This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

Uygun ulusal ve kurumsal etik hayvan deneyleri gerçekleştirmeden önce alınmalıdır. EDL kas ve sinir 1. Kaldırma <ol><li> Tartılır ve derinden% 5 izofluoran bir buharlaştırıcı artı 1.5 L / dk oksijen akış hızı veya alt izofluoran batırılmış pamuk ile bir çan kavanoz kullanarak inhale izofluoran bir yetişkin fare uyutmak. </li><li> Fare derin anestezi ve bir ayak tutam yanıt vermiyor emin olun. Hızla büyük, bilenmiş makas veya giyotin kullanarak başını kesmek. </li><li> Makas kullanılarak kaburga üzerinden ventral orta hat kesim yapmak ve iç organları çıkarın. </li><li> Boyun bölgesinden cilt tutup ayaklara çekerek hayvan derisini. </li><li> Kalça üzerinde keserek bacakları çıkarın ve carbogenated soğutulmuş (4 ° C) ile bir çanak (% 95 O2,% 5 CO2), düşük miktarda kalsiyum, magnezyum, yüksek bikarbonat tamponlu tuzlu su çözeltisi içine contai cidarlı bacakları yerleştirinmM olarak Ning: 128 NaCl, 1.9 KCl, 1.2 KH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 0.85 CaCl2, 16 6.5 MgSO 4 ve 10 glikoz (7.4 ± 0.05 değerinde pH). Düşük kalsiyum, yüksek magnezyum çözüm diseksiyonu sırasında sinaptik iletim inhibe eder. </li><li> Çanak bacağı dorsal yüzü yukarı yerleştirin ve bacakları pin ve diz ve ayak bileği eklemlerinde 90 ° açıyla böylece iğne veya böcek pimleri kullanarak aşağı kalçalar. Yerinde tutmak için her bir doku ayak ucu ile ön ve arka uyluk her birinde bir pim bir pim yerleştirin. </li><li> Castroviejo yaylı makas kullanılarak, uyluk kas üst tabakası yukarı kaldırın ve hemen altındaki siyatik sinir ortaya çıkarmak için kesilmiş bir orta hat yapmak. Siyatik sinir, sadece üst kas tabakasının altında yer alan ve kalça yakın çıkışından femur üzerinde çalışır kadar sadece diz ekleminin önce ortak peroneal ve tibial sinirin içine o dalları. </li><li> Po kadar siyatik sinirin üzerindeki kas çıkarınint hangi fleksör hallusis longus (FHL) kas içine derin peroneal sinir dalı dalışlar görünür. </li><li> Içinde 55. forseps kullanarak, tibia medial tarafında gastroknemius ve soleus kaslarının kurtulması için peroneal dal etrafında bağ dokusu disseke. Gastroknemius ve soleus kaslarının tendonları kesin ve dikkatli bir sinir altında çıkarın. </li><li> Ta altında gizli EDS, FHL, EDL, ve tibialis anterior (TA): eklem-den medial lateral ayak bileğinde üç ayrı tendon demetleri maruz tibia yan tarafında yüzeysel kas çıkarın. </li><li> , Ayak bileği ekleminde TA tendonu kesilmiş EDL yukarı ve uzağa TA kaldırın ve çıkarmak için diz yakın kas kesmek. </li><li> Ayak bileğinde tendon FHL kesin ve sinir FHL girer alanına ulaşmak için geri kaldırın. Sadece bu noktanın altında kesin ve FHL kas ~ 2/3 kaldırmak. </li><li> Kutuplu olarak kalça eklemine yakın siyatik siniri kesmekmak ve yavaşça derin peroneal dalı dışındaki tüm sinir dalları kaldırdığını. </li><li> Büyük yaylı makas kullanılarak hem ayak bileği ve diz eklemlerinde EDL tendonları kesin. </li><li> Keskin bir makas kullanarak, diz kaval kemiği keserek çevreleyen dokudan EDL, kalan FHL ve sinir kaldırmak ve uyluk ortasıdır. Böylece sadece EDL, FHL ve sinir parçası olarak kalır kalan kaval kemiği kesip. </li></ol> Doku banyoya EDL Kas ve Sinir 2. montajı (Şekil 1A) <ol><li> Deneyin başlamasından önce, doku banyosu hazırlamak. Sürekli ile banyo serpmek oksijenli (% 100 O2) sentetik bağırsak sıvısı (SIF) 123 NaCl, 3.5 KCl (mM olarak), 0.7 MgSO 4, 1.7 NaH 2 PO 4, 2.0 CaCl2, 9.5 NaC 6H 11 O ( sodyum glukonat), 5.5 glikoz, 7.5 sukroz, ve 10 N 2-hydroxyethylpiperazine- N &#39;-ve -2hanesulfonic asit (HEPES); pH 7.4 ± 0.05 17. 