Yazarlar bu protokolün onun eleştirel yorumlar için Victoria Carpenter teşekkür ederim.

Bölüm I - yetişkin Aedes aegypti sivrisinekler RNAi-aracılı gen devirme. Deney genel bakış için Şekil 1&#39;e bakınız. 1. dsRNA Sentezi <ol><li> Ilgi ve kontrol dsRNAs genler karşı spesifik dsRNAs sentezlerler. Not: 3 &#39;özgü cDNA 2 sonu ve 5 de ekli T7 primer sekans ile&#39; de uç (5&#39;-GAC TAA TAC TCA CTA bulunan 300-500 baz çifti aralığında PCR parçaları için gelişmekte olan primerler önermektedir TAG GG-3 &#39;). Parçalarının tekliği BLASTN analizi 3 tarafından teyit edilmelidir. </li><li> DsRNA sentezlemek için transkripsiyon reaksiyonu için T7 RNA polimeraz kullanır Ambion Megascript T7 Yüksek Kapasiteli Transkripsiyon Seti (Ambion, reaktiflerin tablo) kullanın. Not: Benzer reaktifler ve kitler yerde mevcuttur. </li><li> DsRNA arındırmak için, Megascript kiti ile yönergeleri izleyerek lityum klorür ile hızlandırabilir. </li><li> Purificat sonraiyon, steril su içinde dsRNA pelet çözülür. Mikroenjeksiyon için yeterli viskozite sağlamak için, dsRNA konsantrasyonu 2 mg / ml geçmemelidir. </li></ol> 2. Enjeksiyon Hazırlık <ol><li> Basit bir mikro enjektör boruları, makas, metal bir iğne, bir 1 ml şırınga ve 1 ml&#39;lik plastik pipet (bkz. Şekil 2) kullanılarak inşa edilebilir. Boru uzunluğu ~ 40 cm kesilmelidir. Alternatif olarak, bir otomatik mikro enjektör gibi Drummond Nanojet II 4 olarak kullanılabilir. <ol><li> 2 ml ölçek işaretine şırınga ucu (iğne hub) kesin ve piston gelen lastik pistonu kaldırın. </li><li> Lastik pistonu ve yerine geri iğne hub kauçuk piston kafasına metal bir iğne kullanarak Punch bir delik. </li><li> Tüpün her bir ucunda bulunan iğne göbeği yerleştirin ve ağız parçası (alternatif olarak, bir 10 ml sy olarak kullanılacak diğer ucu bir 1 ml plastik bir pipet ucu, yerleştirmekRinge) enjeksiyon için gerekli hava basıncı üretmek için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Lastik pistonu deliğe bir cam kılcal iğne yerleştirin ve genişliği sıvı akmaya için yeterince büyük olduğunu bu nedenle iğne ucunu kırın. Not: iğne ucu optimal büyüklüğü ampirik olarak belirlenmelidir - iğne genişliği çok küçük ise iğne genişliği bu travma ve yüksek bir sivrisinek ölüm oranı ile sonuçlanacaktır çok büyük ise, bu nüfuz mümkün olacak sivrisinek dış iskelet. </li><li> Hazırlanan dsRNA numunedeki Submerge enjeksiyon iğne ve ağız parçası (ya da bir şırınga) ile sıvı kadar emerek bir iğne içine sıvı numune çizer. Not: Bu aşama (bkz. aşağıda) in vivo test protokolü diürez içinde kullanılan PBS tamponu, dahil olmak üzere, sivrisinekler içine enjekte edilir tüm sıvı reaktifler için aynıdır. </li></ol> 3. Sivrisinekler toplayın ve uyuştur <ol><li> Collecbir koleksiyon şişeye bir pille çalışan aspiratör ile t sivrisinekler. Toplama flakon üzerinde bir kap koyun ve sivrisinek uyutmak için temiz bir CO 2 ped şişe yerleştirin. Not: Alternatif sivrisinekler buz üzerinde anestezi olabilir. </li></ol> 4. Sivrisinek Enjeksiyon <ol><li> Toplama flakon açın ve doğrudan CO 2 pad üzerinde sivrisinekler yerleştirin ve sivrisinek anestezi kadar bekleyin. </li><li> Bütün erkek atın. </li><li> Enjeksiyon için daha kolay erişim için izin tarafında sivrisinek hizaya. </li><li> Yaralanmayı önlemek için bacak veya kanat tarafından sivrisinekler tut. Ayrıca ince bir fırça veya sivrisinek işlemek için