We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.

1. Sentezi ve Hazırlama dsRNA <ol><li> Tanımlanabilen hedef dışı etkileri olduğu tahmin edilmektedir, ilgi konusu genin içinde (karşılık gelen dsRNA oluşturmak için), bir 200-800 bp&#39;lik demonte bölgeyi belirlemek (örneğin, başka bir gen içinde herhangi bir sekans homolojisi ≥18 bp) ve negatif bir kontrol (örn örneğin Escherichia coli, lacZ geni gibi, (GenBank Gen ID: 945.006) hedef böcek genomu içinde mevcut olmayan bir heterolog sekansı. Alternatif olarak, bu SRPN2 21,22 gibi kolayca görülen bir fenotip veren örneğin pozitif kontrol (kullanımı GenBank Gen ID:. 1270169) dsRNA hedef SRPN2 dizisi Michel ve ark tanımlanır (2005) 21.. Not: E-RNAi bu bölgelerin tanımlanması için ve oligonükleotit primerleri 23 tasarımı olan yöntem için yararlı olan bir açık kaynak biyoinformatik kaynaktır. </li><li> s gerçekleştirintandard PCR (örneğin, Taq DNA polimeraz 30-35 döngü kullanılarak gerçekleştirilmiştir), bir T7 yükseltici seri ile çevrili dsRNA sentezi şablonu elde etmek için genomik DNA ya da cDNA şablonu kullanılarak (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;) ve dsRNA hazırlanması devam edecek ve temiz-up üreticinin talimatlarına göre bir ticari in vitro transkripsiyon kiti kullanılarak. Kullanım SRPN2 PCR amplifikasyon koşulları ve An ve ark sunulan astar bilgi. (2011) 22. </li><li> 260 nm dalga boyunda mor ötesi emme spektroskopisi ile saflaştırılmış RNA amplikon verimlerinin nicelendirilmesi ve RNase-barındırmayan su içinde istenen konsantrasyona (örneğin, 3 ug / ml) olacak şekilde ayarlanır. <ol><li> düşük RNA konsantrasyonları giderme için, aşağı doğru, oda sıcaklığında bir vakum santrifüjde örnekleri iplik veya örnekleri liyofilize su ve küçük hacimlerde sulandırılması sıvı hacmini azaltır. Örnek liyofilizasyon için gereken süre olarak değişecektirilk numune hacimleri ve dsRNA konsantrasyonları üzerindeki. </li></ol></li><li> 1x TBE ve TAE ile hazırlanan% 2 agaroz jeli üzerinde dsRNA&#39;nın kalitesi ve uzunluğunu kontrol tamponu ve transkripsiyon reaksiyonu için kullanılan şablon DNA ile birlikte, etidyum bromür (EtBr) ile boyanmıştır. dsRNA şablon DNA daha yavaş göç edecek. Kalite ve uzunluk hiçbir non-spesifik dsRNA ürünler vardır temin ederek ve sırasıyla bir standart DNA markeri ürünler karşılaştırılarak tespit edilebilir. Not: EtBr güçlü bir mutajen ve buna göre ele alınmalıdır. Not: 3 mg / ml bir dsRNA konsantrasyonunda, numune 0.5 ul EtBr-lekeli agaroz jeli üzerinde görüntülenmesi için yeterli olandan fazladır. </li><li> gerekli olana kadar -20 ° C&#39;de dsRNA saklayın. alikotları dsRNA büyük miktarlar için hazırlanmalıdır birden çok donma / çözülme döngüleri, bozulmaya neden olabilir. </li></ol> 2. Hızlı Yeşil FCF Dye (FGD) Tüpler hazırlayın <ol><li> Hızlı Yeşil FCF boya sulandırmakRNase içermeyen su içinde% 0.1 (h / h) (çalışma çözelti) stok çözeltisi (≥85% boya içeriği) elde edilmiştir. </li><li> Pipet 1,5 ml mikrosantrifüj tüp dibine boya 1 ul. </li><li> Yaklaşık 3 saat 65 ° C ısıya bloğunda yer tüpler kullanmadan önce soğutmak için, en az 30 dakika süre ile oda sıcaklığında sıvı, daha sonra bir yerde tüplerin buharlaştırılması için. Bu kuru katı boya dsRNA tabanda çözeltide sulandırmak olur. </li></ol> 3. çekin Enjeksiyon iğneleri <ol><li> 10-30 um ucu çapına ısıtılmış bir iğne çektirmenin kullanarak borosilikat cam iğneler çekin. hayır Isıtıcı ayarı: Pull ayarları karşılık gelmektedir. = 100 1, Isıtıcı ayarı yok. 2 = 70. </li><li> iğne ince ucu zarar vermekten kaçınmak için, macun kalıp bir şerit üzerinde bir Petri kabındaki yatay tüm çekti iğne yerleştirin. Not: yöntemleri çekerek kılcal iğne Ek bilgiler Sıtma Araştırma ve Referans Reaktif Resource Center M daha ayrıntılı olarak bulunabilirR4 kılavuzu 24. </li></ol> 4. Enjeksiyon İstasyonu hazırlayın <ol><li> Gerekli malzemeleri toplamak: Cam microcapillary iğneler ince ucu, mikroenjektör, ince filtre kağıdı ve kalın filtre kağıdı, Petri, transfer pipetler, boya fırçası ve diseksiyon ışık mikroskobu çekti. </li><li> Mikroenjektör kılavuzunda belirtildiği gibi Mikroenjektör hazırlayın ve puls başına istenen hacme (örn puls başına 69 nl maksimum) enjeksiyon seviyesini ayarlamak. </li><li> Bir mikroskop altında manevra kolay bir platform üzerinde (örneğin, bir Strafor tüp raf düz tarafı), üstüne ince filtre kağıdı ile iki filtre kağıdı yaprak yığını ve kenarlarda bant ile sabitleyin. </li><li> buz üzerinde her dsRNA ayrı renkli boya tüpleri çözüm ve yerin 10 ul tekrar süspansiyon. </li></ol> 5. Enjeksiyon için Pupalar toplayın <ol><li> iyonu giderilmiş su, 10 ml ve toplama ~ 50, uçuk pupa (Duri doldurun küçük 60 mm x 15 mm Petri kabıBir tek kullanımlık plastik transfer pipet kullanarak bir insectary tepsiden gelmesine sonra ilk 24 saat) ng. </li><li> Karanlık manikür tabaklama orta sahip herhangi bir pupa çıkarın. Not: kütikül tan başladığında, bu çok daha yüksek öldürücülüğü manikür ve enjeksiyon sonuçlarını nüfuz zorlaşır. </li></ol> 6. dsRNA Enjeksiyon <ol><li> Diseksiyon mikroskobu altında, ince forseps bir çift enjeksiyon iğnesinin distal ucu kesiyorum. </li><li> (3 inç, 30 gauge iğne ile bir şırınga kullanılarak) mineral yağı ile iğne dolgu ve mikroenjektör ile aşırı bir yağ atarak iğne hazırlayın. </li><li> Ön dsRNA azami miktar ile enjeksiyon iğnesi doldurmak ve sıvı dağıtılmasını sağlamak için mikroskop altında bir darbe çıkarmak. herhangi bir sıvı içine alınır ve / veya ihraç edilmesi halinde, tıkanmaya karşı İğnenin uzak ucu kontrol iğnenin microinjecto sabitlenmiş sağlamakr. </li><li> 1-3 pupa almak ve filtre kağıdı üzerine koyun. </li><li> boya fırçası yardımıyla, dorsal manikür erişilebilir filtre kağıdı üzerinde pupa yerleştirin ve filtre kağıdı üzerinde itin ve herhangi bir aşırı su absorbe fırça kullanın. </li><li> fırça ucu ile pupa stabilize ve pupa dorsal yüzeyi ile ilgili olarak yaklaşık 30 ° &#39;lik bir açıyla Göğüs ve karın arasında dorsal manikür içine iğne takın. Enjeksiyon pupa ve iğnenin arka ucuna doğru yönlendirilmelidir anterior-to-posterior yönde hareket ettirilmelidir. </li><li> hemolimf içine 3 ug / ul dsRNA çözeltisi iki bakliyat (darbe başına 69 nl) enjekte edilir ve vücutta renk dağıtımı için kontrol edin. renk tespit edilmesi halinde, tıkanması ucu temizlemek için hafifçe enjeksiyon iğne konumunu vardiya ve sıvı teslim tekrarlayın. </li><li> yavaşça kültür için suya iğne pupa taşımak için ıslanan