15-30 ml / dk bir akış oranı tavsiye edilir. Banyosunun dibinde, bir monte edilen doku yazılan ve bir kuvvet ve uzunluğu, kontrol cihazı için bir bağlama (yaklaşık banyo boyutunda sabit iki uyarıcı elektrot, 25 ml kapasiteli bir ticari olarak temin edilebilir bir banyodur gösterilmiştir 8,5 cm x 3 cm x 1 cm; özellikleri için ) Malzeme / Ekipman Tablosuna bakın. </li><li> Izole kas-sinir işlemek ve doku banyosu içine yerleştirmek için kalan FHL doku kullanın. Çanak tabanında sylgard üzerinde küçük bir parça yerleştirilir ve stabilize etmek için kas kalan FHL doku ile bir böcek pimi kullanılır. </li><li> Hem tendonları kravat ve bir doku yazılan uca ve kuvvet ve uzunluk kontrolörün manivela diğer tutturmak için 6-0 ipek dikişlerle kullanın (özellikler için Malzeme / Ekipman Tablo). Pratik olan en küçük dikiş uzunluğu kullanın. Eğer tendon bağlı sonra böcek pin ve Sylgard çıkarın. NOT: Kolay kolaylaştırmak içinkoluna bağlantı tel küçük bir parça epoksi ile kol kola bir &quot;j&quot; şeklinde kanca içine bükülmüş ve sabit olabilir kol. Ameliyat dikiş ipliği daha sonra tele bağlı yerine kaldıraç kolu üzerinde oluşan küçük bir delik arasından geçirilebilir. </li><li> Önce bir cam mikropipet çektirmenin kullanarak SA 16 camından emme elektrotlar Yap (Isı = 286, = 0, Hız = 150, Zaman = 200 çekin); geri ucunu kırmak ve elle 3 mm konik orada yaklaşık kadar bileme taş üzerinde eziyet. (Elektrot ürün bilgileri için şematik ve Tablo Malzeme / Ekipman için Şekil 1B-1C bakın) örnekleme isteyen sinirin alanına bağlı olarak 100 mikron - 10 arasındaki istenen ucu iç çapı microforge kullanarak ucu eritin. </li><li> SIF ile iç gümüş tel bir premade cam emme elektrot doldurun. </li><li> Elektrot içine sinirin kesik ucuna emme ve diferansiyel yükseltecin pozitif bağlantı noktasına bağlanır. Bir klorürlü gümüş elektrot sarınheadstage olumsuz portuna bağlanır tel. Headstage zemin noktasına banyo ikinci bir klorürlü gümüş tel çalıştırarak SIF banyo topraklayın. Ayrıca perfüzyon pompaları ile tanıtıldı elektriksel gürültü azaltmak için birden fazla noktada Faraday kafesine perfüzyon boru topraklayın. </li><li> Bir seğirme daralma indüklemek için, doku banyosu içindeki kas her iki tarafına monte edilen elektrodlar vasıtası ile kas stimüle eder. Alternatif olarak, sinirin kesik ucuna bir uyarıcı elektrot yerleştirmek. Bir zirve kasılma gücünün gözlenene kadar uyarıcı gerilimini artırmak ve üst maksimum voltajda (0.5 milisaniye darbe genişliği) ulaşmak için ek bir% 15 voltajı arttırır. Arasında bir ara-10 saniye geri kalanı ile, maksimum voltajda Seğirme kasılmaları devam eder, ancak pik kasılma kuvveti elde edilene kadar kas uzunluğu değişir kas optimal uzunluğu (L O) bulmak ulaşılır. Tüm uzunluğu rampaları ve titreşimler, bu Leng de kas ile başlayacakTh. </li><li> Kas, sinir dokusu hazırlanması banyo sıcaklığına ulaşmaya ve normal sinaptik iletimi için düşük bir kalsiyum çözeltisi içinde diseksiyon sonrası düzgün izin vermek için bir sonraki veri toplama için en az 1 saat boyunca banyosu içinde kalmasını sağlar. </li><li> Oda sıcaklığında başka bir sıcaklıkta veri toplamak amacıyla, kas yakın doku banyosu içine bir sıcaklık probu yerleştirin. Yavaş yavaş bir doku banyosu taban plakası içinden ısıtılmış su pompalanarak banyo sıcaklığına kadar getir. Istikrarlı bir sıcaklık korumaya yardımcı olmak SIF rezervuar etrafında kil mikrodalga ısıtma pedleri sarın. </li></ol> 3. Veri Toplama <ol><li> Bir mili ileticisi olarak afferent tespit tekrarlanan seğirme kez teslim 0,5 milisaniye supramaksimal gerilim uyaran tarafından üretilen kasılmalar her saniye sırasında nöronal aktiviteyi kaydetmek için. NOT: Kas mili afferentler seğirme kasılma 18,19 (Şekil 2) sırasında duraklatma gerekir. </li><li> Kullanım data toplama yazılımı farklı hızlarda ve farklı uzunluklarda uzunluk değişiklikleri uygulamak için. Bu görevi otomatikleştirmek (verilen uzanıyor özelleştirmek için nasıl komut ve yön bir ekran görüntüsü için ek bilgileri görmek) için özel bir komut dosyası kullan. % 2.5,% 5 ve% 7.5 L, O streç uzunlukları ve / 15 sn 20, 40 ya da% 60 L, O hızlarda streç 4 saniye rampa ve tutma kesimleri uygulanır. NOT: Gerekli bir voltaj-milimetre dönüşüm faktörü için özel kuvvet ve uzunluk denetleyici için kullanım kılavuzuna bakınız. </li><li> Deneyin sonunda, maksimal izometrik kasılmalar tetanik (500 msn tren 120 Hz frekans tren, 0.5 milisaniye darbe genişliği, üst maksimum voltajda) kullanılarak 24 ° C &#39;de kas sağlığı belirler. Önceden bildirilen değerlere zirve kasılma gücünü karşılaştırmak (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