tüy kullanabilirsiniz. </li><li> Ilk sivrisinek enjekte Hazır olduğunda, yavaşça forseps ile toraks bir tarafı desteklemek ve toraksın diğer tarafında (Şekil 2) içine iğne ucu takın. Bu kütikül ince bir bölümünü içine enjekte ve iğne bastırıyor önlemek için daha iyidirtoraks içine derin o. </li><li> Iğne yerleştirildikten sonra, sivrisineğin içine sıvı darbe. İstenen miktar, iğne içindeki sıvının menisküs gözlenerek belirlenebilir. Belirli bir birim için gerekli milimetre numarası cam kılcal iğne (πr 2 saat) ve silindir hesaplayarak hacmi tespit edilebilir. Tipik olarak enjeksiyon için kullanılan dsRNA arasında etkili bir miktarda 1 ug olup. </li><li> Sıvı sivrisinek enjekte edildikten sonra, iğne dikkatli bir şekilde geri çekilmesi. Göğüs dış kısmında büyük bir sıvı damla formları halinde, sivrisinek atılmalıdır. Ardından, sonraki sivrisinek ile bu işlemi tekrarlayın. </li></ol> 5.. Sivrisinek Kurtarma ve Depolama <ol><li> Enjeksiyon sonrası, depolama için bir konteyner içinde sivrisinekler yerleştirin. Örneğin, bir bira bardağı balmumu örgü karton kapak ile emniyete kaplama ile karton bardak (fincan çorba) dizildi. Kapak maruz kapsayan mesh için biçilmiş kaftan bir paya sahiptir. Bir kez tüm mosquitoes kaba konur, kuluçka için çevresel olarak kontrollü bir odaya kap ve bu tür örgü kaplama üstüne yerleştirilir% 20 sukroz batırılmış pamuk topları gibi bir besin kaynağı ile sivrisinekler sağlamaktır. In vivo diürez tayininde gerçekleştirmeden önce, her sivrisinek hidrasyon durumunu standardize etmek için 12 saat için bir su kaynağının dsRNA enjeksiyonlu sivrisinekler mahrum. </li><li> DsRNA-aracılı gen demonte bir verimlilik değişken olabilir. Gen suskunluğu enjeksiyon sonrası 1 gün başlayabilir ve enjeksiyon 4 sonra 6 gün öncesine kadar son verebilir. Maksimum geni elde etmek için portatif Optimal süre kullanılan her gen için deneysel olarak tespit edilmelidir. Biz devam etmeden önce Genel olarak, biz dsRNA enjeksiyonundan sonra 3 gün bekleyin. </li></ol> Bölüm II - vivo diürez deneyde yetişkin Aedes aegypti sivrisinekler Not: Bu protokol yazarlar tarafından geliştirilmiş vesarı humma da sivrisinek aquaporin proteinlerin RNAi aracılı devirme için kullanılan aegypti 1 Aedes. Bireysel sivrisinekler arasındaki değişkenliği önlemek için, sivrisinek gruplar olarak analiz edilmelidir. Teknik nedenlerden dolayı, biz tedavi başına 5 sivrisinek grupları tavsiye - sivrisinekler enjeksiyonundan sonra idrar salgılanmasını başlamadan önce ilk ağırlık ölçümü gerçekleştirmek için zaman sınırlı bir miktarda bulunmaktadır. 6. Sivrisinekler toplayın ve uyuştur <ol><li> Sivrisinekler toplama önce, analitik bir hassas terazi kullanılarak bir kap ile boş bir koleksiyon şişe ağırlığı kaydetmek. Bu, daha sonraki tüm şişeye ölçümler için kullanılacaktır. </li><li> Bir aspiratör ile tartılır toplama şişeye 5 dişi sivrisinekler toplayın. Toplama flakon üzerine kap yerleştirin ve sivrisinek uyutmak için birkaç saniye için CO 2 pad üzerinde bekletin. </li></ol> 7. İlk Ağırlık Ölçüm <ol><li> T alhassas dengesi kapaklı sivrisinekler içeren koleksiyon şişe koyarak 5 sivrisineklerin o başlangıç ​​ağırlığı ölçümü. </li><li> Sivrisineklerin ağırlığı ve kap ile birlikte şişeye toplama alarak ve kap ile boş bir koleksiyon şişeden ağırlığı çıkarılarak 5 sivrisineklerin grubunun kilo hesaplamak. </li><li> Toplama