Biz faydalı tartışmalar için MPIMP içinde RIKEN PSC ve Dr Bjoern Usadel Prof Kazuki Saito teşekkür ederim. TT Alexander von Humboldt kuruluşundan itibaren bir arkadaş grubu tarafından desteklenmektedir.

1. Numune Hazırlama <ol><li> Bitki malzemeleri hasat ve hemen dondurulur. </li><li> Donmuş bitki malzemeleri -80 ° C&#39;de karıştırıcı değirmen ile toz (veya harç) ve Falcon tüp veya Eppendorf tüp saklanır </li></ol> 2. Metaboliti Profilleme için Ekstraksiyon <ol><li> Bir kısım 2 ml Eppendorf tüp bitki materyali donduruldu. </li><li> Donmuş bitki materyali taze ağırlık miligram başına ekstraksiyon tamponu 5 ul ekleyin. </li><li> 25 ls -1 2 dakika süreyle Mikser Mill ile bir metal (ya da gilconia) topu ekleyin ve donmuş toz homojenize. </li><li> 12,000 rpm&#39;de 10 dakika santrifüj. </li><li> Santrifüj filtre NANOSEP için süpernatant aktarın. </li><li> 4000 devirde 2 dakika santrifüjleyin. </li><li> Kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de yeni Eppendorf tüp, ve mağaza için süpernatant aktarın. </li></ol> 3. LC-MS ile metabolit Profilleme <ol><li> HPLC kurma ve kolon fırını ve örnek tepsi sıcaklığını kontrol edin. </li><li> MS durumu ayarlama ve vakum ve ısıtma kılcal durumunu kontrol edin. </li><li> MS dedektör m / z kalibrasyon gerçekleştirin. </li><li> LC-MS için özler 50 ul cam şişeye aktarın. </li><li> LC-MS ile hülasa 5 ul enjekte edilir. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Xcalibur veya Metalign 4 yapılandırın ve işlenecek veri analizi seçin. </li><li> Tablo I bileşik sınıfına göre ilgilendiğiniz tespit zirvelerinin bir tablo hazırlayın. </li><li> Standart bileşiklerin ortak elüsyon tarafından zirveleri tanımlayın. </li><li> Annotate MS 2. analiz, literatür taraması, metaboliti veritabanı arama (Şekil 2, 12,13) ​​kullanarak zirveleri algılandı. </li></ol> 5.. Metabolik Pathway Tahmini <ol><li> Tespit edilen bileşikler ile bir yol oluşturmak mümkündür. Pik ek açıklamaları kullanarak yolun Tahmin tespit bileşiğin kimyasal yapısı dayalı olmalıdırmetabolik yolu 13 enzimatik fonksiyonlar bağlayarak tahmin ederek s. Yapılandırılması biyosentetik adımları hassas pik açıklama ile yapılmalıdır. Şeker parçası ve yaklaştırılmış pozisyonu öngörülmesi MS analizi ile tespit etmek çok zordur, çünkü, ancak detaylı kimyasal yapısı belirlenmesi, örneğin şeker yarısıdır için, bu basamakta vazgeçilmez değildir. Böyle hexoside ve pentoside olarak şeker tipinin belirlenmesi projenin son aşamasında şeker donör enzimatik tayini ile tespit edilecektir. Çoğunlukla yolunun oluşturulması tahmin küçük molekül gibi dehidrasyon tepki olarak, bazı durumlarda dışında büyük molekülün ara maddedir uygulanmalıdır. Örneğin atom molekül ağırlığı listesi, 16-H arasındaki farkın m / z-OH ve yarımı (oksidasyon), 14 m / z (Karbon atomuna) arasındaki farkın-OH ve-OMe (metilasyon) ve 162 m / z ( heksoz (glikozilasyon) için MW-H2O), tahmin için yararlıdır. Belirlenmesidokuların özgüllükler korelasyon analizi ile modifiye tipi metabolik yolun tahmini yardımcı olur. Böyle KEGG veritabanı (genel metabolik yolun Veritabanı <a href="http://www.genome.jp/kegg/" target="_blank">http://www.genome.jp/kegg/</a> ) ve PlantCyc ( <a href="http://plantcyc.org/" target="_blank">http://plantcyc.org/~~V</a> ), ilgilendiğiniz metabolik yolun tahmini için çok etkilidir. </li></ol> 6. Arabidopsis Orthologous Gen ID ile gen listesi hazırlanması <ol><li> Genomik veritabanından gen ID listesi indirin. </li><li> , Orthologous gen Arabidopsis gen ID ekle hedef bitki durumunda Arabidopsis değildir. </li><li> Senin yolun-of-ilgi genlerin bir listesini hazırlayın. Arabidopsis yolu veri ve gen ailesi veri Annotation TAIR web sitesi (mevcuttur <a href="http://www.arabidopsis.org/" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/~~V</a> ). Eğer