<ol>
	<li>Matthews, P. B. C., Brookes, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+1,+The+Nervous+System,+Motor+Control.">Section 1, The Nervous System, Motor Control.</a> Handbook of Physiology. , 189-228 (1981).</li><li>Houk, J., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Golgi+tendon+organs+to+forces+applied+to+muscle+tendon.">Responses of Golgi tendon organs to forces applied to muscle tendon.</a> J Neurophysiol. 30, 1466-1481 (1967).</li><li>Jankowski, M. P., Rau, K. K., Ekmann, K. M., Anderson, C. E., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotyping+of+group+III+and+IV+muscle+afferents+in+mouse.">Comprehensive phenotyping of group III and IV muscle afferents in mouse.</a> J Neurophysiol. 109, 2374-2381 (2013).</li><li>Nichols, T. R., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-bridge+mechanisms+underlying+the+history-dependent+properties+of+muscle+spindles+and+stretch+reflexes.">Cross-bridge mechanisms underlying the history-dependent properties of muscle spindles and stretch reflexes.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82, 569-576 (2004).</li><li>Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociception+from+skeletal+muscle+in+relation+to+clinical+muscle+pain.">Nociception from skeletal muscle in relation to clinical muscle pain.</a> Pain. 54, 241-289 (1993).</li><li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proprioceptive+Senses:+Their+Roles+in+Signaling+Body+Shape,+Body+Position+and+Movement,+and+Muscle+Force.">The Proprioceptive Senses: Their Roles in Signaling Body Shape, Body Position and Movement, and Muscle Force.</a> Physiol Rev. 92, 1651-1697 (2012).</li><li>Close, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force:+velocity+properties+of+mouse+muscles.">Force: velocity properties of mouse muscles.</a> Nature. 206, 718-719 (1965).</li><li>McCully, K. K., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+skeletal+muscle+fibers+of+mice+following+lengthening+contractions.">Injury to skeletal muscle fibers of mice following lengthening contractions.</a> J Appl Physiol. 59, 119-126 (1985).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Barclay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diffusive+O(2)+supply+to+isolated+preparations+of+mammalian+skeletal+and+cardiac+muscle.">Modelling diffusive O(2) supply to isolated preparations of mammalian skeletal and cardiac muscle.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 26 (2), 225-235 (2005).</li><li>Taguchi, T., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscular+thin-fiber+receptors+in+aged+rats+recorded+in+vitro.">Augmented mechanical response of muscular thin-fiber receptors in aged rats recorded in vitro.</a> European Journal of Pain. 15, 351-358 (2011).</li><li>Simon, A., Shenton, F., Hunter, I., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride-sensitive+channels+are+a+major+contributor+to+mechanotransduction+in+mammalian+muscle+spindles.">Amiloride-sensitive channels are a major contributor to mechanotransduction in mammalian muscle spindles.</a> J Physiol. 588, 171-185 (2010).</li><li>Wenk, H. N., McCleskey, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+skeletal+muscle-nerve+preparation+and+in+vitro+model+of+ischemia.">A novel mouse skeletal muscle-nerve preparation and in vitro model of ischemia.</a> J Neurosci Methods. 159, 244-251 (2007).</li><li>Bullinger, K. L., Nardelli, P., Wang, Q., Rich, M. M., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaliplatin+neurotoxicity+of+sensory+transduction+in+rat+proprioceptors.">Oxaliplatin neurotoxicity of sensory transduction in rat proprioceptors.</a> J Neurophysiol. 106, 704-709 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+muscle+spindle+afferents+in+the+adult+mouse+using+an+in+vitro+muscle-nerve+preparation.">Characterization of muscle spindle afferents in the adult mouse using an in vitro muscle-nerve preparation.</a> PLoS One. 7, e39140 (2012).</li><li>Shreckengost, J., Calvo, J., Quevedo, J., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicuculline-sensitive+primary+afferent+depolarization+remains+after+greatly+restricting+synaptic+transmission+in+the+mammalian+spinal+cord.">Bicuculline-sensitive primary afferent depolarization remains after greatly restricting synaptic transmission in the mammalian spinal cord.</a> J Neurosci. 30, 5283-5288 (2010).</li><li>Koltzenburg, M., Stucky, C. L., Lewin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+properties+of+mouse+sensory+neurons+innervating+hairy+skin.">Receptive properties of mouse sensory neurons innervating hairy skin.</a> J Neurophysiol. 78, 1841-1850 (1997).</li><li>Matthews, B. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+muscle.">Nerve endings in mammalian muscle.</a> J Physiol. 78, 1-53 (1933).</li><li>Hunt, C. C., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+receptor+discharges+during+muscle+contraction.">Stretch receptor discharges during muscle contraction.</a> J Physiol. 113, 298-315 (1951).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+analysis+of+isolated+skeletal+muscle.">Myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Hoheisel, U., Rein&#246;hl, J., Unger, T., Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+capsaicin+activate+mechanosensitive+group+IV+muscle+receptors+in+the+rat.">Acidic pH and capsaicin activate mechanosensitive group IV muscle receptors in the rat.</a> Pain. 110, 149-157 (2004).</li><li>Taguchi, T., Sato, J., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscle+thin-fiber+sensory+receptors+recorded+from+rat+muscle-nerve+preparations+in+vitro+after+eccentric+contraction.">Augmented mechanical response of muscle thin-fiber sensory receptors recorded from rat muscle-nerve preparations in vitro after eccentric contraction.</a> J Neurophysiol. 94, 2822-2831 (2005).</li><li>Xu, J., Gu, H., Brennan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

