Anthony Renda Victoria Yüksek Lisans Burs Ödülü bir üniversite tarafından desteklenmiştir. Myre ve Winifred Sim Fonu, İnovasyon hibe, bir British Columbia Bilgi Geliştirme Fonu için bir Kanada Vakfı - Bu araştırma, Doğa Bilimleri ve Kanada Discovery Hibe Mühendislik Araştırma Kurumu, bir NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü (RN), bir Victoria Vakfı tarafından desteklenen ve Doğa Bilimleri ve Kanada Araştırma Araçları ve Enstrümantasyon Hibe Mühendislik Araştırma Konseyi. Biz mükemmel fare hayvancılık Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald ve Daniel Morgado teşekkür ederiz.

1. Pompa implantasyonu <ol><li> Pompası implantasyonu önce, doldurma ve hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olmak Alzet mini-osmotik pompalar (Alzet, Model 2002, Cupertino, ABD) hazırlamak. Ozmotik mini pompa Bu model 14 gün boyunca 0.5 ul / saat arasında bir oranda bir çözüm sunar. Steril koşullar olun. Boş ve dolu pompaları tartılır. Deneme (10 gün sonra implantasyon) bitiminde, pompada kalan sıvı bir şırınga ve iğne ile çıkarılır ve pompalanan hacmi hesaplamak için tartılır edilebilir. </li><li> Kontrol solüsyonu ile Pompalar (% 0.9 w / v, Teknova, S5819, Hollister, ABD) serum fizyolojik içerirler. (-)-Nikotin hidrojen tartrat tuzu (Sigma, kedi # N5260) tuzlu su ile seyreltilir (% 0.9 w / v) ve 0.22 um bir şırınga filtresinden uç filtre edilerek sterilize nikotin çözeltisi, bir 1 M stok solüsyonu hazırlamak üzere. Daha önce 10 gün boyunca 0.4 ve 2 mg / kg / saat (nikotin, serbest baz olarak hesaplanır) azından nikotin tatbik var. </li><li> Üç tuzlu su banyoları (üç hazırlayın10 cm tuzlu) petri doldurdu. Pompa doldurulmuş ve kapatılmış edildikten sonra, dış kabuk üzerinde ilacın herhangi izlerini kaldırmak için her başarılı tuzlu su bulunan pompa iyice yıkayın. Immerse ayrı salin kaplarda kontrolü ve nikotin pompalar tutarak, cerrahi kadar, depolama için tuzlu su çözeltisi içinde pompalar doldurulur. </li><li> Sağlıklı bir kurtarma teşvik ve ameliyat sonrası enfeksiyon riskini azaltmak için, uzun vadeli iyileşme için hazırlanan temiz kafesleri var. </li><li> Hemen ameliyat sonrasında kısa vadeli iyileşme için, bir ısıtma yastığı ve bir ısı lambası içeren bir kafes hazırlar. </li><li> Kronik nikotin etkilerini araştırmak için biz 5 ila 6 homozigot α4YFP var knock-in her grupta farelerin (2-3 aylık) (kontrol veya nikotin). Α4YFP knock-in fare hattı C57BL/6J fare suşu, 10 nesiller için backcrossed edilmiştir. Hepimiz farelerin yaş ve cinsiyet çalışmaları için aynıdır ve tüm ameliyatlar değişkenliği en aza indirmek için aynı gün emin olun. HY önlenmesi içinAmeliyat sırasında ve sonrasında farelere pothermia, steril cerrahi örtü kaplı bir ısıtma yastığı ile cerrahi masa donatmak. </li><li> 3 L / dk oksijen ve% 3 izofluran ile α4YFP vuruntu-fare indükleyin ve daha sonra 2.5 L / dk oksijenin az anestezi ve% 1 izofluran korumak. Ameliyat bitiminde izofluran hızla sistemi temizler çünkü izoflurandan tercih ve fareler ~ 2 dakika içinde bilinçli ve hareketlidir. Kornea hasarı önlemek için (Yırtma-Gel, Novartis) hemen düşer göz uygulayın. </li><li> Pompalar ensesine bir cilt kesisi ile deri altına implante edilir ve pompa geri dorsalinde aşağı kaudal itilir. Mat% 95 etanol kürk ile ön ayakları arasında arka alanı silin. 0.8mm Graefe forsepsi ile cilt (Güzel Bilim Araçları, 11050-10) sıkın ve iris makası (Güzel Bilim Araçları, 14060-10) kullanarak 1 cm merkezi yanal kesim yapmak. </li><li> Standart desen makas eklemek, pompa için bir subkutan alanı oluşturmak içins (Güzel Bilim Araçları, 14101-14) insizyon içine ve hayvanın kuyruk sonuna doğru dikkatle itin. </li><li> 1.0 mm Graefe forsepsi (Güzel Bilim Araçları, 11650-10) kullanarak, salinden pompa kaldırın. Insizyonu, açık forseps kullanarak tutun ve hayvan kaudal ucuna bakacak osmotik pompa kapağı ile kesi içine pompayı yerleştirin ve kaudal sonuna pompa itin. </li><li> Pinch 0.8mm forseps kullanarak kapatmaya yara ve Vetbond yeterli miktarda (3M, kedi # 1469SB) yapıştırıcı uygulanır. Yara kapatılır kadar basılı tutun. </li><li> Izofluran maskesi gelen hayvan çıkarın, bilinçli ve mobil kadar kısa süreli bir kurtarma kafesin içine, analjezik ile meloksikam (0.1 mg / kg sc) ve yerine enjekte edin. Daha sonra, gıda ve su ad libitum mevcut olan bir uzun dönemli geri kazanım kafese