Arabidopsis orthologous genlerin bir liste hazırlanmış ise, sonradan kombi yapabilirsinizne onları. </li></ol> 7. Co-ifade Gen Analizi <ol><li> Senin yolun-of-ilgi (Tablo II) iyi bilinen gen çiftlerini kullanarak korelasyon kontrol ederek yol için en iyi veritabanı aramak için hazırlanmış gen ID listesini kullanarak test edin. Co-ifadesi veritabanı veya gen ifadesi veritabanı ilgilendiğiniz fabrikasında mevcut değilse, Arabidopsis ortak ifadesi veritabanı Arabidopsis orthologous genlerin bir listesi ile birlikte kullanılmalıdır. Arpa durumda, pirinç, kavak, buğday, Medicago ve soya fasulyesinden, bitki türlerinin co-ifade analizi (Tablo II) de kullanılabilir. </li><li> Senin yolun-of-çıkarına bilinen genlerin bağlantıları dayalı Hedef ortak ifadesi ağ için bir çerçeve oluşturmak. </li><li> Ilişkili aday genler (sizin yolu-of-çıkarına bilinen genlerin bağlantıları arasında katsayı değerinin yaklaşık değeri içinde r &lt;0.4 ~ 0.90,) ekleyin ve pr kendi gen açıklama kontrolEn iyi aday genler (Şekil 3) bulmak için bu ağ bağlantıları edicted aileleri. Katsayısı değeri eşik ilişkili genlerin ağ yapısı ve yoğunluğuna göre koordine edilmelidir. </li><li> Sizin hedef patika için özel olarak daraltmak edebiliyoruz genlerin listesini yapın. </li><li> Lütfen aday genlerin organ özgüllükleri ve stres yanıtlarının gen ekspresyonu kontrol edin. </li></ol> 8. Yeni tanımında tahmin Tüm Bilgi Entegrasyonu <ol><li> Tahmin edilen metabolik yolu eş-ekspresyon analizi sorgu için kullanılmış olan iyi karakterize genler ekleyin. </li><li> Bu yolda uncharacterized parçaları kontrol edin, örneğin enzimatik adımları, taşıyıcı proteinler ve transkripsiyon faktörleri uncharacterized. </li><li> Bu eksik uncharacterized adımlar için en uygun gen açıklama tahmin. </li><li> Silico ge konusunda metaboliti profilleme ve aday genler sonuçlarını birleştirmekne ifade tahmin yolu dayalı. </li><li> Oksitlenmiş bileşik için P450, glikozit için asetillenmiş metaboliti, glycosyltransferase için asetiltransferaz örneğin gen işlevine göre tahmin edilen yolun, üzerinde aday genler düzenleyin. Amino asit dizilerinin analizi Filogenetik ağaç P450 ve glycosyltransferase gibi bazı geniş bir gen ailesi için yararlıdır. </li><li> Metabolit birikimi ve aday genlerin gen ekspresyon düzeyi arasında doku özelliklerine ya da stres yanıtların tutarlılığını kontrol edin. </li><li> Substrat ve strese duyarlı genler sağlamak için diğer metabolizma bağlantılarını kontrol edin. </li></ol> 9. Bio-Gen kaynakları kullanma belirlenmesi için deneyler <ol><li> Aday gen tespiti için deney kolaylaştırılması için bioresources kullanılabilirliğini kontrol edin. </li><li> Böyle KO mutant kütüphane ve tam uzunlukta cDNA kütüphanesi olarak biyo-kaynaklar kullanılarak gen fonksiyonunun belirlenmesi için bir deney yapın. Taşırı bitki ve nakavt mutantlar, enzimatik assay ve organizatörü bağlanma analizi hazırlanması ile genlerin fonksiyonel tanımlama için o deneyler, sizin tahmini en iyi aday genler için yapılmak zorundadır. Protein özellikleri karakterizasyonu ve bu dönüşüm için rekombinant protein ve gen klonlama hazırlamak için oldukça uzun sürer bu yana KO mutant kullanarak metabolit profil onay alındıktan sonra yapılması daha iyi aşırı bitkilerin hazırlanması için Rekombinant protein tayini. </li></ol> 10. Temsilcisi Sonuçlar Bu protokolde belirtilen entegre analiz prosedürü belirtilen deneysel amaçlı ve biyolojik ve analitik kombinasyonları tercihi bağlı olarak pek çok olanak vardır. Usul ve deneysel tasarım seçimi hedef yolu, bileşikleri ve bitki türlerinin temelinde düzgün yapılmalıdır. Bu protokolün açıklanan entegrasyon stratejisi foc olduğunu<html> birçok biyo-ve veri kaynağı etkin bir şekilde kullanımı ile bitki gen fonksiyonu ve yeni gen fonksiyonlarının keşif açıklama