Bu makalenin amacı, bir fare izole kas-sinir hazırlık kas iğ afferentlerin kayıt için bir yöntem tarif oldu. Biz fare mili afferentler sıçan, kedi ve insanlarda 15 gelenler gibi germek için benzer yanıt bulduk, ve diğer laboratuarlar kas ve in vitro deride hem de duyusal nöronların çalışma model organizma olarak fareleri kullanmıştır (örneğin 3,13 için) . Kas duyusal afferentler 24 ° C ve 34 ° C hem de en az 6-8 saat süreyle kaydedilebilir. EDL ve sinir en aza indirmek için, mümkün doku işlemek için FHL kalan bölümünü kullanın. Diseksiyon sonra, organ banyosu sıcaklığında ve normal sinaptik kurtarmak için dengeye gelmesi için yeterli veri toplama başlatmak için en az 1 saat bekletin. Daha önce, kas sağlık maksimal tetanik Contra belirlenmesiyle bu hazırlıkta kullanılır kas bir alt kümesi ile doğrulanmıştırkasları tarafından üretilen kuvvet ctile deney 15&#39;in başında ve sonunda diğerleri tarafından rapor edilene benzer. Kas mili afferentler (Şekil 3) (Şekil 2) kasılmayı seğirme yanıt ateş karakteristik bir duraklama arıyor yanı sıra uzunluğu değişikliklere yanıt beklenen anlık frekans artışları ile bu hazırlık işlevsel tespit edilmiştir. Bizim tecrübelerimize göre, kontrol koşullarında ateş en afferentler kas iğ afferentler vardır. Bu hazırlık (~ 7 mm maksimum) tutulan sinirin uzunluğu kas aferan subtiplerinin 13 tanımlamak için afferent iletim hızı farklılıkları kullanmak için yeterince uzun değildir. Ayrıca, kedi ve insanlarda aksine, dinamik duyarlılık ölçüleri (daha fazla tartışma için Wilkinson ve ark. 15&#39;e bakınız) açıkça farelerde Grup Ia ve II afferentleri ayırt etmek mümkün değildi. Afferentlerin Diğer alt tipleri (yani., Grup III ve IV), vb iskemi kas açığa, banyo pH azaltılması, kapsaisin, ATP veya bradikinin gibi 3,13,21-23 maddeler eklenerek, örneğin, bu terkipte ilave fonksiyonel testler kullanılarak tespit edilebilir Emme elektrodu kullanarak tek bir kas alınabilir veri miktarını arttırır, birden fazla duyusal nöronlardan etkinliği, bir kez kayıt sağlar. Bu hazırlık duyusal nöron nüfus yanıtlar veya tespit afferentlerinden tepkiler üzerine bir pertürbasyonun genel etkisini ölçmek için kullanılabilir. Başak şekiller yeterli benzersiz iseniz, 4 duyu nöronlarının kadar () Spike2 ikisi (Cambridge Elektronik Tasarım) ve LabChart Pro (AD Instruments benzer gerçekleştirdiniz) yazılım tarafından ayırt edilebilir. Nöronlar ayrımcılık olamaz durumlarda, elektrot yerleştirme veya uç çapının değişiklikler kolayca uygulanabilir. In vitro HAZIRLIK Özet olarak, fare sinir kastirme çeşitli fizikokimyasal tedirginlikler, yaralanma ve hastalık modelleri kas duyusal afferent tepki özelliklerini araştırmak için kullanılan basit bir deneysel yaklaşımdır. Ayrıca, bu preparat ideal transgenik hayvanları ve Optogenetic araçları dahil olmak üzere, farelerde mevcut güçlü genetik araçlar, yararlanmak için uygundur.

