CMOD Paketi, hücreleri çok yüksek hassasiyetle desenlenize ve 2d veya 3d olarak kültüre etmenizi sağlar. Bu, hücre-hücre etkileşimlerini ve motor yeni dokularının morfogenezini inceleme fırsatları açar. Bu tekniğin ana avantajı, diğer laboratuvarların benimsemesinin kolay olmasıdır, temiz bir oda, özel ekipman veya özel sentezlenmiş reaktifler gerektirmez.
Tek kullanımlık pipet kullanarak aldehit kaydırağı üzerine pozitif fotoğrafın küçük damlalarını bırakarak başlayın. Döndürme kodlayıcısını kullanarak 3000 RPM'de 3000 RPM'de döndürün, ardından fotoğraf direncini çapraz bağlamak için 1,5 dakika boyunca 100 santigrat derecelik bir sıcak tabağa yerleştirin. Slaydı sıcak plakadan çıkarın ve slaydın üzerine istediğiniz özelliklere sahip bir fotoğraf maskesi yerleştirin, bir cam parçasıyla tartın ve tüm kurulumu opak bir kutuya örtün.
Kurulumu iki dakika boyunca bir UV lamba ile ortaya koyun, slaytı geliştirici çözümüne üç ila beş dakika daldırarak geliştirin, ardından fazla geliştirici çözeltisini suyla durulayın, bir hava veya azot akışı altında kurutun. Fotoğraf litografisinin başarısını doğrulamak ve karanlıkta saklamak için bu ışığı mikroskop altında gözlemleyin. Slaytın her fotoğraf desenli bölgesine 20 mikromolar amin modifiye oligos çözeltisi bir damlacık ekleyin ve damlacığı bir pipet ucu kullanarak, dikkat ederek, kaydırağı çizmemeye dikkat ederek tüm bölgeye yayın, DNA çözeltisi tamamen kuruyana kadar slaydı 65 santigrat derece fırında pişirin, pişmiş slaydı ve 15 santimetrelik bir hücre kültür çanağını bir fume kaputuna yerleştirerek indirgeyici aminasyon yapın bir çalkalayıcı.
40 mililitre PBS'de 100 miligram sodyum boro hidritini hafifçe karıştırın ve yemeğe ekleyin. Ardından çalkalayıcıyı 15 dakika açın. Reaksiyondan sonra, bu slaydı iki kez% 0.1 sodyum dodecyl sülfatla yıkayın ve reakt edilmemiş DNA'yı çıkarın.
Daha sonra kaydırağı üç kez suyla yıkayın. Bu kaydırağı nitrojen veya hava akışı altında sürün. Son olarak kalan fotoğraf direncini kaldırmak için asetonla durulayın.
Metin el yazmasında açıklandığı gibi dört mikromolar evrensel bağlantı ve adaptör çözümü hazırlayın ve PBS'de 20 mikromolar evrensel bağlantı çözümü hazırlayın. Hücre peletini bir mililitre buz soğuk PBS veya serumsuz ortamda yeniden depolayarak hücre süspansiyonu hazırlayın ve bir ila 3 milyon hücreyi 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpü santrifüjüne aktarın. Dört dakika boyunca 160 kez G'de santrifüj.
Elde edilen hücre peletini 75 mikrolitre buz soğuk PBS veya serumsuz ortamda yeniden kullanın ve mikromolar evrensel çapa ve adaptör çözeltisi için hazırlanan 75 mikrolitre ekleyin. İyice karıştırın ve buz üzerinde beş dakika kuluçkaya yatırın, tüpe 15 mikrolitre evrensel ortak çapa çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın, ardından numuneyi buzda beş dakika kuluçkaya bırakın. Hücre süspansiyonundan fazla oligoları çıkarmak için, tüpe bir mililitre buz soğuk PBS veya serumsuz ortam ekleyin ve bir pipetle karıştırın.