kullanılır. Beklenen sonuç kesin tahminin tek vaka ile sağlamak için söz edilir. Bu durum yeterli delillerin birlikte profilleri tarafından verilen mümkün değilse, deney başladı gerektiğini gösterir. Bu nedenle, her durumda, RT-PCR ile hedeflenen örneğin gen ifadesi profili gibi ek ön deneyler, gen fonksiyon için tahmini destekleyebilir. Tahmin Doğruluk ve doğruluğu yüksek kombinasyon değişimi nitel farklılıklar ve sayısına bağlı olarak ilişkilidir. Ayrıca, iyi bir aday ve geçerli sonuçlar sadece yolların doğru bir şekilde tahmin gelebilir. Tepe açıklama Örneğin literatür araştırması, referans bitki özü, MS n analizi, organ özgüllük ve mutant analizi 13, çeşitli yaklaşımların kombinasyonu ile yapılmalıdır. 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1.. Kombine yaklaşım ile gen açıklama deneysel akışının bakış. Bazı durumlarda, proje özel şartlar veya dokularda tespit edildiğinde yeni bir zirve, ve metabolizma içinde rolünü anlamak arzusu keşfi ile başlar. Diğer durumlarda ise projenin amacı gibi transkripsiyon faktörleri gibi önemli düzenleyici faktörlerin gen tanımlama ya da bir bulgudur. Deney Tasarımı farklı organlarda doku örnekleri geniş bir yelpazede kullanarak hedef yolunda metabolit düzeylerinin belirgin farklılıklar gösteren bir veri seti ile rendelenmiş, ve stres koşullarına maruz ayirt bitkilerin veya bitkiler için ve malzeme tabi olmalıdır metabolit profil. Mutant ve transgenik bitkilerin yanı sıra QTL barındırılmasının ıslah materyali de bu çalışmalar için uygun genetik materyali temsil eder. Roman yolunun Tahmin doğru dikkatlice yapılmalıdırörneğin yolu-of-ilgi gen ekspresyon verilerine göre organı menkul ve stres tepkileri gibi metabolotype farklı türü ile pik açıklama ve kombine yaklaşım. Son adım olarak, metaboliti ve transkript profilleme sonunda, web kaynakları silico analizi ve heterolog ifade ile gen ekspresyonu in vitro karakterizasyonu ile bir araya geldiğinde, onun işlevinin gen adayı ve aydınlatılması teyidi yol hangi yapılmalıdır ve metabolik yol içinde pozisyon. Kısaltmalar: QTL, Kantitatif Sürekli Loci. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig2.jpg" /> Şekil 2. Pik, not almak için kombinezonsal yaklaşımın İş akışı. Pik tanımlama ve açıklama standart bileşik tarafından, vahşi tip karşılaştırılması ve mutantlar knock out için bir prosedür, hedef zirve çok boyutlu kütle spektrometresi saf com kitle spektrumu sözveritabanları 12 pound. Kısaltmalar: DB, veritabanı; KO, knock-out, 1-D, tek boyutlu, 2-D, iki boyutlu, NMR, nükleer manyetik rezonans, IR, kızılötesi, MS n, kitle-kütle spektroskopisi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig3.jpg" /> Şekil 3. Antosiyanin yolun Örnek ortak düzenleme ağ analizi. Koekspresyon analizler Prime (kullanılarak yapıldı <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> 3 8,2 ATTEDII sürümü belirlenen verilere dayanarak) Pajek programı ( <a href="http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/" target="_blank">http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/</a> ). Pozitif korelasyon (r &lt;0.5) ağ bağlantıları yapmak için kullanılır. Kırmızı düğümü: oniki antosiyanin enzim genleri (At5g13930, CHS, TT4, chalcone sintaz; At3g55120, CHI, TT5, chalcone izomerize; At3g51240, F3H, TT6, flavanon 3-hidroksilaz; At5g07990, F3&#39;H, TT7, flavonoid 3&#39;-hidroksilaz; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonoid 3 - O-glukoziltransferaz; At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol redüktaz; At4g22880, ANS / LDOX, TT18, anthocyanidin sentez; At4g14090, A5GT, antosiyanin 5 - O-glukoziltransferaz; At5g54060, A3G2 &quot;XT, olası antosiyanin 3 - O-glikozit 2&quot; - O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, antosiyanin 5 - O-glikozit 