yerleştirin. </li></ol> 2. α4YFP knock-in fare fiksasyon intrakardiyak perfüzyon ile <ol><li> Prosedürü öncesinde çözümleri bir gün yapın ve tüm fareler değişkenliği en aza indirmek için 4 ° C de bırakınaynı gün ve çözümlerin aynı partiden ile perfüze edilecektir. </li><li> Iyi havalandırılan bir alanda perfüzyon fiksasyon gerçekleştirin. GKD 2 O. ile; peristatic pompası (Masterflex Pompa Kontrolörü, 60.648 Masterflex Kolay Yükleme, 7518-00) ve Flush hattı </li><li> 20 ml PBS pH 7.6 (Invitrogen, kedi # 70011) heparin ~ 0.0015g (Sigma, kedi # H4784), bir antikoagülan, ekleyin. </li><li> Uyuştur α4YFP arka bacak kas içine intramüsküler ketamin bir karışımı (25 mg / kg, Wyeth Hayvan Sağlığı) ve medatomidine hidroklorür (0.25 mg / kg, Pfizer) enjekte edilerek knock-in fare ve hemen eve kafese geri hayvan yerleştirin. </li><li> Metal bir tepsi içine yerleştirilen bir strafor kapak hayvan Pin. % 95 etanol ile toraks silin. Adson forsepsi (Güzel Bilim Araçları, 91106-12) ve kelepir sıkıştırmadan, cilt iris makası ile göğüs boşluğuna açılır. Ultra ince hemostat (Güzel Bilim Araçları, 13021-12) kullanarak göğüs kafesi Kelepçe ve kalp maruz bırakmaktadır. </li><li> 4 ml / dak ve ben de PBS pompalama başlayınhayvanın sol ventrikül içine 23G kelebek iğne (Becton Dickinson, 367.253) nsert. Hemen kan izin ve kaçmak için perfüzat için sağ atrium snip. </li><li> PBS (pH 7.6) perfüze 20 ml,% 4 paraformaldehid (PFA% 16&#39;lık bir stoktan PBS ile seyreltilerek pH 7,6, Elektron Mikroskobu Sciences, kedi # 15710) ve ardından 30 ml% 5, daha sonra 20 ml sakaroz (pH 7,6) . Biz üzerinde tespit otofloresans artırdığı bulundu. % 5 sukroz ile perfüzyon otofloresans düşürür beyin, kalıntı PFA durular. </li><li> 3 gün için% 30 sakkaroz beyin ve mağaza çıkarın. </li><li> Koronal kesit için beyinleri dondurmak için, Ekim Montaj Bileşik (Doku-Tek, kedi # 4583) yılında (VWR, kedi # 18986-1) plastik bir kalıp içinde gömme rostral tarafında yukarı ve batığın bir jilet ve bir yerde beyin ile serebellum kesti . Dilimleme önce -20 ° C&#39;de kuru buz ve mağaza içinde dondurun. </li><li> Bir kriyostat ve daha sonra Bölüm beyinleri (30 mikron kalınlığında) kaplı slaytlar transfer. Ve -20 azından beyin bölümleri depolamakdeg; susuz kalsiyum sülfat taş içeren slayt kutuları C. -20 ° C&#39;de muhafaza edildiğinde slayt kutusu nemi önlemek ve sonraki dondurucu yakmak için bir zip kilit mühürlü torba içinde olmalı </li></ol> 3. Spektral konfokal mikroskopi kullanılarak Görüntüleme floresan nAChRs <ol><li> Slaytlar photobleaching en aza indirmek için herhangi bir ışık kaynağına maruz az olduğundan emin olun. </li><li> Floresan protein flüoresan inhibe etmez bir montaj orta beyin bölümünde slaytlar Coverslip. Biz birkaç saat sonra sertleşir Mowiol 4-88 ile iyi bir başarı (Tris-HCI ve gliserol, pH 8.5, EMD-Calbiochem, kedi # 475904) var. Mowiol hava kabarcıklarını önlemek için kayma kapağı önce oda sıcaklığına equilibrates emin olun. Bu YFP floresans gidermek olacak gibi kaymasını kapak olduğunda tırnak cilası kullanmayın. </li><li> Görüntüler bir Nikon C1si spektral konfokal mikroskop sistemi kullanılarak elde edilir. Spektral konfokal görüntüleme ve doğrusal Karışmama yöntemi hakkında ayrıntılı bilgi vardırd başka bir yerde 13-15. Bir spektral konfokal mikroskop kullanımı için gerekçe sabit beyin dokusu doğasında otofloresans olmasıdır. Nikon C1si Spektral konfokal görüntüleme örnek floresan yayılan ışığın dalgaboyu aralığındaki, sadece renklerin bir gökkuşağı içine beyaz ışık kırıcı bir prizma gibi bir ızgara dağılımlı elemanı vasıtasıyla da farklı dalga boyları içine mekansal kırılan bu 32 photomultiplier tüp dedektörler bir dizi kullanır 16. Bir emisyon spektrumu görüntülerin bir lambda yığının her piksel için toplanır, böylece ışığın farklı dalga boylarında toplanan görüntüleri - Ne toplanan görüntülerin bir lambda yığını olduğunu. YFP ve doku otofloresansı her bir karakteristik spektral imzaların sahip olduğundan, lambda yığın ayrı YFP ve autofluorescent sinyallerini (Şekil 2) içine bir lineer Karışmama cebirsel algoritmasını kullanarak deconvolved edilebilir. Böylece, YFP floresans çok hassas miktarının önemli miktarda Au ile daha da doku belirlenebilirtofluorescence. </li><li> Çeşitli ayarları, görüntü kalitesi ve floresan toplama verimliliği optimize etmek için ayarlanabilir. Biz genellikle