İskelet kasları, kas ortamı hakkında önemli bilgiler merkezi sinir sistemi sağlamak duyu nöronlar tarafından innerve. Kas iğ yüksek ekstrafüzal kas lifleri ile paralel olarak yer alan intrafüzal kas elyaflardan oluşan kapsül yapılardır. Iğ Grup Ia ve kas uzunluğu ve intrafüzal lif tonunda değişiklikler dinamik innerve gamma motor nöronlar 1 tarafından düzenlenir kodlamak II aferentler tarafından innerve. Grup Ib afferentler kas lifleri ve onların tendon yapışma arasına konumlandırılmış ve kas kasılmasının 2 sırasında örneğin kas kuvveti değişikliklere duyarlı olan. Grup Ia, Ib ve II afferentler uygun motor kontrolüne yardımcı proprioseptif geribildirim sağlamak. Kas içinde bulunan kas ileticilerin ilave popülasyonlar (Grup III ve IV) metabolit oluşumunu, nosiseptif uyaranın varlığını ve kas sıcaklık sinyal vermektedir <sup&gt; 3. Bu kas duyusal bilgi vücut dengesinin sürdürülmesinde kas hasarı önlemek ve hareketi modüle etmek önemlidir. Kas afferentler önceden tecrübesi 4 dayanarak ateş desenleri değiştirebilir. Nosiseptörlerin aktivasyonu dengesi ya da hareket 6 ile ilgili problemlere neden olabilir kronik ağrı halleri 5 ve kas algılayıcılardan gelen anormal sinyallemesinin indüklenmesine yol açabilir. Biz (de gösterilmiştir 2-4 ay eski C57Bl / 6 farenin ve yanıtları) Her iki cinsiyetten yetişkin farelerin kas duyusal nöron reseptör sonlardan tepkisini incelemek için in vitro hazırlanmasında izole kas-sinir kullanın. Fare memelilerde çalışmalar için bir model genetik türdür. Bu preparat, siyatik sinirinin derin peroneal dal ve ekstensör digitorum longus (EDS), kas, alt bacağın yan kısmında bulunan peroneal grubunun bir hızlı kasılan kasın izole edilmesini gerektirmektedir. EDL genellikle kas kasılma özellikleri 7-9 incelemek için kullanılır, te vardırkolay ndons yalıtmak ve istirahat ve makul daralma görev çevrimleri 10 ile yeterli dağılır oksijen kaynağı sağlayacak kadar küçüktür için. (Örneğin soleus ve tibialis anterior için) bu alanda diğer kaslar benzer bir boyutu vardır ve bu hazırlık kolayca bu kasların aferentler kayıt için değiştirilmiş olabilir. Bir emme elektrodu kas duyu ileticisi, ateş kaydetmek için sinirin kesik ucuna yerleştirilir. Bireysel nöronlar tespit ve başak sıralama yazılımı kullanarak kendi başak şekline göre analiz edilebilir. Banyo ya da sinir üzerinde uyarıcı elektrot kas kasılması uyandırmak için kullanılabilir. Kas uzunluğu ve kuvvet kontrol edilir ve ticari olarak temin edilebilen sistemler kullanılarak ölçülebilir. Benzer nitro preparasyonlar EDS 11 sıçanda t, sıçan dördüncü lumbrikal ayak kas Grup IA ya da II mili ileticileri 12 Grup III ve IV kas ileticileri Grup III ve IV kas ileticileri incelemek için kemirgenlerde kullanılmıştır bölgesindekifare plantar kas 13 diye. In vitro bir sistem farmakolojik erişilebilirlik sıcaklık ve pH gibi perfüzyon ve fizikokimyasal değişkenler doğrudan kontrolünde avantajları vardır. Bir in vitro yaklaşım, in vivo potansiyel anestezi ve kas perfüzyon durumunun boşa ortadan kaldırır. Kas-sinir hazırlık afferentlerde pertürbasyonunun doğrudan yanıt çalışmaya imkan tanırken, in vivo 14 veya ex 3 preparatlar gibi kurban edilir vivo mümkündür mili duyarlılığı ve diğer entegre cevapların gama efferent modülasyonu çalışma yeteneği Bu hazırlık nöron hücre gövdeleri vardır. Bu preparasyon, daha önce rampanın bir pile fare kas mili ileticilerin yanıtını belirler ve esneme ve titreşimi tutmak için kullanılır ve bu fare mili iletici yanıt vermeyen belirlendiBu tür malzeme, sıçanlar, kediler, ve insanlar gibi diğer türlerde de rapor edilenlere benzerdi. Fare mili afferent cevapları 34 ° C mutlak atış hızlarında daha hızlı olmasına rağmen, 24 ° C ve 34 ° C banyo sıcaklıkları hem de benzer bulundu ve afferentler 15 değiştirir hızlı uzunluğuna yanıt daha başardık. Bu preparat kas mili ileticileri belirlemek ve incelemek için kullanılabilir nasıl aşağıda açıklanmaktadır. Ayrıca, bu preparat kolayca bir ilaç ya da hastalık durumunun veya çeşitli diğer değişkenler (yaş, cinsiyet, gen nakavt) yanıt olarak duyu ileticilerinin özelliklerini karşılaştırmak için, diğer alt tiplerinin kas iletici 13 tepkisini incelemek için modifiye edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Force and Length Controller &#38; Tissue Bath</td>
			<td>Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>300C-LR &#38; 809B-IV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &#38; Easy Load II Pump Head</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07523-80 &#38; EW-77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &#38; Headstage Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 1800; 700000 &#38; 700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass 
			OR 
			Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>S88 
			OR 
			701 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>892070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Fiberlite</td>
			<td>Model 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog to Digital Board</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition &#38; Analysis Software</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>LabChart Pro 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Glass</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>SA16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-80/PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>18627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14014-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF 
			(Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