flakon açın ve sivrisinek ağırlığı kaydettikten sonra doğrudan CO 2 pad üzerinde sivrisinekler yerleştirin. Sivrisinekler kilo ölçümleri sırasında uyanmaya başlıyor, bu açılış ve pad üzerine sivrisinekler yerleştirmeden önce birkaç saniye CO 2 ped şişe ayarlayın. </li></ol> 8. Enjeksiyon Hazırlık <ol><li> RNAi-aracılı gen Knockdown protokolü verilen talimatları izleyerek mikro enjektör ayarlayın. </li><li> Mikro enjektör bir cam kılcal iğne yerleştirin ve iğne ucu koptu ve böylece genişlik sıvının yetecek kadar büyükakmasına uid. </li><li> Batmak PBS tamponu iğne ve enjeksiyon iğnesi içine tampon çekmek, bu protokolü kullanmak için istenilen miktarda her sivrisinek için PBS 1.25 ul olduğunu. Not: Bu tutar, bir dişi sivrisineğin 5 tarafından alınır kan plazması ortalama miktarı taklit eder. </li></ol> 9. Sivrisinek Enjeksiyon <ol><li> Mikro enjektör ile daha kolay erişim sağlamak için sivrisinek hizaya. </li><li> Iğne yerleştirildikten sonra, sivrisineğin içine PBS tamponu darbe. </li><li> Sıvı sivrisinek içine enjekte edildiğinde, bir damlacık göğüs dışına oluşturabilir. Bu damlacık dikkatle sonraki adım önce çıkarılması gerekiyor. </li><li> Sonraki sivrisinek bu enjeksiyon işlemi tekrarlayın. Deneyimi ile, sivrisinek yaşama oranı enjeksiyonundan sonra neredeyse% 100 olacaktır. </li></ol> 10. Tartım Sivrisinekler <ol><li> Enjeksiyonundan sonra yavaşça toplama şişe içinde sivrisinekler yerleştirmekve kap. Hassas dengesi kapaklı sivrisinekler içeren koleksiyon şişe koyarak 5 sivrisinek ilk ağırlık ölçümü atın. </li><li> Kapaklı sivrisinekler ve toplama şişeden ağırlığı alarak 5 sivrisineklerin grubu ağırlığı hesaplanabilir ve kap ile boş bir koleksiyon şişeden ağırlığı çıkartılır. Not: sivrisinekler CO 2 anestezi pad çıkarıldıktan sonra 2 dakika içinde idrar salgılamaya başlar, bu yüzden onlar salgılanmasını başlamadan önce kilo ölçümü almak önemlidir. </li><li> Bunlar idrar salgılamaya başlar küçük bir kapta sivrisinek yerleştirin. </li></ol> 11. İkinci ve sonraki Ağırlık Ölçümleri Not: sivrisinek Ağırlık ölçümleri 30 dakikalık aralıklarla alınmalıdır, ama bu atılımı oranlarına bağlı olarak kısa veya daha uzun aralıklarla ayarlanabilir. <ol><li> 30 dakika sonra, grou toplamakkap ile aynı toplama şişeye bir aspiratör ile 5 sivrisinek s. Hassas dengesi kapaklı sivrisinekler içeren koleksiyon şişe yerleştirerek sivrisinek sonraki ağırlık ölçümü alın. </li><li> Ölçümünden sonra, bir sonraki 30 dakika için aynı tutma kabı olarak sivrisinekler yerleştirin. </li><li> Bir zaman istenilen miktar için bu işlemi tekrarlayın. </li></ol> 12. Belirlenmesi Sivrisinek Boşaltım Oranı <ol><li> 5 sivrisineklerin grubu içine enjekte edildi sıvının miktarı hemen enjeksiyonundan sonra ağırlığı sivrisineklerin başlangıç ​​ağırlık çıkarılması ile hesaplanır. </li><li> , Belirli bir zaman noktasında sivrisineklerin grup tarafından salgılanan edildi idrar miktarı belirli bir zaman noktasında sivrisineklerin ağırlığından sivrisineklerin başlangıç ​​ağırlık çıkarılarak hesaplanabilir. </li><li> Belirli bir zaman noktasında atılım hızı divi hesaplanabilirSıvı enjekte edilen (Tablo 1) toplam miktarı, bu zaman noktasında atılır idrar ding miktarı. </li></ol> 13. Temsilcisi Sonuçlar Gen Knockdown RNAi-aracılı ve in vivo diürez tayininde Aedes aegypti sivrisinek diürez su kanallarının etkilerini incelemek amacıyla Hansen laboratuvar tarafından kullanılmıştır. Aedes aegypti Malpighi tüpleri tübüllerinde ifade Üç su kanallarının sivrisinekler 1 kontrole göre atılımı oranları üzerinde önemli etkileri olan nakavt edildi. Şekil 4 diürez testi Aedes aegypti ve Culex quinquefasciatus arasındaki atılımı oranlarını karşılaştırmak için kullanılan bir denemeyi temsilcisi sonuçlarını gösterir farklı sıcaklıklarda. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1.. 10 sivrisinekler ea RNAi / diürez testinin Akış Şeması. 5 grupch belirli bir gen için dsRNA ile enjekte edilir ve on sivrisinek başka beş gruba kontrolü dsRNA ile enjekte edilir. PBS ile 200 uM HgCl 2 enjekte sivrisineklerin başka bir grubu, bir pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Bunlar, sivrisinekler enjeksiyon öncesinde ve 3 saat boyunca otuz dakikalık aralıklarla enjeksiyonundan sonra tartılır. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. RNAi-aracılı gen demonte ve in vivo diürez deneyde basit bir mikro püskürtme cihazı. A. Cam kılcal iğneler enjeksiyon için kullanılır. Gri üçgen sivrisinek içine sıvı enjekte miktarını belirtmek için iğne çizilen milimetre artışlarla temsil eder. B. 1 ml şırınga mikro enjektör oluşturmak için kullanılır. Beyaz üçgen iğne merkezi temsil eder ve siyah üçgen şırınga içinde piston bağlı lastik piston başını temsil eder. C. hortuma ağızlığın bağlamak için kullanılmaktadırenjektör. Mikroenjeksiyon cihazın ağızlık olarak kullanılır D. 1 ml pipet ucu (mavi ucu). E. AD parçaları birleştirir mikroenjeksiyon aygıtı. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3479/3479fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Optimal sivrisinek enjeksiyon yerinde. A. Kadın Aedes aegypti sivrisinek göğüs büyük ölçekler arasında bir cam kılcal iğne ile enjekte. Siyah çubuk boyutu karşılaştırma için 1 mm gösterir. Dişi sivrisineğin toraks bir çizim B. ve beyaz noktalar sivrisinek Exoskeleton beyaz ölçekleri temsil eder. Enjeksiyon iğnesi delip noktalar arasında sivrisinek enjeksiyon sırasında ölüm oranını minimize etmek gerekir. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Tempera EtkileriCulex quinquefasciatus ve Aedes aegypti diürez üzerine Ture. diürez assay farklı sıcaklıklarda, sivrisinekler, Aedes aegypti ve Culex quinquefasciatus iki türü ile gerçekleştirildi. Enjeksiyon sonrası ilk bir saat içinde atılım oranı yüzde olarak verilmiştir. <table border="1"><tbody><tr><td> Grup </td><td> TARA (G) </td><td> enjekte değil (G) </td><td> enjeksiyon sonrası (G) </td><td> 1s sonrası enjeksiyon (G) </td><td> ortalama ağırlığı (mg) </td><td> miktarda enjekte (Ul) </td><td> miktarda atılır (Ul) </td><td> % Atılır </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 7.5938 </td><td> 7.6057 </td><td> 7.6104 </td><td> 7.6096 </td><td> 2.38 </td><td> 0.94 </td><td> 0.16 </td><td> 17.0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7.8252 </td><td> 7.8349 </td><td> 7.8415 </td><td> 7.8403 </td><td> 1.94 </td><td> 1.32 </td><td> 0.24 </td><td> 18.2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7.8896 </td><td> 7.9026 </td><td> 7.9077 </td><td> 7.906 </td><td> 2.6 </td><td> 1.02 </td><td> 0.34 </td><td> 33.3 </td></tr></tbody></table> In vivo diürez test sonuçları Tablo 1. Aedes aegypti. 4 de Aedes aegypti dişi sivrisinekler ile yapılan in vivo diürez tayininde ° C den Ham veri

