Protein-protein etkileşimlerinin incelenmesi, birçok biyolojik işlemin düzenlenmesinin anlaşılmasını sağlar. Burada Y John ayakkabı ve co tarafından baş harfle açıklanan bir prosedürü gösteriyoruz. 2007'de, yazarların üç protein molekülü arasındaki üçlü etkileşimi doğrulamak için FRET ile birlikte BiFC'yi kullandıkları işçiler.
Bununla birlikte, FRET ölçümlerini doğrulamak için floresan ömür ölçümlerini bu prosedüre dahil ettik. Üçlü etkileşimi göstermek için homodimerize olduğu bilinen bir protein seçtik. Ayrıca, bu protokolde C proteini olarak adlandırılan bir kalsiyum protein sensörü ile etkileşime girmek için şirket içinde de doğrulanmıştır.
MNC proteinleri sitoplazmda etkileşime girer. Bu teknikte iki protein bölünmüş YFP proteinleri ile etiketlenir. Etkileşimleri, FRET bağışçısı olarak hareket eden CFP ile etiketlenen üçüncü etkileşim ortağına FRET kabulörü olarak hareket eden işlevsel YFP'nin iadesiyle sonuçlanır.
Bizim durumumuzda M ve C genleri olan ilgi genlerinin kodlama dizilerinin PCR tarafından yükseltilmesi ile başlayın ve uygun giriş vektörlerinde klonlayın. Plaka içeren antibiyotiklerde seçilen klonları, sindirimi ve DNA dizilimini kısıtlayarak doğrulayın. Yeniden inşa edilen CDS'leri giriş klonlarından hedef vektörlere harekete geçirin.
Bu denemede kullanılan tüm vektörler tablo bir'de listelenmiştir. Son olarak, agrobakteri GV3101 hücrelerini hedef vektörlerle elektroporasyon ile dönüştürün. Burada Nicotiana Benthamiana bitkilerini yetiştiriyoruz, hala bir yetiştirme odasında kontrollü koşullarda dört ila altı yaprak aşaması.
Toprak ezmesi, kakao turbası ve kompostu 2:1:1 oranında karıştırarak toprak karışımını hazırlayın. Toprak yatağı yapmak ve biraz suyla doyurmak için bu karışımın bir inç kalınlığında tabakasını plastik bir tepsiye yayın. Toprağın üzerine yaklaşık 200 tohum serpin ve yaklaşık bir santimetre duran suya daha büyük bir tepsiye aktarın.
Nem odası oluşturmak için bu tepsiyi plastik sargı ile örtün. Bu tepsiyi 16 saat ışık ve sekiz saat karanlık döngü ile 23 derecelik bir büyüme odasına aktarın. İki hafta sonra genç fideleri su doymuş toprak karışımı içeren küçük üç ila dört inç saksılara aktarın.
Bu saksıları plastik bir tepsiye yerleştirin ve dört hafta daha oda büyütmek için aktarın. Agroinfiltrasyon için bakteri suşlarının taze alt kültüre edilmesi ve uygun oranlarda P19 agrobakteri suşu ile karıştırılması gerekir. BiFC ve FRET yapılarını içeren GV3101 agrobakteri suşlarını 10 ml'lik çizgi plakalardan aşılayarak bu işleme başlayın.
uygun antibiyotikler içeren et suyuna. Ayrıca, transgene susturma önlemek için eklenen Agrobacteria P19 suşu kültürünü başlatın. Şişeyi alüminyum folyo ile örtün ve bir inkübatör çalkalayıcıda tutun, 16 saat boyunca 170 RPM'de 28 derece santigrat derece ayarlayın.
Bir gecede büyümeden sonra, bu kültürlerin 1 ml'si, bir spektrofotometre kullanarak 600 nanometredeki optik yoğunluğu ölçmek için tek kullanımlık bir kübite aktarılır. Son OD 0,5 ve P19'unki toplam 2 ml hacimde 0,3 olacak şekilde suşlar içeren uygun BiFC ve FRET ortağının kültürlerini karıştırın.
