mezenkimal kök hücreler (hMSC) toplanmış ve birbirine bağlı halkalar oluşmuş, ancak lacked mekanik dayanımı ve tek eksenli çekme testi ilk precycling aşamalarında kırdı. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td> Hücre sayısı </td><td> Kalınlığı (mm) </td><td> Kültür uzunluğu (gün) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> Arıza suşu (mm / mm) </td></tr><tr><td> rSMC halkaları </td><td> 6 </td><td> 660.000 </td><td> 0.94 ± 0.12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0.50 ± 0.08 </td></tr><tr><td> rSMC halkaları </td><td> 4 </td><td> 500.000 </td><td> 0.53 ± 0.02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0.88 ± 0.05 </td></tr><tr><td> HSMC halkaları </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0.51 ± 0.05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0.92 ± 0.08 </td></tr><tr><td> hMSC halkaları </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0.40 ± 0.07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Kültür parametreleri ve farklı hücre tipleri, tohum konsantrasyonları, ve kültür süreleri üretilen 2 mm halkaları mekanik özelliklerini gösteren tablo. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" /> Şekil 1 (A) doku halka oluşturma süreci şematik. (B) Özel öğütülmüş anüler kuyuları ile polikarbonat kalıp. Merkez yazılan çapları 2 mm. (C) polikarbonat kalıp uzak soyuldu sonra PDMS şablon. (D) Toplulaştırılmış doku halkası, 2 mm bir yazı ile bir agaroz kalıp kültür. PBS içinde (E) İki mm çapında doku halkası. Ölçek bar = 6 mm (B, C) ve 2 mm (D, E). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" /> Şekil 2 gerilme-şekil değiştirme eğrisi süreden Temsilcisi arsatek eksenli çekme testi CED.