6&#39;&#39; &#39;- O-malonyltransferase; At1g03940, A3GCouT, antosiyanin 3 - O-glikozit 6 &quot;- O - p-coumaroyltransferase) ve antosiyanin üretimi için iki transkripsiyon faktörleri (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) aday genler aramak için kullanılan bir r katsayısı ile bir eşik değeri ile Aday genler bir &quot;kümelerinin kesişimi&quot; tarafından bulundu arama &lt;./ Em sorgulanan tüm genler (Ondört antosiyanin biyosentetik genler) tarafından setleri kesişme tarafından sorgulanır 0.50 geçiniz. Ilişkili aday genler (68 genler) ve sorgulanan genleri (14 gen) içeren ortak ifadesi ağı, r&gt; 0.50 PRIME veritabanı kullanarak bir &quot;set arabağlantı&quot; tarafından yeniden inşa arama oldu. PRIME veritabanı ve ağlardan bir &#39;. Net&#39; dosyası ile biçimlendirilmiş çıktı dosyaları Pajek yazılımı kullanılarak çizildi. Mavi düğüm antosiyanin genleri ile ilişkili aday genler gösterir. <table border="1"><tbody><tr><td> tür </td><td> Binbaşı sekonder metabolit </td></tr><tr><td> Arabidopsis thaliana </td><td> Glukosinolat, flavonol, antosiyanin, sinapoyl türev </td></tr><tr><td> Populus trichocarpa </td><td> Flavonol, antosiyanin, salisilat türevi </td></tr><tr><td> Vitis vinifera </td><td> Flavonol, antosiyanin, tanen, stilben </td></tr><tr><td> Solanum lycopersicum </td><td> Flavonol, antosiyanin, glycoalkaloid, ilgili chrologenate, </td></tr><tr><td> Nicotiana tabacum </td><td> Flavonol, antosiyanin, nicotianamide, acylsugar ilgili chrologenate </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td> Glycoflavone, antosiyanin, sterol türevleri </td></tr><tr><td> Zea may </td><td> Glycoflavone, antosiyanin, benzoxazinone, sterol türevleri </td></tr><tr><td> Medicago truncatula </td><td> İsoflavon, antosiyanin, saponin, </td></tr><tr><td> Japonica Lotus </td><td> İsoflavon, flavonol, antosiyanin, saponin, </td></tr></tbody></table> Model bitki türleri Tablo I. Büyük sekonder metabolitleri. <table border="1"><tbody><tr><td> Co-ifadesi veritabanı </td><td> Adres </td></tr><tr><td> Bitki çapraz specler </td><td></td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V</a> </td></tr><tr><td> Planet </td><td> <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Bitki türleri </td><td></td></tr><tr><td> ATEED-II </td><td> <a href="http://atted.jp/" target="_blank">http://atted.jp/</a> </td></tr><tr><td> BAR </td><td> <a href="http://142.150.214.117/welcome.htm" target="_blank">http://142.150.214.117/welcome.htm</a> </td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop</a> </td></tr><tr><td> GeneCAT </td><td> <a href="http://genecat.mpg.de/" target="_blank">http://genecat.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Arabidopsis </td><td></td></tr><tr><td> ACT </td><td> <a href="http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser" target="_blank">http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser</a> </td></tr><tr><td> AthCoR@CSB.DB </td><td> <a href="http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html" target="_blank">http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html</a> </td></tr><tr><td> CressExpress </td><td> <a href="http://cressexpress.org/" target="_blank">http://cressexpress.org/~~V</a> </td></tr><tr><td> PRIME </td><td> <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td></td></tr><tr><td> RiceArrayNet </td><td> <a href="http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/" target="_blank">http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V</a> </td></tr><tr><td> Rice Dizi Veritabanı </td><td> <a href="http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml" target="_blank">http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml</a> </td></tr></tbody></table> Tablo II. Siliko ortak ifadesi analizi için mevcut gen ekspresyonu veritabanı.