<ol>
	<li>Drake, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+gene+family+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 5, e15578 (2010).</li><li>Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+quantitative+PCR+primer+location+for+short+interfering+RNA+efficacy+determination.">Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination.</a> Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).</li><li>Altschul, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).</li><li>Garver, L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+RNAi+Assays+in+Adult+Mosquitoes+(A.+gambiae).">Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae).</a> J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).</li><li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+1+Development,+Nutrition,+and+Reproduction.">Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction.</a> The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+of+rapamycin-mediated+amino+acid+signaling+in+mosquito+anautogeny.">Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+of+rapamycin-dependent+activation+of+S6+kinase+is+a+central+step+in+the+transduction+of+nutritional+signals+during+egg+development+in+a+mosquito.">Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).</li><li>Pannabecker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+the+Malpighian+Tubule.">Physiology of the Malpighian Tubule.</a> Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).</li><li>Dow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+Malpighian+tubule+function+from+functional+genomics.">New insights into Malpighian tubule function from functional genomics.</a> Comp Biochem Phys A. 150, S135 (2008).</li><li>Dow, J. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+Malpighian+tubule+from+functional+genomics.">Insights into the Malpighian tubule from functional genomics.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).</li><li>Lawson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VectorBase:+a+data+resource+for+invertebrate+vector+genomics.">VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics.</a> Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).</li><li>Beyenbach, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+mechanisms+of+diuresis+in+Malpighian+tubules+of+insects.">Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects.</a> J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).</li><li>Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+recording+of+excretory+water+loss+from+Musca+domestica+using+a+flow-through+humidity+meter:+hormonal+control+of+diuresis.">Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis.</a> Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).</li><li>Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+critical+for+in+vivo+fluid+excretion+post+blood+feeding.">Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding.</a> FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).</li><li>Hays, A. R., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+produced+by+the+vitellogenic+fat+body+and+accumulated+in+mosquito+oocytes.">A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes.</a> Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Kullanılan RNAi protokolü California Riverside 6,7 Üniversitesi&#39;nde Alexander Raikhel laboratuvarında geliştirilen ve Garver ve Dimopoulos 4 tarafından yayınlanan bir protokol benzer olmuştur. Bu video protokolü gösterildiği deneysel yaklaşım in vivo ortamda bir böcek diürez ilgili genler incelemek için kullanılabilir. Böcekler, Malpighi tüpleri tübüller, ve boşaltım organları diürez için &#39;basit&#39; bir model sistem olarak araştırmacıların nesillerin ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ya da ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 Yüksek Kapasiteli Kiti </td><td> Ambion, Inc </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> PBS tamponu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> Plastik boru </td><td> Yerel satıcı </td><td></td><td> PVC </td></tr><tr><td> 1 ml plastik pipet </td><td> VWR </td><td> 83007-376 </td><td> Mavi ucu </td></tr><tr><td> 1 ml şırınga </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Makas </td><td> Yerel satıcı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metal iğne </td><td> Carolina Biologicals </td><td> 654307 </td&gt; <td> Boyut 5 </td></tr><tr><td> Pad Fly </td><td> Genesee Bilimsel </td><td> 789060 </td><td></td></tr><tr><td> Pille aspiratör w / tahsilat flakon </td><td> UPMA Labs </td><td> ESYM 2000 </td><td></td></tr><tr><td> İnce uçlu forseps </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 14095 </td><td></td></tr><tr><td> Cam kılcal iğneler </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 1B200-6 </td><td></td></tr><tr><td> Stereo diseksiyon mikroskobu </td><td> Leica Microsystems </td><td> S6D </td><td></td></tr><tr><td> Analitik hassas denge </td><td> Mettler Toledo </td><td> AB54S </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84097 </td><td></td></tr><tr><td> Bir bardak bira kaplı karton bardak mumlu </td><td> Yerel satıcı </td><td></td><td> Üretici çorba bardak </td></tr><tr><td> Mesh net </td><td> Yerel satıcı </td><td></td><td> plastik sinek gazlı bez </td></tr></tbody></table>