Kas duyusal nöronlar, kas iğ ve Golgi tendon organlarının Propriosepsiyon için gerekli uzunluk ve kuvvet değişiklikleri kodlamak innerve. Ek afferentleri metaboliti birikinti, sıcaklık, ve nosiseptif uyaranlara dahil kas çevrenin diğer özellikleri, izlemek. Genel olarak, duyusal nöronların aktivasyonu anormal hareket bozukluğu olan veya kronik ağrı sendromlara neden olabilir. Biz, erişkin farede esnetilebilir-uyarılmış aferent yanıtların in vitro çalışma için ekstensor digitorum longusun (EDS), kas ve sinir izolasyonunu tarif eder. Duyu aktivitesi, emme elektrodu ile sinirinden kaydedilir ve tek tek ileticileri başak sıralama yazılımı kullanılarak analiz edilebilir. In vitro preparasyonlar anestezi potansiyeli karıştırıcıların veya değiştirilmiş kas perfüzyon olmadan duyu ileticilerinin üzerinde iyi kontrol edilen çalışmalar için izin verir. İşte biz belirlemek ve germek için kas iğ afferentlerinden tepkisini test etmek için bir protokol açıklar. Önemli bir şekilde,Bu hazırlık da ilaç uygulama ve farelerde güçlü genetik yaklaşımlar ve hastalık modellerinin dahil aşağıdaki kas afferentlerin, tepki özellikleri diğer alt tiplerinin çalışmasını destekler.

