Yüksek verim, maya hücreleri için protokolümüz, aynı anda binlerce mikrokolon için büyüme ve gen ekspresyonunun izlenmesini sağlar. Suşlar arasındaki, ortamlar arasındaki ve hatta paylaşılan bir ortamda yetişen genetik olarak özdeş hücreler arasındaki fark ölçülebilir. Protokol, gen ekspresyon muhabirlerinin ortalama büyüme hızı ve ortalama floresan yoğunluğu hakkında kesin tahminler sürmektedir.
Ek olarak, birçok bireysel mikrokolonya test edildiği için, büyüme ve ifade değerlerinin tüm dağılımlarının kesin tahminleri elde edilir. Bu protokol, deneysel plakanın hazırlanması ve hücrelerin görüntüleme için hazırlanması olmak üzere iki ana adımı izler. Hücreler seyreltme ve karıştırmadan hemen sonra kaplanmalıdır.
Bu yüzden önce deneysel plakanızı kurmanızı öneririz. Bu protokol boyunca hücrelerin tekrar tekrar karıştırılmasını fark edeceksiniz, bu da kaplamaya kadar olan adımlarda son derece önemlidir. Deney günü, test için kullanılan tüm medya ve diğer çözümler, mikroskop görüntülerinde görünebilecek kristalleri çıkarmak için zaten steril olsalar bile iki mikron filtre ile filtrelenmelidir.
Buna deneysel medya ve Concanavalin A çözümü dahildir. Ardından, mikroskop plakasını hazırlayın. Kuyuların cam yüzeyini enkaz ve çiziklerden uzak tutmak için, her zaman plakanın altında tiftik ve statik serbest mendil bulundurun.
Sterilize edilmiş bir tezgahta steril teknik kullanın. Mikroskop plakasının her kuyusuna 25 mililitre 1X Concanavalin A çözeltisi ve pipet 200 mikrolitre filtreleyin. Uygun yüksekliği sağlamak için pipet stabilize etmenizi öneririz.
Concanavalin A'nın kuyuların altını eşit şekilde kaplamasını önleyebilecek hava kabarcıklarını çıkarmak için mikroskop plakasını tiftik ve statik serbest mendille 411 kez G'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Concanavalin A çözeltisini içeren plakayı bir ila iki saat dinlendirin. Deneyleriniz boyunca tutarlı olun.
Concanavalin A inkübasyonundan sonra, Concanavalin A'yı 96 kuyu plakasından bir emiş cihazıyla veya burada gösterildiği gibi çözeltiyi zorla plakadan atarak temizleyin. Bazı damlacıklar kalacak. Daha sonra, her kuyuya 400 mikrolitre steril su ekleyerek kuyuları yıkayın.
Concanavalin A çözeltisini çıkardıktan hemen sonra suyu ekleyin. Tabağın kuru oturmasına izin vermeyin. Concanavalin A'yı kuyuların cam yüzeyinden yerinden çıkarmamak veya çıkarmamak için plakanın kaplanmış tabanına pipet uçlarıyla dokunmaktan kaçınmak önemlidir.
Suyu Concanavalin A çözeltisi ile aynı şekilde çıkarın ve mikroskop plakanıza hemen 185 mikrolitre deneysel ortam ekleyin. Tabağın kuru oturmasına izin vermeyin. Plaka artık 50 mikrolitre seyreltilmiş hücrenin eklenmesi için hazırdır.
Önceden yetiştirilmiş randomize 96 kuyu plakanızı alın. Deneysel sorunuz, hücrelerin doymuş veya günlük aşamasında olup olmadığını ve testte kullanılması gereken randomize çoğaltmaların sayısını belirleyecektir. Folyo kaplamayı çıkarırken çapraz kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için plakanızı 411 kez G'de iki dakika santrifüjleyin.
Plakanızı kullanırken asla eğmediğinizden emin olun. Maya ve ortam plakayı kaplayan folyo ile temas ederse, kuyularda kirlenme olabilir. İlk önce seri seyreltmelerinizi gerçekleştireceğiniz plakaları hazırlayın.
Seyreltme plakalarınızın her birine 90 mikrolitre deneysel ortam ekleyin. Sonra hücrelerinizi hazırlayın. Folyoyu 96 kuyu tabağınızdan çıkarırken, bir kuyudan damlacıkların diğerine girmesini önlemek için son derece dikkatli olun.