kullandığınız ayarları bildirir ancak bu ayarlar örnek ve konfokal mikroskop bağlı olarak ayarlanabilir. Doğru α4YFP alt birimi ifade değişikliklerini ölçmek için kronik nikotin ile hepimiz piksel sinyallerinin gri tonlama seviyesi yoğunluğu (12 bit gri tonlama için &lt;4095) doyurarak değerin altında olduğundan emin olun. Dahası, bu piksel etrafında bir doyurarak değerinin üçte biri (~ 1300-1400) veya daha az olacak şekilde konfokal ayarları yaparak nedeniyle reseptör uyarılması için sinyal potansiyel artış için uygun. Ayarlarını optimize sonra, ayarları tüm görüntüleme oturumları ve örnekler için aynı tutulur. </li><li> 40 mW Argon lazer% 15 maksimal iletim de 488 nm lazer çizgisi: Bir 60X petrol CFI Planı Apo VC nesnel (NA 1.40, 0.13 mm çalışma mesafesi) kullanarak görüntüleme α4YFP için aşağıdaki ayarları kullanın, 220 spektral dedektör kazanç, 5 nm çözünürlükte 496,5 nm 656,5 nm görüntülendi spektral aralığı, 50 um x 50 mikron alana 512 x 512 piksel, orta iğne deliği boyutu (60 mikron çap), bir 4.08 piksel, bekleme süresi iki tarama ve gri ölçek 12 bit üzerinden ortalama. </li></ol> 4. Spektral konfokal görüntü ve görüntü analizi Lineer Karışmama <ol><li> Bir spektral konfokal mikroskop ile çekilen bir örnek görüntü üzerinde lineer spektral Karışmama gerçekleştirmek için, bir ilk YFP için bir referans spektrumu ve doku otofloresans için bir referans spektrumu almanız gerekir. </li><li> Herhangi bir referans spektrumu için önemli bir koşul da örnekleri görüntüleme için kullanılan aynı lazer hattı ile görüntülendi gürültü floresans spektrumu yüksek bir sinyal elde etmektir. Argon 514 nm lazer çizgisinin daha iyi YFP tepe emisyon ayrıştırılması ve 488 nm hat daha az l var çünkü 488 nm lazer hattı ile görüntü YFP tercih YFP heyecanlandırmak için daha yüksek bir uyarım verimliliği olmasına rağmenikely pik deforme etmek ve bir zirveye yükselişi de dahil olmak üzere tüm YFP emisyon spektrumunu elde edebilirsiniz. Biz görüntüsü çözünebilir YFP kuvvetli bir YFP sinyal elde edilir, böylece, bir hücre serisi içinde transfekte edilmiş ve sonuçtaki YFP tayfı referans spektrumları kütüphane saklanır. Aynı zamanda arka spektrumu için yüksek bir sinyal sağlar çünkü hücre çizgileri ile ifade içinde transfekte α4YFP da kullanılabilir. </li><li> Biz α4YFP fare görüntü düşündüğünüz çeşitli beyin bölgelerinden bir wild tip fare beyin bölümünden otofloresans biz görüntü otofloresans bir referans spektrumu elde etmek ve bunlara karşılık gelen spektrumları edinin. Için Biz, lazer yoğunluğu dedektör kazanç değiştirmek veya gürültüye sinyal üst düzeye çıkarmak için ortalama görüntüleme gerçekleştirmek rağmen biz, aynı lazer çizgisi, 488 nm, ve hemen hemen aynı parametreleri kullanarak resim kullanmak. </li><li> Α4YFP fare bir beyin bölgesinden bir spektral konfokal görüntü alındıktan sonra, görüntüyü daha sonra kendi YFP ve autofluor içine deconvolved edilirAynı beyin bölgesi YFP referans spektrumu ve wild tip fare otofloresansı referans tayfı kullanılarak doğrusal bir spektral Karışmama algoritmasının uygulanması ile escence sinyaller. </li><li> Karışmamış α4YFP resim gibi sonra ImageJ (gibi bir görüntü analiz yazılımı açılabilir <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) ve sonra ortalama piksel yoğunluğu ilgi bölge için hesaplanmaktadır. ImageJ için bir eklenti &quot;loci_tools.jar&quot; (denir <a href="http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej" target="_blank">http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej</a> ) Nikon ics / kimlikleri konfokal dosyaları almak için kullanılabilir. </li><li> Biz bir arka plan artık değeri elde etmek için aynı beyin bölgesinde farelerin wild tip için aynı doğrusal spektral Karışmama ve analiz tekrarlayın. </li><li> Sonra bir ortalama düzeltilmemiş α4YFP değeri (4.5) arka plan kalıntı değeri (4.6) çıkarılarak düzeltilmiş ortalama α4YFP yoğunluğu alır. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Biz bir spektral konfokal mikroskop ile çekilen bir homozigot α4YFP fare (Şekil 3A) medial habenula görüntülerinin bir lambda yığını bir temsilcisi gerçek renk projeksiyon göstermektedir. Biz de aynı lambda yığını görüntüsü (Şekil 3B) α4YFP pozitif nöron içeren bir ilgi bölgeden emisyon spektrumunu göstermektedir. Bir farklı emisyon tepe ~ 527 nm dalga boyunda açıktır, hangi YFP pik floresans emisyon olduğunu. Medial habenula komşu bölge α4YFP nAChR alt birimlerinin olmadığını bildiren, 527 nm dalga boyunda spektral pik yoksun bir emisyon spektrumu gösterir. Önemli bir emisyon bindirme (Şekil 4), YFP ayrılması ve autofluorescent sinyali ile YFP referans spektrası ve fare beyin autofluoresence kullanılarak lineer spektral Karışmama takiben verimli bir α4YFP karıştırılmamış resim, bir görüntünün autofluorescent karıştırılmamış ve geriye kalan kanal mümkündür. Α4YFP gribi net lokalizasyonunuorescence medyal habenula (Şekil 4) ve sıkışık soma tespit edilebilir. Hipokampus α4YFP ağırlıklı olarak medial perforant yolu, tempero-ammonic yolu ve Alveus 12 lokalize olur. Bunlar, hipokampus her glutamaterjik innervasyon vardır. Biz hipokampal perforant yolu (Şekil 5) α4YFP ifade kronik nikotin etkisi incelenmiştir. Nikotin Kronik idaresi (10 gün için 2 mg / kg / saat) kronik nikotin tedavi edilen farelerde (p = 0.001, Wilcoxon rank sum testi) kontrol serum fizyolojik tedavi farelerin α4YFP floresans anlamlı bir artış (69 ±% 14) neden ( Şek. 5). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig1.jpg" /> Kronik nikotin ile α4YFP nAChR alt birimden görüntü değişikliklere prosedürü gösteren Şekil 1. Akış çizelgesi. Mini-osmotik pompalar serum fizyolojik ya da nikotin ya da dolu ve &amp; alp içinde deri altına implanteha 4YFP homozigot fareler. 10 gün fareler% 4 formaldehit ve fare beyinleri ile perfüze ve sabitlenir sonra slaytlarda (30 mikron kalınlığında) kesitler vardır. Beyin bölümünde bir spektral konfokal mikroskop (Nikon C1si) üzerindeki yansıması ve Işıksal YFP ve autofluorescent görüntü içine karışmamış edilir. Sonra α4YFP görüntü ImageJ yazılım ile daha da analiz edilir. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3516/3516fig2.jpg" /> Şekil 2. Bir spektral konfokal mikroskop ile yansıma ve doğrusal olarak spektral bileşenleri içine karışmamış bir lambda yığın şematik diyagramı. (A) görüntülerin bir lambda yığını elde edilir. (B) bir lambda yığın bir emisyon spektrumunu tamamını yığın boyunca, her bir piksel için alınır, böylece ışık, farklı dalga boylarına sahip toplanan görüntü oluşur. YFP ve doku otofloresans her karakteristik spektral imzaları olduğundan (C), lambda yığını s içine doğrusal bir Karışmama cebirsel algoritması kullanılarak deconvolved edilebilirkolay kurulum YFP ve autofluorescent sinyalleri. Böylece, YFP floresans çok hassas miktar daha otofloresansı düzeyi yüksek olan doku tespit edilebilir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/3516/3516fig3.jpg" /> Şekil 3. Α4YFP nAChRs ifade eden bir beyin bölgesi spektral konfokal görüntü. Nikon C1si spektral konfokal mikroskop ile çekilen bir α4YFP fareden medial habenula görüntülerinin bir lambda yığını (A) gerçek renk projeksiyon. (B) α4YFP içeren nöronların (yeşil) ve medial habenula (kırmızı) dışında bir ilgi bölgesini kapsayan bir ilgi bölgesinden spektrumlarının Arsalar. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3516/3516fig4.jpg" /> Şekil 4. Medial habenula Lineer spektral Karışmama. Karışmamış α4YFP (A) Görüntüler ve (B) otofloresans izleyerek lineer spektral Karışmama. YFP (C) Referans spektrumları (yeşil triaçıları) ve otofloresans (sarı daireler) spektral Karışmama için kullanılır. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3516/3516fig5.jpg" /> Şekil 5. Ve hipokampus α4 nAChRs arasında ekspresyonunun α4YFP knock-kronik nikotine maruz kalan farelerin. (A), hipokampusdan α4YFP floresans döşenmiş bir montaj. İki kesik seçimi alanlarda analizler her fare için yapıldı hipokampusun perforant yolun alt bacak ilgili yaklaşık yerlerdir. (B) α4YFP floresans kronik tuzlu (*, p = 0.001, Wilcoxon rank sum testi) göre kronik nikotine maruz kalan farelerin perforant yolunu anlamlı derecede yüksek bulunmuştur. Sonuçlar temsil ortalama ± SEM n serum fizyolojik hem de kronik nikotin tedavi edilen farelerde (her bir tedavi grubunda 5 fare) için = 20 ölçüm. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig6.jpg" /> Şekil 6. Daha iyi dα4YFP bir epth ifadesi olarak antikor etiketleme göre. Ikincil bir etiket (B) olarak Cy5 ile α4YFP floresans (A) ve VGlut2 antikor XZ ortogonal görünümler. (C) α4YFP (açık daireler) kıyasla antikor boyama (siyah kareler) için derinliği üzerinde daha fazla floresan sinyal yoğunluğu düşüşü gösteren Arsalar.