<ol>
	<li>Aharoni, A., Keizer, L. C. P., Bouwmeester, H. J., Sun, Z. K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H. A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R. C. H., van der Voet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAAT+gene+involved+in+strawberry+flavor+biogenesis+by+use+of+DNA+microarrays.">SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays.</a> Plant Cell. 12, 647-661 (2000).</li><li>Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M. Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMe:+a+Web+site+that+assembles+tools+for+metabolomics+and+transcriptomics.">PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics.</a> In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).</li><li>Araujo, W. L., Ishizaki, K., Nunes-Nesi, A., Larson, T. R., Tohge, T., Krahnert, I., Witt, S., Obata, T., Schauer, N., Graham, I. A., Leaver, C. J., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+2-Hydroxyglutarate+and+Isovaleryl-CoA+Dehydrogenases+as+Alternative+Electron+Donors+Linking+Lysine+Catabolism+to+the+Electron+Transport+Chain+of+Arabidopsis+Mitochondria.">Identification of the 2-Hydroxyglutarate and Isovaleryl-CoA Dehydrogenases as Alternative Electron Donors Linking Lysine Catabolism to the Electron Transport Chain of Arabidopsis Mitochondria.</a> Plant Cell. 22, 1549-1563 (2010).</li><li>De Vos, R. C. H., Moco, S., Lommen, A., Keurentjes, J. J. B., Bino, R. J., Hall, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+large-scale+plant+metabolomics+using+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nat. Protoc. 2, (2007).</li><li>Hirai, M. Y., Sugiyama, K., Sawada, Y., Tohge, T., Obayashi, T., Suzuki, A., Araki, R., Sakurai, N., Suzuki, H., Aoki, K., Goda, H., Nishizawa, O. I., Shibata, D., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omics-based+identification+of+Arabidopsis+Myb+transcription+factors+regulating+aliphatic+glucosinolate+biosynthesis.">Omics-based identification of Arabidopsis Myb transcription factors regulating aliphatic glucosinolate biosynthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6478-6483 (2007).</li><li>Mutwil, M., Klie, S., Tohge, T., Giorgi, F. M., Wilkins, O., Campbell, M. M., Fernie, A. R., Usadel, B., Nikoloski, Z., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlaNet:+Combined+Sequence+and+Expression+Comparisons+across+Plant+Networks+Derived+from+Seven+Species.">PlaNet: Combined Sequence and Expression Comparisons across Plant Networks Derived from Seven Species.</a> Plant Cell. 23, 895-910 (2011).</li><li>Mutwil, M., Ruprecht, C., Giorgi, F. M., Bringmann, M., Usadel, B., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Wiring+of+Cell+Wall-Related+Genes+in+Arabidopsis.">Transcriptional Wiring of Cell Wall-Related Genes in Arabidopsis.</a> Molecular Plant. 2, 1015-1024 (2009).</li><li>Obayashi, T., Kinoshita, K., Nakai, K., Shibaoka, M., Hayashi, S., Saeki, M., Shibata, D., Saito, K., Ohta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATTED-II:+a+database+of+co-expressed+genes+and+cis+elements+for+identifying+co-regulated+gene+groups+in+Arabidopsis.">ATTED-II: a database of co-expressed genes and cis elements for identifying co-regulated gene groups in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 35, D863-D869 (2007).</li><li>Ogata, Y., Suzuki, H., Sakurai, N., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CoP:+a+database+for+characterizing+co-expressed+gene+modules+with+biological+information+in+plants.">CoP: a database for characterizing co-expressed gene modules with biological information in plants.</a> Bioinformatics. 26, 1267-1268 (2010).</li><li>Persson, S., Wei, H. R., Milne, J., Page, G. P., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+required+for+cellulose+synthesis+by+regression+analysis+of+public+microarray+data+sets.">Identification of genes required for cellulose synthesis by regression analysis of public microarray data sets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8633-8638 (2005).</li><li>Tohge, T., Yonekura-Sakakibara, K., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochemical+genomics+in+Arabidopsis+thaliana:+A+case+study+for+functional+identification+of+flavonoid+biosynthesis+genes.">Phytochemical genomics in Arabidopsis thaliana: A case study for functional identification of flavonoid biosynthesis genes.</a> Pure and Applied Chemistry. 79, 811-823 (2007).</li><li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+resources+for+mass-spectrometry-based+metabolomics:+A+user's+guide.">Web-based resources for mass-spectrometry-based metabolomics: A user's guide.</a> Phytochemistry. 70, 450-456 (2009).</li><li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+genetic+diversity,+informatics+and+metabolomics+to+facilitate+annotation+of+plant+gene+function.">Combining genetic diversity, informatics and metabolomics to facilitate annotation of plant gene function.