rnai-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female aedes aegypti mosquitoes

Bu video protokolü bir böcek belirli bir gen devirme ve atılım hızı ölçmek için yeni bir biyoassay yapmak için etkili bir teknik gösterilmiştir. Bu yöntem, böceklerin diürez işlemi daha iyi anlaşılmasını sağlamak için kullanılan ve tek bir kan unu sıvı büyük miktarlarda kadar alabilmesi için olan bir kan-besleme eklem bacaklıların in diürez çalışmada özellikle yararlıdır edilebilir. In vivo diürez tayininde birlikte bu RNAi-aracılı gen Knockdown Aedes aegypti sivrisinek diürez 1 aquaporin genlerin RNAi aracılı Knockdown etkilerini incelemek için Hansen laboratuar tarafından geliştirilmiştir. Protokol iki bölüm halinde kurulum: ilk gösteri basit bir sivrisinek enjeksiyon cihazı nasıl oluşturacağını ve RNAi-aracılı gen devirme için sivrisinek toraks içine dsRNA hazırlamak ve enjekte nasıl göstermektedir. İkinci gösteri nasıl belirleneceği gösterilmektedirin vivo biyoassay bir kullanarak sivrisinekler atılımı oranları.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

Bu protokolü biz bir ile RNAi-aracılı gen susturulması birleştirmek<em&gt; In vivo</emIlgi genlerin etkilerini demonte çalışma&gt; diürez testi sivrisinek sıvı atılımı vardır.

RNAi-aracılı Gene Nakavt ve<em&gt; In Vivo</emYetişkin Kadınlar&gt; diürez Testi<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Sivrisinekler

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

rnai-mediated-gene-knockdown-vivo-diuresis-assay-adult-female-aedes

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

13.5K Görüntüleme.  New Mexico State University. Bu protokolü biz bir ile RNAi-aracılı gen susturulması birleştirmek In vivo diürez testi sivrisinek sıvı atılımı vardır.

Video: RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Bayan A. aegypti Sivrisinek içine dsRNA enjeksiyon

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Biyoloji

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Transgenik Sivrisinekler Edinme A. aegypti Embriyolar Mikroenjeksiyon

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Dang Enfeksiyonlar Sivrisinekler (A. aegypti) ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi için protokol

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Ae midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyon. aegypti Sivrisinekler

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

Farelerde Hızlı noninvaziv Lomber İntratekal enjeksiyon yoluyla Vivo siRNA&#39;nın Transfaksiyon ve Omurilik Gen demonte olarak

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

Yağ vücut Organ kültür sistemi içinde Aedes Aegypti, bir vektör Zika virüs

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Aedes aegypti sivrisinek enfekte Wolbachia ile bakımını yapma

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

24 Kuyu Doku Kültürü Plakası (EAgaL Plakaları) kullanılarak Aedes aegypti için Geliştirilmiş Doğurganlık ve Doğurganlık Tahlilleri

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Speed

Subtitles

RNAi-aracılı Gene Nakavt ve