Hücreleri 160 kez G'de dört santigrat derecede dört dakika santrifüjleyarak peletleyin, sonra süpernatantı atın. Bu adımı iki kez daha yineleyin. Mililitre başına en az 25 milyon hücreden oluşan yoğun bir hücre çözeltisi oluşturmak için hücreleri buz col PBS veya serumsuz ortamda yeniden kullanın, desen slaytını hafifçe eğin, ardından her akış hücresinin girişine bu hücre süspansiyonunun 25 mikrolitresini ekleyin.
PBS ve %1 BSA çözümünü prizden çıkararak hücre süspansiyonun PDM'lerin akış hücresini doldurmasını sağlar. Buzda veya oda sıcaklığında 30 saniye kuluçkaya yaslanın, slaytın çıkışından beş mikrolitre hücre süspansiyonu epire edin ve girişe geri ekleyin. Bunu akış hücresi başına 10 kez tekrarlayın.
Fazla hücreleri yıkamak ve hücre süspansiyonu çıkıştan toplamak için pbs veya serum içermeyen medyayı her akış hücresinin girişine hafifçe pipetlayın. Slaytta fazla hücre kalmayana kadar bunu iki ila dört kez tekrarlayın. 3d kültürü için% 2 DNA içeren bir hidro jel öncü çözeltisi hazırlayın ve her akış hücresinin girişine 50 mikrolitre ekleyin.
Hidrojel çözeltisini akış hücresine sürerek, çıkıştan fazla sıvıyı epire edin. Hidrojellerin ayarlanmasına izin vermek ve hücreler ile yüzey arasındaki DNA tabanlı yapıştırıyı ayırmak için slaytı 37 santigrat derecede 30 ila 45 dakika kuluçkaya bırakın. İki kuyu hazneli bir kaydırağa veya altı kuyu plakasına 50 mikrolitre hidro jel öncüsü ekleyin.
Pipet Her akış hücresinin her iki tarafında 10 mikrolitre PBS. Bir jilet kullanarak akış hücresinin tam uzunluğu boyunca dağıtın veya nokta cımbızı bulun ve PBS'nin hidro jelin altına hücum etmesi için akış hücrelerinin kenarlarını hafifçe kaldırın. Jilet kullanarak, slaydı ters çevirerek akış hücresini slaydın kenarına taşıyın ve akış hücresini jiletlinin üzerine inecek şekilde slayttan itin.
Kavisli forseps kullanarak jiletten akış hücresini seçin. Akış hücrelerini, hücreler altta olacak şekilde ters çevirin ve hidro jel öncü çözeltisinin damlacıklarının üzerine yerleştirin. Desen hücrelerini içeren hidrojelin hidrojel altlığına bağlanabilmesi için en az 30 dakika kuluçkaya yatırarak desen hücrelerinin tam gömülmesine neden olabilir.
Akış hücresini çıkarın ve tamamen medyaya daldırın. Akış hücresini kavisli tokslar kullanarak yavaşça iteleyin, ta ki ortaya çıkana ve ortama yüzene kadar, sonra atın. DNA nokta yapıştırmasının CMO etiketli hücrelere ölçülmesi artar.
CMO konsantrasyonunun bir işlevi olarak, üç deneyden ortalama ve standart sapma olarak temsil edilir. DNA desenleri macenta ve yapışmış CMO etiketli hücreler farklı CMO konsantrasyonlarında siyan olarak gösterilmiştir. Doğrusal bir DNA kalıbına yapışmış CMO etiketli huvecs ve LMO etiketli huvecs karşılaştırması burada gösterilmiştir.
Tek MDCKs desen VSC MOD paketi, ve maitre jel transfer kültür beş gün sonra çoğalmak ve polarize mümkün oldu. Çok katmanlı çok hücreli agregalar, ücretsiz CMO'larla etiketlenmiş alternatif hücre katmanları tarafından oluşturulmuştur. Birden fazla benzersiz hücre popülasyonu, yüksek hassasiyetle ve çapraz kontaminasyon olmadan birlikte desenlenebilir.
Bu protokolü denerken, hücrelerin DNA lekelerine yapışma fırsatlarını en üst düzeye çıkarmak için hücreleri slayda eklerken yoğun bir hücre süspansiyonu olması önemlidir.