fırça kullanın. TO ışık temas üzerine fırça sopa gerekir pupa. </li></ol> 7. Post-enjeksiyon Koşulları <ol><li> Uygun hava akımı (örneğin, örgü kafes ya da örgü kapaklı kap) ile bir sivrisinek kafes içine enjekte pupa ile Petri kabı yerleştirin. Pupa yetiştirme koşulları, 27 ± 3 ° C sıcaklıkta sürekli kalması% 75 ± 5 nem ve olmak bir ışık altında olmalıdır: 8 saat: 16 karanlık döngüsü. </li><li> Yetişkin besleme için örgü glukoz çözeltisi (ağırlık / hacim), 10% hazırlayın ve sivrisinek kafesinin bir çözelti, doymuş pamuk yerleştirin. </li></ol> 8. demonte değerlendirin <ol><li> İstenen zaman noktası (ler) de, kontrol grubuna kıyasla, deneme dsRNA enjekte edilen böcek fenotipleri değerlendirmek. <ol><li> -20 ° C&#39;de yaklaşık 2-3 dakika boyunca yetişkin aşağı soğutma 2 ° C&#39;de soğuk plaka aktarılması ve 15X bir mikroskop kullanılması ile bir sahte-tümör oluşumunu belirleyerek gün dsSRPN2 ve dsLacZ böcekler değerlendirilmesiaydınlık aydınlatma ile büyütme. değerlendirmenin ardından, insectary koşullarında (27 ± 3 ° C,% 75 ± 5 nem) yetişkinleri dönün. Not: Bu protokolde kullanılan deney ve kontrol dsRNAs sırasıyla dsSRPN2 ve dsLacZ vardır. kontroller için uygun birçok seçenek vardır; Bununla birlikte, bu önerilen olduğu fenotip ve / veya sentezleme kolay ve / ya da mıktarı [örneğin, gerçek zamanlı kantitatif PCR (qRT-PCR), Western Blot] kullanılmalıdır (örn mikroskopi keserek) görüntülenmiştir olan pozitif kontrol Western blot ve QRT-PCR ile, bu teknik. SRPN2 protein ve transkript miktarının öğrenme zaman, sırası ile, ve ark. (2005) 21 Michel tarif edilmiştir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kelly-Hope, L. A., McKenzie, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiplicity+of+malaria+transmission:+a+review+of+entomological+inoculation+rate+measurements+and+methods+across+sub-Saharan+Africa.">The multiplicity of malaria transmission: a review of entomological inoculation rate measurements and methods across sub-Saharan Africa.</a> Malar. J. 8 (1), 1-16 (2009).</li><li>The malERA Consultative Group on Vector Control. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Research+Agenda+for+Malaria+Eradication:+Vector+Control.">A Research Agenda for Malaria Eradication: Vector Control.</a> PLoS Med. 8 (1), e1000401 (2011).</li><li>Enyati, A., Hemmingway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+Management:+Past,+Present,+and+Future.">Malaria Management: Past, Present, and Future.</a> Annu. Rev. of Entomol. 55 (1), 569-591 (2010).</li><li>Edi, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP6+P450+Enzymes+and+ACE-1+Duplication+Produce+Extreme+and+Multiple+Insecticide+Resistance+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae.">CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS Genet. 10 (3), 1004236 (2014).</li><li>Mitchell, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+Target-Site+Mechanisms+Combine+to+Confer+Strong+DDT+Resistance+in+Anopheles+gambiae.">Metabolic and Target-Site Mechanisms Combine to Confer Strong DDT Resistance in Anopheles gambiae.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92662 (2014).</li><li>Knox, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+online+tool+for+mapping+insecticide+resistance+in+major+Anopheles+vectors+of+human+malaria+parasites+and+review+of+resistance+status+for+the+Afrotropical+region.">An online tool for mapping insecticide resistance in major Anopheles vectors of human malaria parasites and review of resistance status for the Afrotropical region.</a> Parasite Vector. 7 (76), 1-14 (2014).</li><li>Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+a+Chimeric+Chalcone+Synthase+Gene+into+Petunia+Results+in+Reversible+Co-Suppression+of+Homologous+Genes.">Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes.</a> Plant Cell. 2, 279-289 (2002).</li><li>Sen, G. L., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+RNAi:+the+silence+of+the+genes.">A brief history of RNAi: the silence of the genes.</a> FASEB J. 20 (9), 1293-1299 (2006).</li><li>Romano, N., Macino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quelling:+transient+inactivation+of+gene+expression+in+Neurospora+crassa+by+transformation+with+homologous+sequences.">Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences.</a> Mol. Microbiol. 6 (22), 3343-3353 (1992).</li><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Catteruccia, F., Levashina, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+the+Malaria+Vector,+Anopheles+gambiae:+Therapeutic+Applications+of+RNAi:+Methods+and+Protocols.">RNAi in the Malaria Vector, Anopheles gambiae: Therapeutic Applications of RNAi: Methods and Protocols.</a> Methods Mol. Biol. 555, 63-75 (2009).</li><li>Garver, L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+RNAi+Assays+in+Adult+Mosquitoes+(A).">Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A).</a> gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).</li><li>Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/siRNA+nanoparticle+targeting+demonstrates+a+requirement+for+single-minded+during+larval+and+pupal+olfactory+system+development+of+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti.</a> BMC Dev. Biol. 14 (9), 1-16 (2014).</li><li>Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Aedes+aegypti+Olfactory+System+Development+through+Chitosan/siRNA+Nanoparticle+Targeting+of+semaphorin-1a.">Disruption of Aedes aegypti Olfactory System Development through Chitosan/siRNA Nanoparticle Targeting of semaphorin-1a.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (5), (2013).</li><li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/double-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+(Anopheles+gambiae).">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect Mol. Biol. 19 (5), 683-693 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/Interfering+RNA+Nanoparticle+Mediated+Gene+Silencing+in+Disease+Vector+Mosquito+Larvae.">Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae.</a> J. Vis. Exp. (97), e52523 (2015).</li><li>Kumar, A., Wang, S., Ou, R., Samrakandi, M., Beerntsen, B. T., Sayre, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+RNAi+based+microalgal+larvicide+to+control+mosquitoes.">Development of an RNAi based microalgal larvicide to control mosquitoes.</a> Malaria World J. 4 (6), 1-7 (2013).