Maya, santrifüjleme nedeniyle plakanın dibinde yoğunlaştırılacaktır. Seyreltme sırasında hücrelerin iyi karıştığından emin olmak için, her zaman daha büyük bir ortam hacmine küçük bir hücre hacmi ekleyin. Daha sonra karışıma başka bir büyük hacimli ortam ekleyin.
Pipet karışımını her adımda kuvvetlice karıştırdığından emin olun. Bu videoda, mikroskop plakasında kuyu başına yaklaşık 4.000 hücrenin son konsantrasyonunu elde etmek için 10.000 kat seyrelteceğimiz doygunlukta maya hücreleri ve sentetik komple ortam için seyreltmeler gerçekleştirdik. Hücreleri yeniden askıya almak için pipet yukarı ve aşağı kuvvetli bir şekilde ve pipet ucunu dairesel bir hareketle kuyunun etrafında hareket ettirin.
Karıştırdıktan sonra, burada kuyu A1'de görüldüğü gibi herhangi bir kuyuda yerleşik maya izi kalmamalıdır. Burada gösterilen diğer tüm kuyular karşılaştırma için yeniden askıya alınmamıştır. Önceden yetiştirdiğiniz plakanızdaki hücreleri, örneğin hemositometre ile sayın ve aynı kuyuya eşit oranlarda ekleyeceğiniz diğer suşlarla birleştirin. Burada, önceden yetiştirildiğimiz tabaktan hücreleri bire bir oranda floresan referans suşu ile karıştırıyoruz.
Hücre konsantrasyonlarınız standart hale getirildiğinde, ilk seri seyreltme plakasına on mikrolitre hücre ekleyin. Daha sonra 200 mikrolitrelik son hacme 100 mikrolitre ortam ekleyin. Hem hücrelerin hem de medyanın eklenmesiyle pipet kuvvetli bir şekilde karışır ve pipet ucunu dairesel bir hareketle kuyuların etrafında hareket ettirilir.
Bu noktadan sonra, hücreler mikroskop plakasına eklenene kadar, protokol boyunca hızlı bir şekilde ilerleyin. Daha sonra, ilk seri seyreltme plakasından ikinci seri seyreltme plakasına on mikrolitre maya ekleyin. O zaman buna 100 mikrolitre deneysel ortam ekleyin.
İyice karıştırın. Mayanızın flocculate eğilimi yoksa, bu adımdan hemen sonra mikroskop plakasına eklenmeye hazırdır. Hemen kaplamaya devam edin.
Bununla birlikte, kullandığınız maya suşlarının flokülasyon eğilimi varsa, aşağıdaki isteğe bağlı sonication adımı gerekli olacaktır. Sonicating ise, ilk pipet maya çözeltisini sonication önce bir kez daha karıştırın. Seyreltilmiş mayayı sonicator üzerine yerleştirin ve 96 kuyu pimlerini her bir kuyunun çözeltisine batırın, ancak kuyunun dibine dokunmayın.
Floküle maya hücrelerini parçalamak için yeterince güçlü olan, ancak hücreleri öldürmeyen veya yüksek stres tepkilerine neden olmayan sonication programını ayarlayın. Belirli bir deney için en iyi sonication programını tanımlamak için bazı testler gerekebilir. Program tamamlandıktan sonra, hücreleri çıkarın ve hemen bir sonraki adıma geçin.
Mikroskop plakasına ikinci seri seyreltme plakasından 15 mikrolitre maya ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için, ancak plakanın kuyularının altına bağlı Concanavalin A'yı rahatsız etmemek için dikkatlice yapın. Ardından, mikroskop plakasına 400 mikrolitrelik son hacme 200 mikrolitre deneysel ortam ekleyin.
Pipet dikkatlice karıştırın. Plakayı nefes alabilen bir zarla örtün. Plakanın kenarlarının iyi kapalı olduğundan emin olun.
Maya hücrelerinin plakanın altındaki Concanavalin A'ya bağlanması için mikroskop plakasını altında tiftik ve statik serbest doku ile 411 kez G'de iki dakika santrifüjleyin. Plaka artık görüntülenmeye hazır. Mikroskopta, plakanın üst ve alt kısmını tiftik ve statik serbest mendille silin ve döküntüleri gidermek için basınçlı havayı plakanın dibine üfleyin.