<ol>
	<li>Perry, D. C., Davila-Garcia, M. I., Stockmeier, C. A., Kellar, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+nicotinic+receptors+in+brains+from+smokers:+membrane+binding+and+autoradiography+studies.">Increased nicotinic receptors in brains from smokers: membrane binding and autoradiography studies.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1545-1552 (1999).</li><li>Schwartz, R. D., Kellar, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+cholinergic+receptor+binding+sites+in+the+brain:+regulation+in+vivo.">Nicotinic cholinergic receptor binding sites in the brain: regulation in vivo.</a> Science. 220, 214-216 (1983).</li><li>Marks, M. J., Burch, J. B., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chronic+nicotine+infusion+on+tolerance+development+and+nicotinic+receptors.">Effects of chronic nicotine infusion on tolerance development and nicotinic receptors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 226, 817-8125 (1983).</li><li>Carlezon, W. A. J., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+GluR1+in+the+midbrain:+a+trigger+for+sensitization+to+drugs+of+abuse.">Elevated levels of GluR1 in the midbrain: a trigger for sensitization to drugs of abuse.</a> Trends Neurosci. 25, 610-615 (2002).</li><li>Fitzgerald, L. W., Ortiz, J., Hamedani, A. G., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+of+abuse+and+stress+increase+the+expression+of+GluR1+and+NMDAR1+glutamate+receptor+subunits+in+the+rat+ventral+tegmental+area:+common+adaptations+among+cross-sensitizing+agents.">Drugs of abuse and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-sensitizing agents.</a> J. Neurosci. 16, 274-2782 (1996).</li><li>Saal, D., Dong, Y., Bonci, A., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+of+abuse+and+stress+trigger+a+common+synaptic+adaptation+in+dopamine+neurons.">Drugs of abuse and stress trigger a common synaptic adaptation in dopamine neurons.</a> Neuron. 37, 577-5782 (2003).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Nashmi, R., Dickinson, M. E., McKinney, S., Jareb, M., Labarca, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+&#945;4&#946;2+nicotinic+acetylcholine+receptors+assessed+with+functional+fluorescently+labeled+subunits:+effects+of+localization,+trafficking,+and+nicotine-induced+upregulation+in+clonal+mammalian+cells+and+in+cultured+midbrain+neurons.">Assembly of &#945;4&#946;2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons.</a> J. Neurosci. 23, 11554-11567 (2003).</li><li>Nashmi, R., Xiao, C., Deshpande, P., McKinney, S., Grady, S. R., Whiteaker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+cell+specifically+upregulates+functional+Î±4*+nicotinic+receptors:+basis+for+both+tolerance+in+midbrain+and+enhanced+long-term+potentiation+in+perforant+path.">Chronic nicotine cell specifically upregulates functional Î±4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path.</a> J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).</li><li>Dickinson, M. E., Bearman, G., Tilie, S., Lansford, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-spectral+imaging+and+linear+unmixing+add+a+whole+new+dimension+to+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy.</a> BioTechniques. 31, 1272-1278 (2001).</li><li>Nashmi, R., Fraser, S. E., Lester, H., Dickinson, M. E., Periasamy, A., Day, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular imaging: fret microscopy and spectroscopy. , 180-192 (2005).</li><li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair.">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).</li><li>Larson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nikon+C1si+combines+high+spectral+resolution,+high+sensitivity,+and+high+acquisition+speed.">The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed.</a> Cytometry A. 69, 825-8234 (2006).</li><li>Melvin, N. R., Sutherland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+caveats+of+standard+immunohistochemical+procedures:+implications+for+optical+disector-based+designs.">Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 577-5784 (2010).</li><li>Jones, I. W., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+doesn't+nicotinic+ACh+receptor+immunoreactivity+knock+out.">Why doesn't nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out.</a> Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).</li><li>Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+suitability+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+standard+immunodetection+procedures.">Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures.</a> J. Neurochem. , (2007).</li><li>Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+demonstrates+the+interdependence+of+mouse+brain+a4+and+b2+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+expression.">Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression.</a> The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).</li><li>Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+underlies+chronic+nicotine-induced+up-regulation+of+nicotinic+agonist+binding+sites+in+mouse+brain.">Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).</li><li>Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets+of+acetylcholine-stimulated+86[Rb]++efflux+and+125[I]-epibatidine+binding+sites+in+C57BL/6+mouse+brain+are+differentially+affected+by+chronic+nicotine+treatment.">Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment.</a> Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).</li><li>King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta2-subunit-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+are+critical+for+dopamine-dependent+locomotor+activation+following+repeated+nicotine+administration.">Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration.</a> Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).</li><li>Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inbred+mouse+strains+vary+in+oral+self-selection+of+nicotine.">Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine.</a> Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).</li><li>Sparks, J. A., Pauly, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+continuous+oral+nicotine+administration+on+brain+nicotinic+receptors+and+responsiveness+to+nicotine+in+C57Bl/6+mice.">Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice.</a> Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).</li><li>Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroadaptive+changes+in+the+mesoaccumbens+dopamine+system+after+chronic+nicotine+self-administration:+a+microdialysis+study.">Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study.</a> Neuroscience. 129, 415-4124 (2004).</li><li>Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+receptors+containing+the+Î²2+subunit+are+involved+in+the+reinforcing+properties+of+nicotine.">Acetylcholine receptors containing the Î²2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine.</a> Nature. 391, 173-177 (1998).</li><li>Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habenular+&#945;5+nicotinic+receptor+subunit+signalling+controls+nicotine+intake.">Habenular &#945;5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake.</a> Nature. 471, 597-601 (2011).</li><li>Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reinforcement+and+cognition+restored+by+targeted+expression+of+nicotinic+receptors.">Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors.</a> Nature. 436, 103-107 (2005).</li><li>Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+on+nicotine+dose+selection+for+in+vivo+research.">Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research.</a> Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).</li><li>Lang, T., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+clusters+at+nanoscale+resolution:+more+than+pretty+pictures.">Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures.</a> Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).</li></ol>