</li><li>Huvenne, H., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+dsRNA+uptake+in+insects+and+potential+of+RNAi+for+pest+control:+A+review.">Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: A review.</a> J. Insect Physiol. 56 (3), 227-235 (2010).</li><li>Burand, J. P., Hunter, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi:+Future+in+insect+management.">RNAi: Future in insect management.</a> J. Invertebr. Pathol. 112, S68-S74 (2013).</li><li>Michel, K., Budd, A., Pinto, S., Gibson, T. J., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+gambiae+SRPN2+facilitates+midgut+invasion+by+the+malaria+parasite+Plasmodium+berghei.">Anopheles gambiae SRPN2 facilitates midgut invasion by the malaria parasite Plasmodium berghei.</a> EMBO Rep. 6 (9), 891-897 (2005).</li><li>An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+regulatory+unit+that+controls+melanization+and+affects+longevity+of+mosquitoes.">Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes.</a> Cell Mol. Life Sci. 68 (11), 1929-1939 (2011).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi:+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic Acids Res. 38, W332-W339 (2010).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Anopheles Research. , (2014).</li><li>Lyimo, E. O., Takken, W., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+rearing+temperature+and+larval+density+on+larval+survival,+age+at+pupation+and+adult+size+of+Anopheles+gambiae.">Effect of rearing temperature and larval density on larval survival, age at pupation and adult size of Anopheles gambiae.</a> Entomol. Exp. Appl. 63, 265-271 (1992).</li><li>Michel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+melanizing+activity+in+Anopheles+gambiae+does+not+affect+development+of+Plasmodium+falciparum.">Increased melanizing activity in Anopheles gambiae does not affect development of Plasmodium falciparum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (45), 16858-16863 (2006).</li><li>Harker, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+Profiling+Associated+With+Life+Cycle+of+Anopheles+gambiae.">Transcription Profiling Associated With Life Cycle of Anopheles gambiae.</a> J Med Entomol. 49 (2), 316-325 (2012).</li><li>Dotson, E. M., Cornel, A. J., Willis, J. H., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+pupal-specific+cuticular+protein+genes+in+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">A family of pupal-specific cuticular protein genes in the mosquito Anopheles gambiae.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 28, 459-472 (1998).</li><li>Hopkins, T. L., Krchma, L. J., Ahmad, S. A., Kramer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pupal+cuticle+proteins+of+Manduca+sexta:+characterization+and+profiles+during+sclerotization.">Pupal cuticle proteins of Manduca sexta: characterization and profiles during sclerotization.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 30, 19-27 (1999).</li><li>Liang, J., Zhang, L., Xiang, Z., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+cuticular+genes+of+silkworm,+Bombyx+mori.">Expression profile of cuticular genes of silkworm, Bombyx mori.</a> BMC Genomics. 11 (173), 1-13 (2010).</li><li>Zhou, X., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+specifies+pupal+development+and+mediates+the+&amp;#34;status+quo&amp;#34;+action+of+juvenile+hormone+on+the+pupal-adult+transformation+in+Drosophila+and+Manduca.">Broad specifies pupal development and mediates the &amp;#34;status quo&amp;#34; action of juvenile hormone on the pupal-adult transformation in Drosophila and Manduca.</a> Development. 129, 2259-2269 (2002).</li><li>Luna, C., Wang, X., Huang, Y., Zhang, J., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+four+Toll+related+genes+during+development+and+immune+responses+in+Anopheles+gambiae.">Characterization of four Toll related genes during development and immune responses in Anopheles gambiae.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 32, 1171-1179 (2002).</li><li>Tauszig, S., Jouanguy, E., Hoffmann, J. A., Imler, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-related+receptors+and+the+control+of+antimicrobial+peptide+expression+in+Drosophila.">Toll-related receptors and the control of antimicrobial peptide expression in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (19), 10520-10525 (2000).</li><li>Tryselius, Y., Samakovlis, C., Kimbrell, D. A., Hultmark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CecC,+a+cecropin+gene+expressed+during+metamorphosis+in+Drosophila+pupae.">CecC, a cecropin gene expressed during metamorphosis in Drosophila pupae.</a> Eur. J. Biochem. 204, 1-5 (1992).</li><li>Goodisman, M. A. D., Isoe, J., Wheeler, D. E., Wells, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Insect+Metamorphosis:+a+Microarray-Based+Study+of+Larval+and+Adult+Gene+Expression+in+the+Ant+Camponotus+Festinatus.">Evolution of Insect Metamorphosis: a Microarray-Based Study of Larval and Adult Gene Expression in the Ant Camponotus Festinatus.</a> Evolution. 59 (4), 858-870 (2005).</li><li>Cook, P. E., Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+Anopheles+gambiae+mosquitoes+for+adult+age+estimation.">Transcriptional profiling of Anopheles gambiae mosquitoes for adult age estimation.</a> Insect Mol. Bio. 19 (6), 745-751 (2010).</li><li>Suwanchaichinda, C., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serpin+gene+family+in+Anopheles+gambiae.">The serpin gene family in Anopheles gambiae.</a> Gene. 442 (1-2), 47-54 (2009).</li><li>Araujo, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+of+the+salivary+gland+nitrophorin+2+in+the+triatomine+bug+Rhodnius+prolixus+(Hemiptera:+Reduviidae)+by+dsRNA+ingestion+or+injection.">RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 36 (9), 683-693 (2006).</li><li>Griebler, M., Westerlund, S. A., Hoffmann, K. H., Meyering-Vos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+with+the+allatoregulating+neuropeptide+genes+from+the+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda+and+its+effects+on+the+JH+titer+in+the+hemolymph.">RNA interference with the allatoregulating neuropeptide genes from the fall armyworm Spodoptera frugiperda and its effects on the JH titer in the hemolymph.</a> J. Insect Physiol. 54 (6), 997-1007 (2008).</li><li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi.">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li></ol>