</a> Nature Protocols. 5, 1210-1227 (2010).</li><li>Tohge, T., Kusano, M., Fukushima, A., Saito, K., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+metabolic+programs+following+exposure+of+plants+to+UV-B+irradiation.">Transcriptional and metabolic programs following exposure of plants to UV-B irradiation.</a> Plant Signal Behav. 6, (2011).</li><li>Tohge, T., Ramos, M. S., Nunes-Nesi, A., Mutwil, M., Giavalisco, P., Steinhauser, D., Schellenberg, M., Willmitzer, L., Persson, S., Martinoia, E., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+storage+metabolome:+profiling+the+barley+vacuole.">Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole.</a> Plant Physiol. , (2011).</li><li>Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+flavonol+profiling+and+transcriptome+coexpression+analysis+leading+to+decoding+gene-metabolite+correlations+in+Arabidopsis.">Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Transkriptomik ve metabolomik teknolojiler birkaç yıldır kullanılmış olduğunu göz önüne alındığında, gen açıklama yardım metabolomik için veri entegrasyon süreci genellikle bilinmeyen bir metaboliti temsil eden yeni bir zirve belirlenmesi ile başlar. Bu gerçek metabolit zirveleri nicel Varyans veya biyosentezleri sorumlu olduğu düşünülen yeni aday genler değerlendirmektir sonraki aşamaya yol açar. Bu protokolün açıklanan strateji, ancak üç büyük sorunlar i) pik açıklama zorluğu, ii) yolu tahmini karmaşıklığı, iii) gen ekspresyonu veri geni bilgi ve kaliteli çözünürlüğe sahip. İlk sorunuyla mücadele için, pik açıklama standart bileşikler veya MS n analizi, referans özü, mutant analizi, metaboliti veritabanı arama ve literatür taraması (Şekil 2, 12) Kombinatoryal yaklaşım kullanarak bilgi ko-elüsyon ile yapılmalıdır. Second sorunu, yolun tahmini tek doğru pik açıklama ile elde edilebilir. Metaboliti, ilgili birikimi genin gen ekspresyonu ile ilişkili alınmalıdır çünkü Ancak, doku spesifisite metaboliti profili, aynı zamanda, destek pik açıklama olabilir. Bu nedenle farklı dokular ve büyüme koşullarının kombinasyonu profilleri bu ikinci sorun için yararlı olabilir. Geni bilgi çözünürlüğü ile ilgili sorun, üçüncü sekansı verilerin bir ilerleme bağlıdır. Genom sekansı tamamlanmasından olmadan modeli bitki halinde, diğer modeli bitkilerde orthologous genler kullanılarak ko-ifade analizi yararlıdır. Amino asit dizisinin detaylı uyum karşılaştırma ve filogenetik ağaç analizi diğer türlere model organizmalar bağlamak için destek olabilir. Bu protokol, tüm metabolizması için uygundur. Bu kadar güçlü transkripsiyonel c tabi olmaya karakterize orta ve ikincil metabolizmaları analizinde en verimliontrol 1,5,11,16. Bazı örnekler, kükürt asimilasyon gerçekleştirilmelidir başardı co-ekspresyon analizi, β-oksidasyon, dallı zincirli aminoasit bozulması, klorofil arıza ve lizin katabolizması 3 genler, hücre duvarı metabolizmasını 10,7 ve kaskad 14 sinyalizasyon ışığı. Kombine genomik, metabolomik ve bilişim yoluyla genin fonksiyonu Annotation transkripsiyon faktörünün biyosentez gen ve doğrudan regülatörü için aynı zamanda fizyolojik bir süreç ve yanıtı anlamak için değil sadece (örneğin Şekil 3. 14). Modeli bitkilerden bitki türleri için bu yaklaşım geliştirmek için, bitki türleri arasında metabolik karşılaştırılması bazı genel metabolizması güçlü bir yaklaşımdır. Aynı bileşik farklı bitki türü tespit ve Örneğin, bazı orthologous genler bu bitki türü bulunur, orthologous genleri kullanarak çapraz türlerin ortak ifade analizi stron sağlayabilirsizin tahmini için g desteği. Bu yaklaşım, ek olarak kavak, Medicago, Arabidopsis yapılabilir gibi bitki türlerinin co-ifade analizi (6, Planet&#39;ten arpa, pirinç, buğday ve soya fasülyesi gibi önemli ekinler: <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg . de /</a> ; 9, COP: <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/</a> ;), 15 bir örneğe bakın.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Damıtılmış su ULC / MS grad </td><td> BIOSOLVE </td><td> 23214102 </td></tr><tr><td> Asetonitril (ACN) ULC / MS dereceli </td><td> BIOSOLVE </td><td> 01204102 </td></tr><tr><td> Metanol (MeOH) ULC / MS dereceli </td><td> BIOSOLVE </td><td> 13684102 </td></tr><tr><td> Sıvı kromatografisi için formik asit (HCOOH) ULC / MS dereceli </td><td> BIOSOLVE </td><td> 06914131 </td></tr><tr><td> Standart bileşikleri </td><td> Extrasynthese </td><td></td></tr><tr><td> Lineer iyon trap (BT) ESI-MS sistemi Finnigan-LTQ </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> HPLC sistemi Surveyor </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> C18 analitik sütun Luna (2), 2.0 mm çapa ve 150 mm uzunlukta, 100 bir gözenekboyutu ve 3 mm arasında dairesel parçacıklar </td><td> Phenomenex </td><td> 00F-4251-B0 </td></tr><tr><td> Xcalibur yazılım </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr></tbody></table>