<ol>
	<li>Roger, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2011+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li><li>Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering:+self-assembly+of+microtissue+building+blocks.">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).</li><li>Gauvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-step+self-assembly+approach+for+the+fabrication+of+tissue-engineered+vascular+constructs.">A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).</li><li>L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+blood+vessel+for+adult+arterial+revascularization.">Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization.</a> N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).</li><li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting.">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).</li><li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods,+tori,+and+honeycombs:+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries.">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).</li><li>Livoti, C. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+and+tissue+fusion+of+toroid-shaped+minimal+building+units.">Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).</li><li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells.">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).</li><li>Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+conditioning+of+collagen-gel+blood+vessel+constructs+induces+remodeling+in+vitro.">Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro.</a> Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).</li><li>Rowe, S. L., Stegemann, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+collagen-fibrin+composite+matrices+with+varying+protein+contents+and+ratios.">Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios.</a> Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).</li><li>Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. a. n., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+triggers+rapid+contraction+and+degradation+of+fibroblast-populated+collagen+lattices.">Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices.</a> J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).</li><li>Konig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+completely+autologous+human+tissue+engineered+blood+vessels+compared+to+human+saphenous+vein+and+mammary+artery.">Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery.</a> Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).</li><li>Mironov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Son zamanlarda, hücre tabanlı veya &quot;iskele-az&quot; doku mühendisliği yöntemleri iskele tabanlı doku mühendisliği yaklaşımları bazı sınırlamaları adresi artan bir ilgi olmuştur. Hücre kökenli dokuların hücreleri oluşturulur ve ürettikleri matrisi, onlar doğal olarak çok daha fazla hücre yoğunlukları içeren herhangi bir eksojen maddeler içermez ve tamamen insan hücreleri ve protein yapılabilir olduğunu verilmiştir. Vasküler greftler insan hücrelerinde yapılan eksojen iskeleleri olmaması (örneğin, patlama basınçları insan safen venler için 1600 mmHg göre 3400 mmHg) 12 önemli mekanik gücü elde edebilirsiniz. Vasküler dokularda hücre tabanlı gelişmiş hücre yoğunluğu ve mekanik dayanım, en güncel imalat yöntemleri (&quot;sac-bazlı mühendislik&quot; 3,4,12 veya &quot;bioprinting&quot; 5,13 gibi) gösterir rağmen geniş kültürünün bir süre (&gt; 3 ay) gerektiren veya 3D doku yapımı için özel ekipman. Hücre kökenli doku halka method Burada anlatılan kısa bir süre içinde ve özel ekipman kullanımı olmadan sağlam bir 3D doku yapıları oluşturmak için hızlı hücresel kendini montaj sağlar. Bu protokol, 2 mm iç çapı sıçan düz kas hücre kaynaklı doku halkaları oluşturmak için geliştirilen prosedürü. Bu örnekte, doku yüzük 7 gün için (daha sonra halka füzyon ve tüp oluşumu için ek bir 7 gün süreyle kültüre) kültüre edildi. Ancak, bir gün sonra hücre tohumlama gibi erken 2 mm sıçan (insan), düz kas hücre halkaları kuyulardan kaldırılır ve (örneğin, silikon tüpler üzerine, transfer) kullanım için yeteri kadar güçlü olabilir. Buna ek olarak, sadece orijinal polikarbonat kalıp sonrası çapı değiştirerek, değişen iç çaplarda (2, 4 ve 6 mm) ile sağlam doku halkalar bu yöntem ile oluşturulabilir. 8 Ayrıca, son beş 2 etkinleştirmek için polikarbonat kalıp tasarımı değiştirilmiş tek bir multi-kuyu agaroz kamara dökme mm tohumlama kuyu,PDMS ve agaroz daha az kullanır ve 6-plaka (veriler gösterilmemiştir) iyi bir sığar. Yazılan çaplı değişiklikler, iyi tohumlama genişlik, yuvarlak alt eğrilik yarıçapı, tohumlama kuyu, ya da tohum kuyuların derinliği sayısı sadece CNC CAD dosyası özellikleri değiştirerek değiştirilebilir. polikarbonat kalıp işleme. Sonunda, tek bir polikarbonat kalıp PDMS şablonları sınırsız sayıda imal etmek için kullanılan, ve her bir PDMS şablon temizlenir, otoklavlanabilir ve onlarca kez yeniden. Birincil sıçan SMC&#39;lere (Hücre Uygulamaları, R354-05), birincil insan koroner arter SMC&#39;lere (Lonza, CC-2583), birincil insan doku halkalar boyutu değiştirmenin yanı sıra, biz de dahil olmak, pek çok farklı hücre tipleri halkaları yaptık dermal fibroblastlar 11 (Dr George Pins cömert bir hediye, TEFE Biyomedikal Mühendisliği Bölümü), sıçan akciğer fibroblastlar (RFL-6, ATCC CCL-192) ve mezenkimal kök hücreler (Lonza PT-2501). Bu hücre tiplerinin agrega ve doku halkaları oluşturmak için merkezi Mesajları etrafında sözleşmeleri her hücresel organizasyonu, ECM, kompozisyon ve yapıları mekanik özellikleri her hücre tipi için farklı olsa da. Her bir hücre tipi için ekim parametreleri deneysel hücrelerinin büyüklüğü ve yeteneklerini agrega göre tespit edilmelidir. Bu nedenle, hücre kökenli doku halkalar oluşturarak bu sistemi son derece çok yönlü ise, protokol farklı hücre tipleri ile uygun doku oluşumu için ufak ayarlamalar gerekebilir. Doku halka geometri, açıklandığı gibi, tek eksenli çekme testi ile doku malzeme özellikleri, kolay yükleme ve değerlendirme kolaylaştırır. Damar kasılması ve fizyolojik fonksiyonu ölçmek için kan damarı halkanın kullanmak için önemli bir emsal de yoktur. Hazırlık çalışmaları hücre kökenli doku halkaları farmakolojik yanıt ölçümü için bir tel myograph cihazı monte edilebilir olduğunu gösterir vekasılma kuvveti nesil (veriler gösterilmemiştir). Toplamda, yeteneği, histolojik, mekanik, fizyolojik ve biyokimyasal analiz için hızlı bir şekilde kendi kendine monte hücre halkaları imal sağlığı ve hastalıkları, vasküler doku yapısı ve fonksiyonu modelleme için yararlı olabilecek yeni ve güçlü bir araç göstermektedir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog # </th></tr><tr><td> Polidimetilsiloksan (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Lonza </td><td> 50000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15-017-CV </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> PAA </td><td> A05-201 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Mediatech </td><td> 30-002-CI </td></tr><tr><td> Dijital görüntüleme sistemi </td><td> DVT Corporation&#39;ın </td><td> Model 630 </td></tr><tr><td> Tek eksenli test makinesi </td><td> Instron </td><td> E1000 ElectroPuls </td></tr><tr><td> Edge Detection Yazılımı </td><td> DVT Corporation&#39;ın </td><td> Çerçeve 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering

Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde her yıl yüzlerce, binlerce hasta koroner arter bypass cerrahisi geçiren bu hastaların 1 yaklaşık üçte biri, hastalığın ilerlemesi ya da bir önceki hasat nedeniyle uygun otolog donör damarları zorunda değilsiniz . Vasküler doku mühendisliği amacı bu bypass greft için uygun bir alternatif kaynak geliştirmek için. Buna ek olarak, vasküler doku mühendisliği, kardiyovasküler hastalıklar çalışmada vasküler modelleri yaşayan gibi değerli ispat edebilir. Hücre tabanlı yöntemler geliştirilmesi ve analizi odaklanan pek çok yeni çalışmalar ile mühendislik kan damarları için bazı umut verici yaklaşımlar incelenmiştir 2-5 Burada, biz hızla kullanılabilir 3D doku halkalar şeklinde kendini monte hücreleri için bir yöntem in vitro vasküler dokuların modeli. Bunu yapmak için, düz kas hücrelerinin süspansiyonlar yuvarlak dipli halkalı agaroz kuyulara numaralı seribaşı. Agaroz yapışkan olmayan özellikleri inci izine hücreleri uyumlu bir doku halkası oluşturmak için kuyunun merkezinde bir yazı, agrega ve sözleşme yerleşmek için 6,7 Bu halkalar, mekanik, fizyolojik, biyokimyasal ve histolojik inceleme için hasat önce birkaç gün süreyle kültüre olabilir . Biz bu hücre kökenli doku halkaları benzer süreleri (&lt;30 kPa) kültüre diğer doku mühendisliği vasküler yapıları için bildirilen değeri aşıyor 100-500 kPa nihai çekme dayanımı 8 verim olduğunu göstermiştir. 9,10 sonuçları bu sağlam hücre göstermektedir kısa bir süre içinde elde edilen damar dokusu halka nesil ve hücreleri ve vasküler doku yapısı ve işlevi hücre kaynaklı matriks (CDM) katkılarıyla doğrudan ve kantitatif değerlendirilmesi için bir fırsat sunmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering at JoVE.com

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Bu makalede, hücresel öz-montaj hücre kökenli doku halkaları oluşturmak için çok yönlü bir yöntem özetlemektedir. Düz kas hücreleri içine numaralı seribaşı halka şeklinde agaroz kuyuları agrega ve 7 gün içinde sağlam bir üç boyutlu (3D) dokular oluşturmak için sözleşme. Milimetre ölçekli doku halkaları mekanik test için elverişli ve doku montaj için yapı taşları olarak hizmet.

Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

directed-cellular-self-assembly-to-fabricate-cell-derived-tissue

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.8K Görüntüleme.  Worcester Polytechnic Institute. Bu makalede, hücresel öz-montaj hücre kökenli doku halkaları oluşturmak için çok yönlü bir yöntem özetlemektedir. Düz kas hücreleri içine numaralı seribaşı halka şeklinde agaroz kuyuları agrega ve 7 gün içinde sağlam bir üç boyutlu (3D) dokular oluşturmak için sözleşme. Milimetre ölçekli doku halkaları mekanik test için elverişli ve doku montaj için yapı taşları olarak hizmet.

Video: Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Biyomühendislik

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Doku Mühendisliği için elektrospinning Liflerin Postprodüksiyon İşleme

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kardiyak Doku Mühendisliği kılcal Kuvvetleri Litografi

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

İnsan 3D Doku Mühendisliği<em&gt; In vitro</em&gt; Tümör Test Sistemi

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Sandviç gibi mikroçevrelerde Hücre / Malzeme Etkileşimleri Harness

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.