Bu video-makale için Açık Erişim Biogen tarafından ödenir.

Sivrisinekler transgenik olmayan RNAi uyaran için mevcut yöntemler yetişkin hemocoel 12,13 veya RNAi tetik kaplı nanopartiküller 14-17 veya mikroalg tabanlı dsRNA 18 molekülleri larva beslenmesi içine dsRNA direkt enjeksiyon içerir. yetişkin sivrisinek Hedefleme, son derece değerli iken, erken gelişim dönemlerinde işlev genlerin çok sayıda hariç tutabilirsiniz. larvaların başlatılan demonte pupa aşamasında değişkeni proteininin kalıcılık potansiyeli, kısmen, yetişkin safhasında tutarsız fenotipleri verebilir. Bu nedenle, daha tam yetişkin aşamalarında gen fonksiyonunu değerlendirmek için gen öncesi yetişkin gelişim evreleri sırasında fonksiyonları, yanı sıra gelişmiş yeteneklerini değerlendirmek için bir araç sağlayacaktır pupa gelişimi sırasında RNAi başlatarak standartlarını hedefleyen ek bir yöntem tanıtan. dsRNA enjeksiyon veya ifade, demonte genin sebat dayalı gen demonte bir yaklaşım olduğu gibitahmin edilemez. Bu nedenle, transkript veya protein düzeyleri ilgi gelişim dönemlerinde ilgi gen için değerlendirilmelidir. SRPN2 dsRNA enjekte hayvanlarda SRPN2 için gün 5 post-enjeksiyon protein seviyelerini düşürmüştür biz bir devamı gözlemlemek rağmen, bu tür protein ciro ve yarılanma ömrü gibi faktörler farklı hedefler için farklı olabilir. İyi konsantre edilir dsRNA enjeksiyon için kullanılacak olan, hem de, elde etmek için önemlidir ve bir agaroz jeli üzerinde sağlam görünür. Biz demonte sonuçlar yeterli değilse deneyci bu faktörler yeniden değerlendirmek tavsiye ve dsRNA ilgili konsantrasyonları spesifik gen hedefleri için ampirik test edilmesi gerekebilir. Biz An pupa evresinde RNA girişim başlatılması için bir yöntem açıklanmaktadır. gambiae gelişme. Bu yöntem, doğrudan erken pupa hemocoel içine dsRNA mikroenjeksiyon yoluyla tanıtılması dayanır ve enjeksiyon kalitesinin değerlendirilmesi için izin verirboya etiketli dsRNA&#39;nın kullanımı. Enjeksiyon kalitesini görselleştirmek için yeteneği başarılı demonte sağlamak için kritik donanım oluşturur ve yetişkin sahnede odaklanarak en önce bildirilen dsRNA tabanlı protokoller kabul edilmemiştir enjeksiyon tabanlı gen demonte bir yönünü oluşturmaktadır. Bu gelişim döneminde, bu kritik gelişimsel aralık sırasında bir rol oynayabileceğini genlerin başlangıcında pupa hedefleyerek, ya da yetişkinlik erken aşamalarında fonksiyonel değerlendirilebilir. Ayrıca, bu yöntem metamorfoz sırasında erişilebilir hücrelerde dsRNA hücrelerine teslim ve RNA girişim kurulması mümkün kılabilir, ancak tam oluşmuş yetişkin sivrisinek az erişilebilir. Harker ve ark tarafından yapılan yeni bir mikrodizi analizi. (2012) bir 560 belirledi. yukarı regüle veya embriyo yetişkin arasında değişen, farklı gelişim evreleri sırasında en az 4 kat aşağı-regüle edildi gambiae transkript. 560 transkript tespit 309 bir dizi pupa gelişme 27 sırasında up-regüle edildi. Bu bulgular pupa aşamasında meydana olanlar, organizma başkalaşım uğrar sırasında bir aralık da dahil olmak üzere sivrisinek gelişimi boyunca farklı gen ifadesi için birçok gereksinimleri vardır düşündürmektedir. An dahil olmak üzere birçok böcek türünün, içinde. gambiae, bu tür gelişme (yani, pupa cuticular ve kitin-bağlayıcı proteinlerin) olarak süreçlerine dahil genler 27-31 ve bağışıklık tepkisi (yani, Toll-benzeri reseptör proteinler) 27,32-34 yüksek pupa evresinde ifade edilir. Bir tam olarak oluşmuş yetişkin ortaya sonra, çevresel ve fizyolojik 35 değişikliklere yanıt olarak gen ifadesini yok devam edilir. Özellikle, yetişkinliğin ilk gelişimi sırasında, bir gelişim genlerin (örneğin, yetişkin kütiküler ve Sarkoplazmik protein) 36, ekspresyonunda artışın yanı sıra diğer önemli genler (yani </em&gt; Sperm spesifik protein ve sitokrom P450 metabolizması enzimleri) 27,36. Bu protokol, SRPN2 geliştirilmesinde kullanılan pozitif kontrol, bir IS. gambiae, serin proteaz inhibitörü (serpin). SRPN2 böcek melanization, böcek 21,22 bir geniş spektrumlu doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin negatif regülasyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Sözde-tümör oluşumu 21,22 kolayca ışık mikroskobu kullanılarak gözlenmiştir bir fenotip ile, yetişkin sivrisinekler sonuçlarında SRPN2 demonte. Bu farklı fenotip kolaylıkla canlı böcekler gol olabilir göz önüne alındığında, biz ilk pupa aşaması RNAi enjeksiyonlar için SRPN2 kullanılır. Buna ek olarak, SRPN2 böylece erken yetişkin pupa aşaması RNAi