Kas afferentlerin tepkisi çalışılmaktadır hangi aferan alt tip bağlı tedirginlikler çeşitli takip kaydedilebilir. Kas kasılması ve rampa ve streç tutmaya kas iğ afferentlerin Temsilcisi cevapları burada gösterilmektedir. Bir mili ileticisi olarak afferent tanımlamak için, seğirme kasılmalar daralma 18,19 esnasında ateş bir duraklama var olup olmadığını görmek için bir kez her saniye (0.5 msn darbe genişliği) verilmiştir. Şekil 2 nöronal aktivite ve kas gerginliği temsili bir iz sırasında gösterir Bu seğirme kasılmalar. Mili afferentleri için beklendiği gibi nöronal aktivite, seğirme kasılmalar sırasında görülmektedir. Kaydedilen afferent bir Grup Ib Golgi tendon organı afferent, kasılma sırasında ateşleme hızı bir artış olsaydı beklenir. Kontrol koşulları 34 ° C&#39;de en çok 24 ° C de normal ateşleme desen (~ 12 darbeleri / saniyedir ileticileri ve ~ 32 dürtüler / san altında) Kas mili afferentler vardır. Mili afferentlerin bir alt sadece olacak yangın streç sırasında (bizim ellerde ~ mili afferentlerin% 11) 15. Şekil 3A iki kas iğ afferentlerin bir temsilcisi ham iz bir rampa yanıt ve kuvvet ve uzunluk kontrolör tarafından üretilen streç tutun gösterir. LabChart başak Histogram özelliği belirlemek ve ani ayrı ayrı iki bağımsız nöronların ateşleme frekansını (Şekil 3B-3C) analiz etmek için kullanılır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. İzole kas hazırlanması a) ekstensör digitorum longus (EDS) ve innerve siyatik sinir oksijenli sentetik dokulararası sıvının (SIF) ile perfüze edilmiş, izole edilmiş bir doku banyosu içine monte edilmiştir. Bir sucti bağlı bir hücre-dışı amplifikatörelektrot üzerinde sinir aktivitesini kaydeder. Uygun yazılım-kontroller ve tedbirler kas kuvveti ve boyu denetleyici-A çift kuvvet ve uzunluğu. Doku Banyo elektrotlar seğirme veya tetanik kasılmaları üretmek için uyaranlara teslim. İç plaka banyo kanaldan sıcak su pompalanması organ banyosu sıcaklığı b.) Çekilir cam emme elektrodu kontrol microforge kullanılarak üretilir emme elektrodu için ideal bir uç şekli ~ 3 mm konik uç ° C). Büyütülmüş tasviriyle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">burada tıklayın Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.</a> <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> Daralma Twitch Şekil 2. Mil Afferent Cevabı. Nöronal activity (üst iz) ve 30 seğirme kasılmalar kas gerginliği (alt iz) siyah üst üste iz bindirilmiş. Afferent aktivite kas iğ afferentlerin karakteristik bir yanıttır daralma bağlı gerilim artırımı sırasında duraklar. Etkinliği ara verildiğinde üst iz üstünde Tutucu ve ok kasılması sırasında zamanı belirtmek. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> Figure 3. Mili Afferent Tepki Rampa ve Stretch A tutunuz) iki afferentlerin (üst iz) Ham nöral aktiviteyi bir rampa sırasında ve EDL (alt iz gösterilir kas uzunluğu). B) Ani ateş frekans (Öğr uygulanan streç tutun. Fr., A L o aktiviteyi gösteren birimin saniyede dürtüler) () mavi gösterilmiştir. C) INSTANTANEsadece yangınlar streç sırasında (turuncu gösterilen) küçük birimin lı ateşleme frekansı. Her iki ünite kas iğ afferentlerin 1 karakteristik streç sırasında başak frekans uyumunu sergiler.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Kas duyusal nöronlar propriyoseptör sinyalizasyon dahil ve aynı zamanda metabolik devlet ve yaralanma ile ilgili olaylar üzerine rapor edilmektedir. Biz streç aktive kas afferentlerde çalışmaları için in vitro kas-sinir hazırlanmasında bir yetişkin fare açıklar.