Biz ifşa şey var.

<p class="jove_content"&gt; Miktar ve belirli bir iyon kanalı lokalizasyonunu belirlemek için bir itici içinde fare modelinde, bir flüoresan reseptörünün kullanımı bir dizi avantaj sağlar. Gibi her yerde görülen Tüm hücreler olarak ifade edilir aktin, proteinler gibi tersine, iyon kanalları çok daha az sayıda bulunan ve bunların ifade zorlayıcı geleneksel teknikler vasıtasıyla immunohistokimyasal doğru analiz hale nöronal alt türleri arasında değişir. Α4YFP gen ürünü aynı rehberleri, arttırıcılar ve kaçakç?...

<table border="1"><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> mini-osmotik pompalar </td><td> Alzet </td><td> model yılı 2002 </td><td></td></tr><tr><td> tuzlu </td><td> Teknova </td><td> S5819 </td><td></td></tr><tr><td> (-)-Nikotin hidrojen tartrat tuzu </td><td> Sigma </td><td> N5260 </td><td></td></tr><tr><td> göz damlası </td><td> Novartis </td><td> Tear-Jel </td><td></td></tr><tr><td> Vetbond tutkal </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> Heparin sodyum tuzu </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 70011 </td><td></td></tr><tr><td> ketamin </td><td> Wyeth Hayvan Sağlığı </td><td> 0856-4403-01 </td><td></td></tr><tr><td> medatomidine hidroklorür </td><td> Pfizer </td><td> 1950673 </td><td></td></tr><tr><td> 23G kelebek iğne </td><td> Becton Dickinson </td><td> 367253 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehid </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> plastik gömme kalıp </td><td> VWR </td><td> 18986-1 </td><td></td></tr><tr><td> Ekim Montaj Bileşik </td><td> Doku-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> EMD-Calbiochem </td><td> 475904 </td><td> pH 8.5 </td></tr></table>

spectral confocal imaging of fluorescently tagged nicotinic receptors in knock-in mice with chronic nicotine administration