enjeksiyonu ve fonksiyonunun değerlendirilmesi için iyi bir hedef temin edilir, tüm gelişim aşamalarında 37 sırasında ifade edilebilir. Biz geliştirdik yöntem uyaran benzer yetişkin melanotik pseud yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir<html> gelişme pupa aşamasında yapılan dsRNA enjeksiyonu bir sonucu olarak o-tümör oluşumu. Bu protokolü geliştirirken, biz (yani, larva-pupa tüy dökme sonra ilk 24 saat) optimum yetişkin çıkmasını elde etmek için kritik öneme sahiptir erken pupa gelişme sırasında enjeksiyon gözlemledim. kötü çıkması sonrası enjeksiyon elde edilmesi halinde, biz daha az kapsamlı manikür sertleştirme ile pupa elde etmek ve erken pupa aşamalı enjeksiyon elde edilir sağlamak için, daha doğru larva evreleme öneririz. Ayrıca, enjeksiyon sırasında optimum çıkması oranlarındaki manikür sonuçlarına hasar ve artan büyütme minimize hayvanın sadece amaçlanan bölge delinmiş emin yardımcı olabilir. İğne ventral manikür yoluyla delinme olursa, boya etiketli sıvının havuzu pupa dış yüzeyinde belirgin olacak ya da filtre kağıdı doyurmak olacak. Oldukça fazla kütikül patlağı olan herhangi bir pupa atmak için tavsiye edilir. Yetişkin sivrisinek enjeksiyonları bir performansla laboratuarların geniş deneyimleri ile jove_content &quot;&gt;, daha önce tanımlanmış olan mikroenjeksiyon yaklaşımlar pupa RNAi deneylerinde kullanılmak üzere basit bir protokol modifikasyonlar ile uyarlanabilir. Genel olarak, bu yöntemin amacı, araştırmacılar yeteneği sağlamak için genetik analizler ayrıca yeni vektör kontrol stratejilerinin geliştirilmesini destekleyecek araştırma sağlayarak, yapılabilir ters sırasında zaman çerçevesini genişletmek. İlginçtir, bu tür Rhodnius prolixus ve Spodoptera frugiperda gibi diğer türler, deneyler, susturulması etkileri çok olma eğilimi geni ortaya ön yetişkin sırasında başlatılan zaman büyük gelişme tüm aşamalarında. 38,39 aşamaları, demonte RNAi-aracılı gen hız ve gen susturma kalıcılığı ve hedeflenen genler tarafından kodlanan proteinlerin stabilitesi ile ilgili hususlar geçerlidir. İdeal RNAi hedef genlerin protein, şifreleyenlere olma eğilimindedirn veya RNA kısa bir yarılanma ömrüne ve yüksek devir hızı 11,40 vardır. Transgenik RNAi stratejiler yetişkin öncesi aşamalarında ve hızını RNAi kalıcılığı ile ilgili dikkat edilmesi gereken adres için kullanılabilir olsa da, transjenik teknikler pek çok sakıncaları (sivrisinek çiftleşmelerin böcekleri oluşturmak için örneğin, transjenik çizgileri üretimi için gerekli olan süre, deney zaman çerçeveleri düzenlenmiş dsRNA ifadesi ve transgenik stokların bakım) ile. Buna karşılık, bizim protokol pupa gelişimi sırasında ve köken ve metamorfoz sırasında erişilebilir ancak erişkinlerde daha az erişilebilir hücre tiplerinde gen demonte başlatmak için daha kolay ve hızlı bir yöntem tanıyor. boya etiketli dsRNA süspansiyonlar kullanımı kolay enjeksiyon başarı değerlendirilmesi ve pupa içinde tanıtılan malzemenin dağıtılması için izin verir. yetişkin olarak enjekte edilmiş hayvanların, karşılaştırıldığında pupa enjekte yetişkinlerde tümör oluşumu başlangıcı ile ilgili verilerimiz, init ile tutarlıdırve iation pupa aşamasında demonte RNAi aracılı. Bizim G3 sivrisinek hattı kullanılarak ve insectary koşullar altında, biz yetişkinlerin enjeksiyon sonrası üç ila beş gün sonrası ortaya çıkması enjekte kadar erken 10 gün gibi yetişkin melanotik sözde tümör oluşumunu gözlemlemek. Erken pupa evre enjeksiyon yaparak, biz erken beş gün enjeksiyon sonrası (yani, üç dört gün ortaya çıkması sonrası) olarak görünür melatonik sözde tümör oluşumunu gözlemlemek. Bu veriler, bu yöntem daha önce altında çalışılmış gelişim döneminde (yani, pupa gelişme) döneminde gen demonte başlatılmasını sağlayan ima. Bizim boya etiketleme yöntemi nedeniyle de tüm larva instars sırasında manikür saydam doğası gereği, yeni larva enjeksiyon protokollerinin geliştirilmesi için yararlı olabilir. Bu çalışmada kullanılan kontrolü yok etme fenotipi görüntülemek için yetişkin aşamaya ilerlemesini gerektirirken, gelecekteki deneyler sağlayacak erken pupa enjeksiyonundan sonra pupa safha spesifik fenotipleri değerlendirmekBöyle geç pupa gelişme gibi ek gelişim dönemleri içine bu yöntemin genişleme ile ilgili değerli bir fikir. Özet olarak, bu yöntem, RNAi aracılı gen demonte pupa aşaması başlatılması için değerli bir RNAi protokolü sağlar vektör böcek araştırma grupları içinde kullanılmak için uygun fonksiyonel genomik araçları genişler.