Plakayı mikroskopa yerleştirin. A1 kuyusunun sol üst köşede olduğundan ve mikroskobun hücre büyümesi için doğru sıcaklığa ısıtıldığından emin olun. Ayrıca plakanın mikroskopa düzgün bir şekilde sıkıştırıldığından ve plakanın tabanının düz olduğundan emin olun.
Plakanın plastik bir kapağı varsa, mikroskopiye başlamadan önce bunu çıkarın. Bu, aşağı akış analizi için iyi görüntüler yakalamak için önemli olacaktır. Tüm mikroskop plakasını görüntülemek için X ve Y koordinatları ve odak konumları ile otomatik olarak oluşturulan bir dosyayı yüklüyoruz.
Önceden oluşturulmuş bir dosya kullanıyorsanız, hücrelerin doğru odak düzleminde olduğundan emin olmak için mikroskop plakasındaki birkaç konumu kontrol edin. Odak düzleminin hücrelerin biraz üzerinde olması yararlıdır, böylece koyu bir jantla çevrilidirler ve arka plandan daha parlaktırlar. Deneme için kullanacağınız zaman noktası sayısını ve zaman noktası aralığını ayarlayın.
Hem büyüme hızı hem de floresan yoğunluğu verilerini topluyorsanız, bir floresan görüntüleme programı da ayarlayın. Görüntülenecek her kanaldaki parlaklığı, mikroskop plakasındaki hiçbir konumun aşırı pozlanmaması için ayarlayın. Canlı modda değilken kullanacağınız pozlamayı test edin.
Floresan görüntüler için floresan çıplak gözle görülmelidir. Ancak aksi takdirde düşük pozlama değerleri ayarlamanızı öneririz. Tek tek hücreler tarafından tohumlanan uygun aralıklı koloniler plakanın yüzeyi boyunca bir monolayerde büyür.
Sonuç olarak, otomatik görüntü analizi birçok bireysel mikrokolon için büyüme hızını doğru bir şekilde hesaplamak için kullanılabilir. Floresan belirteçler, aynı kuyuda büyüyen birden fazla suşu ayırt etmek için kullanılabilir. Sonuç olarak, paylaşılan bir ortamda büyüyen bireysel mikrokolonlar için büyüme oranlarının tüm dağılımları hesaplanabilir.
Bu deneyle elde edilebilen büyük numune boyutları, farklı suşlar veya büyüme koşulları arasındaki ortalama farklılıkların kesin olarak tahmin edilmesine de olanak sağlar. Burada, bir dizi mutasyon biriktirme çizgisinden tek kuyularda yetişen eşleştirilmiş koloni kümeleri ve kuyu içi GFP referans kontrol kolonileri için büyüme oranları gösterilmiştir. Hücrelerin mikroskop plakasında topaklanma gözlenirse, kümeler kaplamadan önce sonication ile parçalanmalıdır.
Parçalanamayan kümelerdeki hücreler plaka yüzeyi boyunca düzlemsel bir mikrokolonyda büyümez ve bu da büyüme hızının doğru hesaplanmasını imkansız hale getirir. Tüm ortamlar mikrokolony büyüme hızı tahlili ile uyumlu değildir. Maya özü içeren veya düşük pH'a sahip medya da dahil olmak üzere bazı medya formları, hücrelerin Concanavalin A.'ya bağlanmasını önler.
Hücreleri çok yoğun bir şekilde kaplamaktan kaçınmak önemlidir. Hücreler çok yakından kaplandığında, daha hızlı büyüyen mikrokolonlar daha erken zaman noktalarında birleşir ve burada renk izleme kaybı olarak gösterilir. Bu etki, yavaş büyüyen kolonilerin yeterli zaman noktalarından veri toplanmadan önce komşularıyla birleşme olasılığı daha düşük olduğu için büyüme hızı tahminlerini önyargılı hale getirebilir.
Büyüme koşullarına bağlı olarak, hücrelerin bir alt kümesi büyümeye başlamadan önce bir gecikme evresine uğrayabilir. Mevcut tüm zaman noktalarına bir büyüme eğrisi sığdırmak yerine büyüme hızını hesaplamak için koloni alanlarını kullanırken bunu hesaba katmak önemlidir. Açıklanan protokol, maya büyümesi ve evrimi ile ilgili çok çeşitli soruları araştırmak için kullanılabilir.
Esnek mikro plaka formatı, diğer maya türlerine, farklı büyüme koşullarına, diğer mikroplara ve potansiyel olarak kültürdeki diğer hücrelere uyarlanabileceği anlamına gelir.