Bu oranlara ulaşmak için bu hesaplamalar için ekranda gösterilen formülü takip ediyoruz. 3000G'deki karışık agrobakteri kültürlerini oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin ve süpernatantı dikkatlice atın. Peletleri 2 ml'de askıya alın.
sızma arabelleği. Homojen bir hücre süspansiyonundaki hücreleri tamamen yeniden askıya almak için bir girdap karıştırıcı kullanmanız gerekebilir. Bundan sonra tüpleri üç saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Bu arada, içine sızacağı yapı karışımı için her bir bitki saksısını etiketleyin. 1 ml. iğnesiz bir şırıngayı agrobakteriyal karışımla doldurun.
Şırınd ucunu yavaşça ama sıkıca tamamen genişletilmiş bir yaprağın abaksiyel tarafına bastırın ve yaprağı diğer taraftan destekleyin. Çözelti, şırıng ucuna göre iki ila üç kat daha eşdeğer yaprak alanında dolana kadar pistonu hafifçe itin. Bir yaprakta dört noktaya kadar bakteri karışımına sızın ve bir tür sızma için üç ila dört yaprak için bu prosedürü tekrarlayın.
Ayrıca, sızma için yapı başına en az iki bitki ekleyin. Çapraz bulaşmayı önlemek için ellerinizi %70 alkolle silmeyi veya eldivenlerinizi değiştirmeyi unutmayın. Tüm tencereleri bir tepsiye aktarın ve aynı büyüme durumunda büyüme odasında kuluçkaya yatırın.
Agroinfiltrated yaprağın küçük bir kısmını floresan mikroskop kullanarak kontrol edin. Hücrelerde hem YFP hem de CFP floresan tespit edildiğinde BiFC FRET-FLIM tahlil için konfokal mikroskopa geçilir. Bizim durumumuzda, bu analiz agroinfiltrasyondan üç gün sonra gerçekleştirildi.
Artık bitkiler mikroskop altında görselleştirilmeye hazır olduğu için kare yaprak örneklerini beş ila 8 mm arasında kesin. Üzerine temiz bir kapak kayması yerleştirin ve mühürleyin.
Bu örnekleri konfokal lazer tarama mikroskobunda görselleştirin. Bu prosedürde, iki protein arasındaki etkileşimi belirlemenin ve ölçmenin temeli, FRET donör ortağının FRET'in verimliliğini hesaplamak için kullanılan alıcı ile etkileşimi üzerine floresan ömrünün azalmasıdır. Üçlü etkileşim durumunda karmaşıklık daha da artar, çünkü bu durumda FRET kabul eden tek bir molekül değil, işlevsel bir FRET kabul edici floroforu olmak için in vivo olarak yeniden inşa edilmesi gereken bölünmüş bir YFP BiFC çiftidir.
FRET-FLIM'i gerçekleştirmek için, donör moleküllerin floresan ömrünü, önce tek başına ve daha sonra bir FRET ortağının varlığında belirlemeliyiz. FLIM uygulamasını konfokal lazer tarama mikroskobunda açın, konsolu başlatın ve floresan ömrünü ölçmek için desen tanıma foton sayımını kullanın. Standart tüm foton sayım ölçüm modunu seçin.
İki tür agroinfiltratlı bitki alacağız. Biri CCFP geni olan diğeri MYFP ile birlikte CCFP'ye sahip olan Çünkü M proteininin etkileşimi BiFC ve Y2H kullanılarak C proteini ile zaten doğrulandı, bu etkileşim çifti ile iyi FRET verimliliği bekliyoruz. Şimdi önce CCFP agroinfiltrated yaprağını tarayıp iyi CFP floresan gösteren bir hücre arıyoruz.
Mikroskop ayarları ekranda gösterilir. Örnek, nabız başına yaklaşık 0,1 foton elde etmek için yeterli lazer gücünde aydınlatıldı. Değişken floresan yoğunluğuna sahip numuneler için, ömür boyu ölçüm için gerekli yeterli fotonları toplamak için 50 kare yakalayacağız.
CFP'nin onay adaptasyonu nedeniyle iki floresan ömrü sergilediği bilindiğinden, N değerini ikiye eşit tutarken üstel bir rekonsvolüm modeli kullanarak verileri besliyoruz. Bu ayarlarda, iki ömür bir ve 3,2 nanosaniyede görülebilir. Sonraki tüm hesaplamalar için daha yüksek ömrü kullanacağız.