Merkezi sinir sistemi (MSS) ligand kapılı iyon kanalları ciddi tıbbi ve sosyal sonuçları ile sayısız koşullarda sorumlu tutulmaktadır. Örneğin, sigara ile nikotin bağımlılığı erken ölümü tüm dünyada (Dünya Sağlık Örgütü) önde gelen nedenidir ve büyük olasılıkla beyinde 1 iyon kanal dağıtım bir değişikliğe neden olur. 1-3 beyin dokusunda nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChRs) sayısı artırılmış hem de kemirgenler ve insanlarda sonuçlar kronik nikotin maruziyeti. Benzer şekilde, glutamaterjik GluN1 veya GluA1 kanalları değişiklikler gibi kokain, amfetamin ve opiatların 4-6 gibi diğer bağımlılık yapan ilaçlara duyarlılığın tetiklenmesi suçlanmıştır. Sonuç olarak, spesifik iyon kanalları dağıtım ve ifade kalıpları eşleştirmek ve sayısal yeteneği bağımlılık mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Beyin bölgeye özgü ef çalışmabireysel ilaçların fects bu radyoaktif ligand olarak tekniklerinin ortaya çıkmasıyla tarafından geliştirilmiştir. Bununla birlikte, radyoaktif ligandı bağlama düşük uzaysal çözünürlüğü nöronların belirli alt türleri olarak ligand kapılı iyon kanalları ölçmek yeteneği önler. Böyle yeşil floresan protein (GFP) ve birçok renk çeşidi olarak genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere, biyoloji 7 alanında devrim yarattı. Genetik etiketleyerek bir in vivo 7-10 proteinlerin görselleştirebilirsiniz endojen bir protein için bir floresan muhabiri. Bir prob ile floresan etiketleme proteinlerin bir avantajı nonspecificity ve hedef proteine ​​erişilebilirlik sorunları var antikor kullanımının ortadan kaldırılması vardır. Biz transfekte Kültür hücrelerinde 11 Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) kullanarak reseptör montaj çalışması etkin floresan etiketi nAChRs, bu stratejiyi kullanmışlardır. Daha yakın zamanlarda, biz Knoc kullandıkk-spektral konfokal mikroskopi 12 üzerinden MSS nöronlarda submicrometer çözünürlükte reseptör ex vivo hassas ölçümü sağlayan α4 nAChR alt birimden (α4YFP) tagged sarı floresan protein ile mühendis farelere yaklaşımı. Hedeflenen flüoresan zincirleme mutasyon wild tip farelerde etiketsiz reseptörlerine göre ifade ve reseptör düzenlenmesi normal seviyede üreten, endojen odağı ve onun doğal arttırıcının kontrolü altında dahil edilir. Bu çarpık yaklaşım floresan diğer iyon kanalları etiketlemek için genişletilmiş ve MSS reseptörleri görselleştirilmesi ve nicel güçlü bir yaklaşım sunuyor olabilir. Bu yazıda kronik nikotin maruz kaldıktan sonra özel MSS nöronlarda nAChR ifade değişikliklerini ölçmek için bir metodoloji açıklanmaktadır. Bizim yöntemleri mini ozmotik pompa implantasyonu, intrakardiyak perfüzyon fiksasyon, görüntüleme ve floresan etiketli nikotinik rec analizini içerirden eptor altbirimleri α4YFP knock-in fare (Şekil 1). Biz detaylı doğru α4YFP floresan sinyal elde etmek için autofluoresent sinyali çıkarmak için doğrusal bir spektral Karışmama algoritması ile birlikte bir spektral konfokal mikroskop kullanarak bizim görüntüleme yöntemi tarif sabit beyin tissue.We gelen otofloresans en aza indirmek için fiksasyon tekniği optimize etmiş. Son olarak, hipokampüsün medyal perforant yolu α4YFP reseptörlerinin Kronik nikotin ile endüklenen uyarılması sonuçlarını göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration at JoVE.com

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Biz daha iyi bir yaklaşım knock-in ve spektral kullanarak reseptör floresan protein etiketleme dahil yaklaşımların bir arada kullanılarak nikotin bağımlılığı mekanizmalarını anlamak için MSS nöron spesifik alt tiplerinin Subselüler bölgeler içinde nikotinik asetilkolin reseptör değişiklikleri nicel yeni bir teknik geliştirdik konfokal görüntüleme.

Kronik Nikotin İdaresi fareler Knock-in içinde floresan etiketli Nikotinik Reseptör Spektral Konfokal Görüntüleme

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

spectral-confocal-imaging-fluorescently-tagged-nicotinic-receptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K Görüntüleme.  University of Victoria. Biz daha iyi bir yaklaşım knock-in ve spektral kullanarak reseptör floresan protein etiketleme dahil yaklaşımların bir arada kullanılarak nikotin bağımlılığı mekanizmalarını anlamak için MSS nöron spesifik alt tiplerinin Subselüler bölgeler içinde nikotinik asetilkolin reseptör değişiklikleri nicel yeni bir teknik geliştirdik konfokal görüntüleme.

