Anthony Renda foi apoiado por uma Universidade de Victoria Prêmio Bolsa de Pós-Graduação. Esta pesquisa foi suportada por uma Ciências Naturais e Engenharia Council of Canada Discovery Grant, um investigador NARSAD Prêmio Jovem (para RN), a Fundação Victoria - Myre e Winifred Sim Fund, a Fundação Canadense para Inovação de subvenção, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento e Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa de Ferramentas de Pesquisa do Canadá e Grant Instrumentação. Agradecemos Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald e Daniel Morgado para criação excelente mouse.

1. Implantação da bomba <ol><li> Antes da implantação da bomba, preencher e preparar os Alzet mini-bombas osmóticas (Alzet, Modelo 2002, Cupertino, EUA), tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar. Este modelo de mini-osmótica bomba fornece solução a uma taxa de 0,5 ul / h durante 14 dias. Garantir condições estéreis. Pesar bombas vazias e cheias. Na conclusão da experiência (10 dias após o implante), o líquido remanescente na bomba pode ser removido com uma seringa e agulha e pesados ​​para calcular o volume bombeado. </li><li> Bombas com a solução de controlo contêm salina (0,9% w / v, Teknova, S5819, Hollister, EUA). Para preparar as soluções de nicotina, uma solução de reserva 1 M de (-)-nicotina sal tartarato de hidrogénio (Sigma, Cat # N5260) é diluído em solução salina (0,9% w / v) e esterilizado por filtração através de um filtro de seringa de 0,22 iM-end. Nós previamente administrada nicotina a 0,4 e 2 mg / kg / hr (calculado como base livre de nicotina), durante 10 dias. </li><li> Prepare três banhos salinos (três10 centímetros salina cheio placas de Petri). Uma vez que a bomba foi preenchido e limitado, lavar bombear exaustivamente em cada banho sucessiva de solução salina para remover quaisquer vestígios de droga no invólucro exterior. Imergir preenchido bombas em solução salina para armazenamento até a cirurgia, mantendo o controlo e as bombas de nicotina em recipientes separados salinos. </li><li> Para estimular uma recuperação saudável e reduzir o risco de infecção pós-cirúrgica, têm gaiolas limpas preparados para a longo prazo de recuperação. </li><li> Para a curto prazo de recuperação imediatamente após a cirurgia, preparar uma gaiola contendo uma almofada de aquecimento e uma lâmpada de aquecimento. </li><li> Para examinar os efeitos da nicotina crónicas temos 5-6 α4YFP homozigótica knock-em ratinhos (2-3 meses de idade) em cada grupo (controlo ou de nicotina). O knock-in α4YFP linhagem de camundongos foram retrocruzadas por 10 gerações para a estirpe de ratinhos C57BL/6J. Tornamos se a idade eo sexo do todos os ratinhos são os mesmos para o estudo e que todas as cirurgias são realizadas no mesmo dia para minimizar a variabilidade. Para evitar que hyhipotermia aos ratos durante e após a cirurgia, equipar mesa cirúrgica com uma almofada de aquecimento coberta de panos cirúrgicos estéreis. </li><li> Induzir o rato knock-in α4YFP com 3 L / min de oxigénio e 3% de isoflurano e, em seguida, manter a anestesia em 2,5 L / min de oxigénio e 1% de isoflurano. Nós preferimos a anestesia isoflurano, porque no final da cirurgia isoflurano limpa o sistema rapidamente e os ratos são conscientes e móvel dentro de ~ 2 min. Aplicar colírio imediatamente (rasgo Gel, Novartis) para evitar lesões na córnea. </li><li> As bombas são implantados subcutaneamente por meio de uma incisão na pele na parte de trás do pescoço e da bomba é empurrado para baixo caudal do aspecto dorsal das costas. Limpe a área na parte de trás entre as patas dianteiras com etanol 95% para a pele fosca. Aperte a pele com uma pinça 0.8mm Graefe (Ferramentas Ciência Belas, 11050-10) e fazer um corte de 1 centímetro central lateral com uma tesoura de íris (Ferramentas Ciência Belas, 14060-10). </li><li> Para criar um espaço subcutâneo para a bomba, inserir tesoura padrão padrãos (Ferramentas Ciência finas, 14101-14) na incisão e empurrá-los cuidadosamente para a extremidade caudal do animal. </li><li> Usando uma pinça 1,0 mm Graefe (Ferramentas Ciência Belas, 11.650-10), remover a bomba de solução salina. Segurar os incisão aberta fórceps e inserir usando a bomba na incisão, com a tampa da bomba osmótica de frente para a extremidade caudal do animal e empurre a bomba na extremidade caudal. </li><li> Pitada ferida fechou com pinça 0,8 mm e aplicar uma quantidade adequada de Vetbond (3M, cat # 1469SB) cola. Segure até ferida está selado. </li><li> Remover o animal de máscara isoflurano, injectar com o analgésico, o meloxicam (0,1 mg / kg sc), e em lugar de