Sıtma her yıl bireylerin milyonlarca etkileyen bir sivrisinek yoluyla bulaşan bulaşıcı bir hastalıktır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) 2013 yılında beş yıllık 1 yaşın altındaki çocuklarda meydana gelen yüzde 78 olan sıtma nedeniyle yaklaşık 584.000 ölüm, olduğunu bildiriyor. Insan sıtma neden olan patojenleri cins Plasmodium içinde sporlular parazitlerdir ve dişi Anopheles sivrisinekler tarafından insan bilgisayarlar arasında iletilir. Sivrisinek bir sonraki kan yemek bulaşmamış birey sonra içine mevduat enfektif parazitler bulaşmış bir kişiden bir kan yemek alır ve ne zaman İletim oluşur. Cins Anopheles içinde Anopheles gambiae büyük vektörel kapasiteye sahip türdür ve Sahra-altı Afrika&#39;da 1-3 en önemli sıtma vektörü. Şu anda, böcek dağıtım ile sivrisinek vektör kontrol b devamİnsan sıtma yükünü azaltmak için kullanılan en önemli yöntem e. 1960&#39;lardan bu yana insektisit kullanımı çok başarılı olduğu kanıtlanmıştır, ancak böcek direnci artış, yeni insektisidler ve alternatif vektör kontrol stratejilerinin 4-7 geliştirilmesi için bir ihtiyaç sürdü. 2010 yılında, Dünya Sağlık Örgütü rapor 49 63 ülkelerinin toplam sıtma vektörleri 1 insektisit direncinin oluşumu göstermiştir. Ayrıca, Afrotropikal bölgelerde direnç verilerini değerlendirmek için hakemli literatür kullanır IR Mapper aracı, 2001 ve 2012 yılları arasında sırasıyla 7 piretroidler ve Diklorodifeniltrikloroetan (DDT) direnç% 46 ve% 27 artış, olduğunu bildiriyor. RNA enterferans (RNAi) Petunya fabrikasında 8,9 ve mantar Neurospora crassa 9,10 genleri etkisiz hale getirmek istihdam edilebilir bir teknik olarak 1990&#39;ların başında tespit edilmiştir. Kısa bir süre sonra,1998 yılında, RNAi ilk enjeksiyon veya besleme yöntemleri 9,11 ile antisens ya da çift iplikli RNA (dsRNA) katılmasıyla, bir hayvan modelinde, gen ekspresyonunu azaltmak için bir araç olarak Caenorhabditis elegans belgelenmiştir. keşfedilmesinden bu yana, RNAi araştırmacılar hızla oldukça seçici transkripsiyon sonrası gen susturma mekanizması ile ilgi genlerin fonksiyonel rolleri araştırmak için ters genetik kullanmasına izin vererek fonksiyonel genomik peşinde devrim yarattı. Drosophila melanogaster gibi organizmalarda, müdahale edici RNA yapılarını eksprese transgenik organizmaların kullanımı gen demonte (KD) için yaygın olarak başarılı olmuştur. An transgenlerin kullanımı rağmen. RNAi için gambiae kullanılmıştır ve büyük ölçekli ekranlar için yararlı olabilir, transgenik sivrisinek suşlarının nesil emek ve zaman yoğun, genellikle Generati ilgilendiren bir genin tanımlanması gitmek için iki ya da üç ayda bir alıyor hemUygun bir transgenik stokunun 12 üzerinde. Şu anda, An gen KD birincil yöntem. gambiae dsRNA&#39;nın yetişkin aşamasında, hemolimf içine enjeksiyon ile verilen bir genin 12,13 özeldir. Bu işlem genellikle çok daha hızlı transgenik yöntemler 12 daha olduğunu kanıtlamaktadır, gen KD değerlendirilmesine ilgi bir genin tanımlanması gitmek için yaklaşık bir ay sürer. Larva evre RNAi Yöntemleri An son zamanlarda kurulmuştur. 14-17 beslenme nanoparçacık yoluyla veya ağızdan teslimat gambiae ve Aedes aegypti Mikroalglerin tabanlı dsRNA gelişimin erken evrelerinde fonksiyonel genomik analiz gerçekleştirmek için fırsatlar sunan, 18 molekülleri. Direkt enjeksiyon, beslenme ve nanoparçacık dağıtım yöntemleri olarak, dsRNA &quot;kısa RNA&#39;lar müdahale&quot; 21-25 nükleotid uzunluğunda (siRNA) 19,20 içine enzim Dicer hedef hücre tarafından özerk alınır ve ayrılır. Bu siRNA&#39;lar daha sonra incorporiçine ated RNA kaynaklı kompleks (RISC) susturulması, tek iplikli RNA bağlı RISC kompleksi bağlamak ve hedef mRNA tutunmaya ve böylece onun düzeyini azaltmak ve çevirisini 19,20 inhibe izin atılır hangi. Temel sivrisinek biyoloji birçok içsel özellikleri konak tercihi (örneğin, olfaction, tadına bakma), çiftleşme, üreme ve bağışıklık olmak üzere vektörel kapasitesini modüle. Bu biyolojik süreçlerin önemi göz önüne alındığında, bir genetik ya da farmakolojik düzeyde kendi modülasyon insektisit direnci atlatma dahil olmak üzere vektör kontrolü için yeni fırsatlar sunar ve vektör yönetimine daha geniş entegre yaklaşımlar için yepyeni araçlar sağlayan olasıdır. Bu içsel biyolojik özelliklerini altında yatan genlerin rollerini değerlendirmek için fonksiyonel genomik kullanımı yeni hedeflerin belirlenmesini sağlayacak ve etkili yeni, daha etkin kontrol strateg oluşturabilirsiniz nasıl yeni bakış açıları sağlayacakler. Biz An pupa aşamasında RNAi başlatmak için hızlı bir enjeksiyon yönteminin geliştirilmesini ve kullanımını tanımlamak. gambiae. Biz RNAi tetik pupa aşaması enjeksiyonu er demonte gen sonrası ortaya yetişkinlerde başlatılan olsaydı gözlenen olandan çıkmasından sonra, yani erken evre erişkinlerde bileşke fenotipleri gözlem sağladığını görüyoruz. Bu yöntemler, gen pupa gelişim aralığında başlangıç ​​ve erginleri, örneğin pupa gelişimi sırasında başlatılan gen yok etme sürmesi ve etkileyebilir erken yetişkin hemolimf erişilebilir hücre tipleri, hem de hücre tipleri içine uzanan demonte sağlayan başkalaşım boyunca daha hemolimf-erişilebilir böyle çıkması aşağıdaki yetişkin uzantıları bulunan duyusal nöronlar olarak yetişkin, daha.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MEGAscript RNAi kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II foot switch</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipette puller</td>
			<td>Narishigne</td>
			<td>PB-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7258</td>
			<td>Can substitute with a non-toxic food dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1371150</td>
			<td>&#188; inch cut from tip to create a wider opening.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman &#8220;thin&#8221; filter paper&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot &#8220;thick&#8221; filter paper</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>107-3931</td>
			<td>This is the filter paper generally used for Western blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (size 0)</td>
			<td>Michael&#8217;s Art</td>
			<td>10474940</td>
			<td>Brush size and brand can vary based on availability and user preference.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting light microscope</td>
			<td>&#160;----&#160;</td>
			<td>-----</td>
			<td>This can vary based on availability and user preference.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai trigger delivery into anopheles gambiae pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