annotation of plant gene function via combined genomics, metabolomics and informatics

Tam genom dizileri mevcuttur ve böyle nakavt mutantlar, yabani katılmalar ve gelişmiş üreme popülasyonları gibi biyo-kaynakların bolluğu hangi modeli bitki türlerinin sürekli genişleyen sayısı göz önüne alındığında, gen işlevsel açıklama için yükselen bir yük vardır. Bu protokolde, birleşik ortak ifade gen analizi kullanılarak bitki gen fonksiyon açıklama, metabolomik ve bilişim (Şekil 1) sağlanır. Bu yaklaşım, metabolomik vasıtasıyla hedef bileşiklerin tanımlaması ile birlikte belli bir metabolik proses dahil olmak üzere non-açıklamalı genlerin tanımlanmasını sağlamak için bilinen olasılıkla fonksiyonunun hedef genlerin kullanılarak teorisi dayanmaktadır. Stratejileri zahmetsiz olan bu hiçbiri rağmen her iki ileri ve ters genetik yaklaşımlar tarafından oluşturulan nüfus bu bilgileri uygulamak için ortaya konulmuştur. Doğal sonucu olarak bu yaklaşım aynı zamanda, yeni ya da özel se temsil bilinmeyen zirveleri karakterize bir yaklaşım olarak kullanılabilirsınırlı dokuları, bitki türleri veya şu anda bitki metabolizması anlamak için önemli bir çalışmadır stres tedavisinin, içinde İkinci basamak metabolitleri.