Bir<em&gt; İn Vitro</emKas afferentlerin tahrik Properties incelenmesi için&gt; Yetişkin Fare kas-sinir Hazırlık

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

an-vitro-adult-mouse-muscle-nerve-preparation-for-studying-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

16.8K Görüntüleme.  San José State University.  Kas duyusal nöronlar propriyoseptör sinyalizasyon dahil ve aynı zamanda metabolik devlet ve yaralanma ile ilgili olaylar üzerine rapor edilmektedir. Biz streç aktive kas afferentlerde çalışmaları için in vitro kas-sinir hazırlanmasında bir yetişkin fare açıklar. 

Video: An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Yetişkin doğmuş Nöronlar Entegrasyon incelenmesi

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Nörobilim

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, the ability of one peripheral structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals to rapidly adapt their behaviors to changing environments. The marine mollusk Aplysia californica provides a tractable system for the study of multifunctionality. During feeding, Aplysia generates several distinct types of behaviors using the same feeding apparatus, the buccal mass. The ganglia that control these behaviors contain a number of large, identified neurons that are accessible to electrophysiological study. The activity of these neurons has been described in motor programs that can be divided into two types, ingestive and egestive programs, based on the timing of neural activity that closes the food grasper relative to the neural activity that protracts or retracts the grasper2. However, in isolated ganglia, the muscle movements that would produce these behaviors are absent, making it harder to be certain whether the motor programs observed are correlates of real behaviors. In vivo, nerve and muscle recordings have been obtained corresponding to feeding programs2,3,4, but it is very difficult to directly record from individual neurons5. Additionally, in vivo, ingestive programs can be further divided into bites and swallows1,2, a distinction that is difficult to make in most previously described in vitro preparations.
The suspended buccal mass preparation (Figure 1) bridges the gap between isolated ganglia and intact animals. In this preparation, ingestive behaviors - including both biting and swallowing - and egestive behaviors (rejection) can be elicited, at the same time as individual neurons can be recorded from and stimulated using extracellular electrodes6. The feeding movements associated with these different behaviors can be recorded, quantified, and related directly to the motor programs. The motor programs in the suspended buccal mass preparation appear to be more similar to those observed in vivo than are motor programs elicited in isolated ganglia. Thus, the motor programs in this preparation can be more directly related to in vivo behavior; at the same time, individual neurons are more accessible to recording and stimulation than in intact animals. Additionally, as an intermediate step between isolated ganglia and intact animals, findings from the suspended buccal mass can aid in interpretation of data obtained in both more reduced and more intact settings. The suspended buccal mass preparation is a useful tool for characterizing the neural control of multifunctionality in Aplysia.

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

We describe a technique to extracellularly record and stimulate from nerves, muscles, and individual identified neurons in vitro while eliciting and observing different types of feeding behaviors in the feeding apparatus of Aplysia.

An<em&gt; In Vitro</emFizyolojik Hareketleri Besleme Motor Programlar ortaya çıkartılması ve kayıt için&gt; Hazırlık<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Bir<em&gt; In-vitro</emYetişkin Mouse myenterik Pleksus izole edilen enterik Nöronlar ve Glia bir&gt; hazırlanması

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

Vitro Sıçanlarda kolon Afferent liflerinin Elektrofizyolojik özellikleri karakterizasyonu

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

Vitro Tahlil türleri çalışmak için toplama Tau Protein ve uyuşturucu tarama

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Ritmik aktif hazırlanması Vitro yenidoğan kemirgen beyin-omurilik ve ince dilim

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...