Gen KD verimleri enjeksiyon erken pupa aşamasında gerçekleştirilir optimum sonuçlar, manikür bronzlaşma seviyeleri düşük olduğunda (Şekil 1A, sol ve 1B) için pupa enjeksiyon. Genellikle 24 saat, enjeksiyonu takiben artan pupa ölümle sonuçları (Şekil 1A, merkez ve sağ) sonra, bronzlaşma ve manikür sertliği artmış. Pupa gelişme oranı insectary koşullar ve yoğunluğu 24,25 bağlı olarak değişebilir; Bu nedenle, görsel pigmentasyonu değerlendirmek için en iyisidir. Enjeksiyon işlemi sırasında Kılcal iğne posterior yönde (Şekil 2A) anterior yaklaşık 30 ° &#39;lik bir açı ile dorsal deri içine sokulur. İğne eklenir ve dsRNA +% 0.01 sonra (a / h) FGD dağıtıldığı, boya dağılımı (hemolimf içinde Figu belirgindir) 2B&#39;ye yeniden. Pupa yetişkin çıkması değerlendirilmesi FGD olmayan enjekte kontrol (Şekil 3A)% 96.7 çıkması ile karşılaştırıldığında,% 70 çıkması arasında bir ortalama oranı saptandı (ağırlık / hacim),% 0.01 ile enjekte edilir. Notun, pupa halinde kısmi çıkması olmayan kalan sivrisinekler (Şekil 3B) çok sayıda gözlendi. Enjekte edilmiş hayvanların ortaya süresinde bir gecikme (Şekil 4A) veya her iki cinsiyet (Şekil 4B) ile ilgili taraflı etki gösterirler. Yetişkin hayatta kalma ek değerlendirme 10 sonrası ortaya çıkış sonrası yetişkin hayatta kalma (Şekil 4C) üzerinde herhangi bir belirgin etki ortaya güne kadar yürüttü. KD kalite Doğrulama devirme ve bir pozitif kontrol olarak 21,22 demonte SRPN2 ile ilişkili melanotik sözde tümör (koyu pigmentli doku küme) fenotip ile değerlendirildi<html> Bir negatif kontrol olarak dsLacZ enjeksiyonu ile bağlantılı fenotipler olmaması. ortaya çıkan erişkin sivrisinek gün 8 enjeksiyon sonrası (günde 6-7 sonrası ortaya) de değerlendirildi. Melanotik sözde tümörleri (Şekil 5A ve 5B) dsSRPN2 genel% 93.5 üst deri yoluyla gözlenmiştir DsLacZ yetişkin sivrisinek (Şekil 6A) 0%. Koyu melanized doku Kümeler pigmentli yamalar (Şekil 5C) diseksiyonu üzerine tespit edilmiştir. Sözde tümörler gibi erken gün 3 sonrası ortaya çıkması olarak yetişkin manikür görünür ve aynı zamanda dsSRPN2 hemolimf ve bağırsak dokularında bir alt kümesi mevcuttu (veriler gösterilmemiştir). 5 enjeksiyon sonrası (erken yetişkin safha) &#39;de, önemli ölçüde dsSRPN2 bölgesindeki SRPN2 düzeyleri azalmıştır, ancak dsLacZ veya enjeksiyon hemolimf protein izolatları olup (Şekil 6B) görüldü. ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: pupa dsRNA enjeksiyon için Gelişimsel evreleme yetişkin aşamaya optimum hayatta kalma ve ilerlemesinde dsRNA sonuçlarının erken pupa enjeksiyonu.. Manikür pigmentasyon düşük seviyelerde (A, sol, ve B) ilk 0-24 saat aşağıdaki pupa devresi içinde görülebilir. Fakir hayatta kalması için orta olarak pupa kütikül önceki enjeksiyon (A, merkez ve sağ) sonuçları Bronzlaşma. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig2.jpg" /> Şekil 2:. Anterior yaklaşık 30 ° &#39;lik bir açı ile enjeksiyon pozisyonu ve dorsal deri içine, boya etiketli dsRNA&#39;nın boya etiketli dsRNA (A) Kılcal iğne enjeksiyonuyla dağılımı ve yönleri posterior. (B) boya gözle pupa hemolimf dağıtılır. % 0.01 F ile etiketlenmiş 138 nl dsRNA enjeksiyon hacmi,GD (a / h). <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53738/53738fig3.jpg" /> Şekil 3:. Enjeksiyon sonrası ergin çıkışı (A) pupa% 70 olmayan enjekte kontrol (n = 60) 96.7% göre (n = 60) (a / h) başarılı bir şekilde ortaya çıkan% 0.01 FGD enjekte. Üç biyolojik çoğaltır yapıldı. Pupa durumda (B) kısmi ortaya dağılan sivrisinek sayıda gözlenmiştir. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53738/53738fig4.jpg" /> Şekil 4: Emergence oranı, cinsiyet değerlendirme ve yetişkin hayatta kalma (A) non-enjekte pupa kıyasla Karşılaştırılabilir ortaya süreleri,% 0.01 FGD (24 saat =% 80 ve 48 saat =% 20) ile pupa enjeksiyonundan sonra gözlenmiştir (24. hr =% 83 ve 48 saat =% 17). (B </strong&gt;) Yaklaşık olarak eşit erkek ve dişi yetişkin ortaya çıkması% 0.01 OGG enjekte pupa (dişi =% 48 ve erkeklerde =% 52) ve non-enjekte pupa (dişi =% 52 ve erkeklerde =% 48) gözlendi. (C) Yaşam analizi% 0.01 FGD enjeksiyon gününde 10 sonrası ortaya kadar değerlendirilir, yetişkin hayatta etkisi olmadığını ortaya koymaktadır. Sonuçlar üç bağımsız enjekte% 0.01 FGD deneyler (n = 60) ve non-enjekte (n = 60) pupa (kadın ve erkek eşit sayıda) veri temsil etmektedir. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53738/53738fig5.jpg" /> Şekil 5: Sözde tümör pozitif kontrol fenotip başarılı demonte yansıtan Sözde tümörler (A) karın ve -injected dsSRPN2 (B) torasik manikür gözlenen, ancak gün 8 sonrası enjeksiyon de -injected yetişkin sivrisinek dsLacZ değildi..(C) Yüksek büyütme (400X) manikür ve pigmentli yamalar diseksiyon görüntüleme (a), (b) koyu melanized hücrelerin kümeleri ortaya koymaktadır. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53738/53738fig6.jpg" /> Şekil 6: sözde-tümör oluşumu miktarının belirlenmesi ve SRPN2 protein düzeyleri azalmıştır (A) Pupa aşaması enjeksiyonları 0 dsLacZ kontrollerin% (n = 19) ile karşılaştırıldığında (n = 21) dsSRPN2 yetişkinlerin% 93.5 sözde tümör oluşumuna neden olmaktadır. . Sonuçlar gün 8 sonrası enjeksiyon aldı. (B) bir Western blot (sol) gösterir dsSRPN2 bölgesindeki SRPN2 düzeyleri azalmıştır, ancak dsLacZ veya enjeksiyon hemolimf proteini izolatı (gün 5 enjeksiyon sonrası). Sonuçlar Üç bağımsız deneyden göre. 1000, 1: 2000, sırası ile kullanılan anti-SRPN2 21 ve anti-SRPN3 26 antikoru seyreltileri 1 idi. Keçi anti-RA5000: BBIT IgG-HRP (Ürün sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) 1 de kullanıldı. Tüm protein düzeyleri eşleştirilmemiş t testi ile karşılaştırıldı istatistiksel SRPN3 bant yoğunluğu (ImageJ Yazılım, NIH, Bethesda, MD), normalize tarafından (sağda) sayısal ve bulundu. P &lt;0.05: * P ≥0.05 NS (önemli değil). Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae at JoVE.com