Şimdi CCFP ve MYFP arasındaki FRET'i ölçmeye hazırlanıyoruz. Bunun için CCFP ve MYFP ile agroinfiltrated tesisinden yaprak örneğini kullanalım. Hem CCFP hem de MYFP'yi ifade eden bir hücre arıyoruz ve tam 40 nanometre darbe lazeri ve 514 nanometre beyaz ışık lazeri kullanarak onları heyecanlayarak ilgili emisyon modellerini onaylıyoruz.
Bundan sonra, CCFP'nin ömrünü ölçmek için daha önce kullandığımız ayarları kullanarak CFP'nin ömrünü ölçmek için FLIM konsoluna geçiyoruz. Ancak bu kez hücre, CCFP ile potansiyel olarak etkileşime girebilen ve CCFP ömründe bir azalmaya neden olabilen MYFP'yi de ifade ediyor. N üstel rekonsvolüm modeli kullanılarak elde edilen grafiği ikiye eşit N ile okuduğumuz için, CFP ömründe 3,2 ila 2,6 nanosaniye arasında bir azalma vardır.
Şimdi yazılımda FRET konsolunu başlatıyoruz ve yazılımda sağlanan denkleme tartışmasız ömür girerek FRET verimliliğini hesaplıyoruz ve gözlemlenen FRET verimliliği% 56 Şimdi son adıma geçelim, yani üç ortak arasındaki etkileşimi görselleştirelim. Bunun için CCFP ve MYFPN ile birlikte sızmış bir tesisten yaprak örneğini MYFPC ile alıyoruz. Yaprak bitkisini hem CFP hem de iki M proteini arasındaki etkileşimden kaynaklanan yeniden inşa edilmiş YFP floresanını gösteren bir hücre için tararız.
Daha önce kullanılan lazer ve emisyon dalga boylarını kullanıyoruz. Daha sonra, 514 nanometre lazeri kapatıp FLIM konsoluna geçiyoruz. MYFP dimer CCFP ile etkileşime girerse.
MYFP ile etkileşimi sırasında gözlemlendiği gibi CCFP'nin ömründe bir azalma görmeliyiz. Bununla birlikte, CCFP MYFP dimer ile etkileşime giremezse, floresan ömrü 3,2 nanosaniyede görünmelidir. Yukarıda belirtildiği gibi benzer ayarları kullanarak, CFP ömrünü yeniden inşa edilmiş YFP'nin varlığında ölçüyoruz.
N üstel rekonsvolution modelini kullanarak grafiği ikiye eşit olarak sığdırıyoruz ve FRET konsoluna geçiyoruz. Ve evet CFP ömründe 3.2'den 2.3 nanosaniyeye kadar bir düşüş var. FRET verimliliğini yukarıda açıklandığı gibi hesaplıyoruz.
Hesaplanan FRET verimliliği % 55 Burada FRET donör ortağının FRET kabul edenin varlığında ve yokluğunda floresan ömrünü ölçmek için FLIM'i kullandık. İki protein arasında olumlu bir etkileşim varsa, donörün floresan ömründe bir azalma bekleniyordu. Pozitif kontrol durumunda, ccfp ve MYFP'dir.
Donörün floresan ömründe 3,3 ila 2,5 nanosaniye arasında bir azalma gözlemliyoruz ve FRET verimliliği% 56 yeniden inşa edilen benzer bir egzersizdi. İki amonomer ve C proteini arasındaki etkileşimden kaynaklananYFP, donörün floresan ömrünün 2,6 nanosaniyeye düşmesine yol açan pozitif bir FRET etkileşimine neden oldu. Hesaplanan FRET verimliliği bu durumda yaklaşık% 55 idi. FRET donörün floresan ömründeki azalma, bu proteinler arasındaki üçlü etkileşim için güçlü bir kanıt sağlar.
Burada açıklanan protokol, canlı hücrelerde üçlü protein-protein etkileşimlerini belirlemek için güçlü bir araçtır. Bu prosedür ayrıca, herhangi bir protein kompleksinin işlevini ve fizyolojik önemini çözmede önemli olan sonuç komplekslerinin hücre içi lokalizasyonunu belirlemeye yardımcı olabilir. Sonuç olarak, BiFC tabanlı FRET-FLIM tahlil, hem hayvansal hem de bitki sistemlerinde protein-protein etkileşimi çalışmalarında yardımcı olabilecek üçlü protein etkileşimlerinin önemli yönlerini incelemek ve karakterize etmek için bir fırsat sunmaktadır.