Video: Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo pharmacological studies of the signals essential for the formation and maintenance of mammalian NMJs. However, drug penetration into these muscles after subcutaneous or intramuscular administration is often incomplete or uneven and many NMJs can remain unaffected. Although systemic administration with devices such as mini-pumps can improve the spatiotemporal effects, the invasive nature of this approach can cause confounding inflammatory responses and/or direct muscle damage. Moreover, complete analysis of the NMJs in a hind limb muscle is challenging because it requires time-consuming serial sectioning and extensive immunostaining. 
The mouse LAL is a thin, flat sheet of muscle located superficially on the dorsum of the neck. It is a fast-twitch muscle that functions to move the pinna. It contains rostral and caudal portions that originate from the midline of the cranium and extend laterally to the cartilaginous portion of each pinna. The muscle is supplied by a branch of the facial nerve that projects caudally as it exits the stylomastoid foramen. We and others have found LAL to be a convenient preparation that offers advantages for the investigation of both short and long-term in vivo effects of drugs on NMJs and muscles. First, its superficial location facilitates multiple local applications of drugs under light anesthesia. Second, its thinness (2-3 layers of muscle fibers) permits visualization and analysis of almost all the NMJs within the muscle. Third, the ease of dissecting it with its nerve intact together with the pattern of its innervation permits supplementary electrophysiological analysis in vitro9,5. Last, and perhaps most importantly, a small applied volume (&tilde;50&mu;l) easily covers the entire muscle surface, provides a uniform and prolonged exposure of all its NMJs to the drug and eliminates the need for a systemic approach1,8.

We describe procedures for repeated administration of inhibitors of muscarinic signaling to the levator auris longus (LAL) muscle of young adult mice and for subsequent immunostaining of its neuromuscular junctions (NMJs) in wholemounts. The LAL muscle has unique advantages for revealing in vivo pharmacological effects on NMJs.

Subkutan Muskarinik Antagonistleri Yönetim ve Farelerde levator Auris longus&#39;un Triple-immün

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo  pharmacological studies of the signals ...

Nörobilim

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyali ve ventral Hipokampal Aksonlar boyunca Nörotransmitter Release Canlı Görüntüleme

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Quantifying Infra-slow Dynamics of Spectral Power and Heart Rate in Sleeping Mice

Three vigilance states dominate mammalian life: wakefulness, non-rapid eye movement (non-REM) sleep, and REM sleep. As more neural correlates of behavior are identified in freely moving animals, this three-fold subdivision becomes too simplistic. During wakefulness, ensembles of global and local cortical activities, together with peripheral parameters such as pupillary diameter and sympathovagal balance, define various degrees of arousal. It remains unclear the extent to which sleep also forms a continuum of brain states-within which the degree of resilience to sensory stimuli and arousability, and perhaps other sleep functions, vary gradually-and how peripheral physiological states co-vary. Research advancing the methods to monitor multiple parameters during sleep, as well as attributing to constellations of these functional attributes, is central to refining our understanding of sleep as a multifunctional process during which many beneficial effects must be executed. Identifying novel parameters characterizing sleep states will open opportunities for novel diagnostic avenues in sleep disorders.
We present a procedure to describe dynamic variations of mouse non-REM sleep states via the combined monitoring and analysis of electroencephalogram (EEG)/electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG), and electrocardiogram (ECG) signals using standard polysomnographic recording techniques. Using this approach, we found that mouse non-REM sleep is organized into cycles of coordinated neural and cardiac oscillations that generate successive 25-s intervals of high and low fragility to external stimuli. Therefore, central and autonomic nervous systems are coordinated to form behaviorally distinct sleep states during consolidated non-REM sleep. We present surgical manipulations for polysomnographic (i.e., EEG/EMG combined with ECG) monitoring to track these cycles in the freely sleeping mouse, the analysis to quantify their dynamics, and the acoustic stimulation protocols to assess their role in the likelihood of waking up. Our approach has already been extended to human sleep and promises to unravel common organizing principles of non-REM sleep states in mammals.

Here, we present experimental and analytical procedures to describe the temporal dynamics of the neural and cardiac variables of non-REM sleep in mice, which modulate sleep responsiveness to acoustic stimuli.

Uyku Faresinde Spektral Gücün ve İnsanın Yavaş yavaş Dinamiklerinin Nicelleştirilmesi

Three vigilance states dominate mammalian life: wakefulness, non-rapid eye movement (non-REM) sleep, and REM sleep. As more neural correlates of behavior ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Kronik daralma Yaralanmalı farelerde otomatik yürüyüş analizi

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.

Myelinated akson in Situ üzerinde spektral Reflectometric mikroskobu

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with subcellular location within cells where this function is carried out. To study the subcellular location of nicotinic ACh receptors (nAChRs) in native brain tissue, an optical method was developed for precise release of nicotine at discrete locations near neuronal membranes during electrophysiological recordings. Patch-clamped neurons in brain slices are filled with dye to visualize their morphology during 2-photon laser scanning microscopy, and nicotine uncaging is executed with a light flash by focusing a 405 nm laser beam near one or more cellular membranes. Cellular current deflections are measured, and a high-resolution three-dimensional (3D) image of the recorded neuron is made to allow reconciliation of nAChR responses with cellular morphology. This method allows for detailed analysis of nAChR functional distribution in complex tissue preparations, promising to enhance the understanding of cholinergic neurotransmission.

This article presents a method for studying nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in mouse brain slices by nicotine uncaging. When coupled with simultaneous patch clamp recording and 2-photon laser scanning microscopy, nicotine uncaging connects nicotinic receptor function with cellular morphology, providing a deeper understanding of cholinergic neurobiology.

Fare beyin dilim Photoactivatable nikotin lazer Flash Photolysis üzerinden nikotinik asetilkolin reseptör işlevinde sondalama

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...