Watch this Scientific Journal Video about Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics at JoVE.com

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Metabolizma aracılığıyla genomik, co-geni ifade analizi ve hedef bileşiklerin tanımlama kombinasyonu genin işlevsel bir açıklama verir.

Kombine Genomics metabolomiks ve Bilişim ile Bitki Gen Fonksiyonu ek açıklama

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

annotation-plant-gene-function-via-combined-genomics-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Görüntüleme.  Max-Planck-Institut. Metabolizma aracılığıyla genomik, co-geni ifade analizi ve hedef bileşiklerin tanımlama kombinasyonu genin işlevsel bir açıklama verir.

Video: Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virüs indüklenen gen susturma (VIGS) Nicotiana benthamiana Ve Domates

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Biyoloji

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &amp;#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

A β-glucuronidase (GUS) Tabanlı Hücre Ölümü Testi

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Pamuk olarak Agrobacterium Virüs Bağlı Gen susturma Testi

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

mirMachine: A One-Stop Shop for Plant miRNA Annotation

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of gene expression, miRNAs play key roles in various cellular pathways, including both development and response to a/biotic stress, such as drought and diseases. Having high-quality reference genome sequences enabled identification and annotation of miRNAs in several plant species, where miRNA sequences are highly conserved. As computational miRNA identification and annotation processes are mostly error-prone processes, homology-based predictions increase prediction accuracy. We developed and have improved the miRNA annotation pipeline, SUmir, in the last decade, which has been used for several plant genomes since then. 
This study presents a fully automated, new miRNA pipeline, mirMachine (miRNA Machine), by (i) adding an additional filtering step on the secondary structure predictions, (ii) making it fully automated, and (iii) introducing new options to predict either known miRNA based on homology or novel miRNAs based on small RNA sequencing reads using the previous pipeline. The new miRNA pipeline, mirMachine, was tested using The Arabidopsis Information Resource, TAIR10, release of the Arabidopsis genome and the International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC) wheat reference genome v2.

Herein, we present a new and fully automated miRNA pipeline, mirMachine that 1) can identify known and novel miRNAs more accurately and 2) is fully automated and freely available. Users can now execute a short submission script to run the fully automated mirMachine pipeline.

mirMachine: Tesis miRNA Ek Açıklaması için Tek Noktadan Çalışan Bir Dükkan

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and amending cellular functions. These interactions are involved in a wide range of phenomena such as signal transduction, pathogen response, cell-cell interactions, metabolic and developmental processes. In the case of transcription factors, these interactions may lead to oligomerization of subunits, sequestering in specific subcellular contexts such as the nucleus, cytoplasm, etc., which, in turn, might have a more profound effect on the expression of the downstream genes. Here, we demonstrate a methodology to visualize in vivo tripartite interaction using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) based F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) involving Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Two of the proteins selected for this demonstration interact as BiFC partners, and their reconstituted fluorescence activity is used to assay FRET-FLIM with the third partner. Four to five-week-old growth-chamber-grown Nicotiana benthamiana plants have been used as the model plant system for this demonstration.

Here we present, a method to visualize ternary complex formation between three protein partners using fluorescent-tagged proteins by BiFC based FRET-FLIM assay. This method is valuable for studying protein-protein interaction complexes in vivo.

BiFC-FRET-FLIM Tahlilinde MADS Kutusu Transkripsiyon Faktörünün İki Monomeri ile Kalsiyum Sensör Proteini Arasındaki Üçlü Etkileşimin Belirlenmesi

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.