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

rnai-trigger-delivery-into-anopheles-gambiae-pupae

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

9.0K Görüntüleme.  Boston College. RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

Video: RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Biyoloji

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

Sivrisinek Yetiştirme Protokolü (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Yetişkin Sivrisinekler (A. gambiae) RNAi Tahliller için protokol

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to perturb gene expression patterns in selected segments of leech embryos, leaving the untreated segments as internal controls.
The pneumatic capillary gun can be used to reach internal layers of cells at early stages of development without opening the specimen. As a method for localized introduction of substances into living tissues, the biolistic delivery with the gun has several advantages: it is fast, contact-free and non-destructive. In addition, a single capillary gun can be used for independent delivery of different substances. The delivery region can have lateral dimensions of ~50-150 &#181;m and extends over ~15 &#181;m around the mean penetration depth, which is adjustable between 0 and 50 &#181;m. This delivery has the advantage of being able to target a limited number of cells in a selected location intermediate between single cell knock down by microinjection and systemic knockdown through extracellular injections or by means of genetic approaches.
For knocking down or knocking in the expression of the axon guidance molecule Netrin, which is naturally expressed by some central neurons and in the ventral body wall, but not the dorsal domain, we deliver molecules of dsRNA or plasmid-DNA into the body wall and central ganglia. This procedure includes the following steps: (i) preparation of the experimental setup for a specific assay (adjusting the accelerating pressure), (ii) coating the particles with molecules of dsRNA or DNA, (iii) loading the coated particles into the gun, up to two reagents in one assay, (iv) preparing the animals for the particle delivery, (v) delivery of coated particles into the target tissue (body wall or ganglia), and (vi) processing the embryos (immunostaining, immunohistochemistry and neuronal labeling) to visualize the results, usually 2 to 3 days after the delivery.
When the particles were coated with netrin dsRNA, they caused clearly visible knock-down of netrin expression that only occurred in cells containing particles (usually, 1-2 particles per cell). Particles coated with a plasmid encoding EGFP induced fluorescence in neuronal cells when they stopped in their nuclei.

In this video, we show a procedure for an accurate biolistic delivery of reagents into live tissue with a novel miniature gene gun. We are knocking down the expression of the axon guidance molecule Netrin in leech embryos by delivering molecules of dsRNA into the ventral body wall and ganglia of single segments.

Lokalize RNAi ve Tıbbi Sülük Ektopik Gen İfadesi

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

RNAi Efektör Bakteriyel Teslim Tarihi: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Enjeksiyon ve Elektroporasyon Zebra balığı Otocyst içine MIF Morpholinos Stoktan teslim İç Kulak Geliştirme etkiler

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...