uma gaiola de recuperação de curto prazo até consciente e móvel. Em seguida, coloque em uma gaiola de recuperação a longo prazo com comida e água disponível ad libitum. </li></ol> 2. α4YFP bater-na fixação do rato por perfusão intracardíaca <ol><li> Fazer soluções um dia antes do procedimento e deixar a 4 ° C. Para minimizar a variabilidade todos os ratinhosserá perfundidos no mesmo dia e com o mesmo lote de soluções. </li><li> Execute fixações de perfusão em uma área bem ventilada. Linha de onda de bomba peristatic (Masterflex fácil de carga, 7518-00; bomba Masterflex Controller, 60648), com DDH 2 O. </li><li> Adicionar ~ 0.0015g de heparina (Sigma, Cat # H4784), um anticoagulante, para 20 ml de PBS de pH 7,6 (Invitrogen, cat # 70011). </li><li> Anestesiar α4YFP knock-em rato por injecção intramuscular de uma mistura de cetamina (25 mg / kg, Saúde Animal Wyeth) e cloridrato de medatomidine (0,25 mg / kg, Pfizer) no músculo da perna posterior direita e colocar imediatamente o animal de volta para a sua gaiola de origem. </li><li> Pino animal para uma tampa de isopor inserido um tabuleiro de metal. Wipe tórax com etanol a 95%. Pitada pele com uma pinça Adson (Ferramentas Ciência Belas, 91106-12) e recorte abrir a cavidade torácica, com tesoura de íris. Grampo da caixa torácica com uma pinça hemostática ultra fino (Ferramentas Ciência Belas, 13021-12) e expor o coração. </li><li> Começar a bombear PBS a 4 ml / min e iINSERI uma agulha de borboleta 23G (Becton Dickinson, 367,253) para o ventrículo esquerdo do animal. Imediatamente cortar o átrio direito para permitir que o sangue e perfusato para escapar. </li><li> Perfundir 20 ml de PBS (pH 7,6), em seguida, 30 ml de paraformaldeído a 4% (pH 7,6, diluído com PBS a partir de um 16% PFA banco de Ciências Microscopia de electrões, cat # 15710), em seguida, 20 ml de sacarose a 5% (pH 7,6) . Descobrimos que aumenta a fixação sobre autofluorescência. Perfusão com sacarose a 5% lavagens PFA residual a partir do cérebro, o que reduz autofluorescência. </li><li> Remover cérebro e armazenar em sacarose a 30% durante 3 dias. </li><li> Para congelar o cérebro para corte coronal, cortar o cerebelo, com uma lâmina de barbear eo cérebro realizada em um molde de encaixe de plástico (VWR, cat # 18986-1) rostral lateral-se e mergulhe em outubro Composto de montagem (Tissue-Tek, cat # 4583) . Congelar em gelo seco e armazenar a -20 ° C antes de cortar. </li><li> Cérebros seção (30 mm de espessura) em um criostato e depois transferir para lâminas revestidas. Guarde as seções do cérebro a -20 &amp;°; C em caixas de lâmina contendo uma pedra de sulfato de cálcio anidro. A caixa de lâminas deve estar em um saco zip lock selado para evitar a umidade e freezer subseqüente queimar quando armazenadas a -20 ° C. </li></ol> 3. NAChRs imagem fluorescentes usando microscopia confocal espectral <ol><li> Certifique-se de slides tem uma exposição mínima a qualquer fonte de luz para minimizar a fotodegradação. </li><li> Lamela as lâminas secção cerebrais com um meio de montagem que não inibe a fluorescência da proteína fluorescente. Nós temos um bom sucesso com Mowiol 4-88 (pH 8,5 em tampão Tris-HCl e glicerol, EMD-Calbiochem, cat # 475,904), que endurece após algumas horas. Assegure-se o Mowiol equilibra a temperatura ambiente antes de tampa deslizar de forma a evitar bolhas de ar. Não usar unhas polonês quando a tampa deslizar como ele vai saciar a fluorescência YFP. </li><li> As imagens são adquiridas usando uma Nikon C1si sistema de microscópio confocal espectral. Detalhes sobre o método de imagem confocal espectral e desmistura linear são fornecerd em outro lugar 13-15. A lógica para a utilização de um microscópio confocal espectral é que o tecido cerebral fixa tem autofluorescência inerente. Imagiologia confocal espectral na C1si Nikon usa uma matriz de 32 detectores de tubos fotomultiplicadores que a amostra de uma determinada gama de comprimentos de onda da luz emitida fluorescente, refratada espacialmente em seus diferentes comprimentos de onda através de um elemento dispersivo ralar como um prisma refratando a luz branca em um arco-íris de cores 16. O que é recolhida é uma pilha de lambda de imagens - imagens recolhidas em diferentes comprimentos de onda da luz de modo a que um espectro de emissão são recolhidos para cada pixel de uma pilha de lambda de imagens. Uma vez que YFP e autofluorescência tecido têm cada característicos espectrais assinaturas, a pilha de lambda pode ser deconvolved usando um algoritmo de desmistura linear algébrica em YFP separada e sinais autofluorescente (Fig. 2). Assim, a quantificação precisa de muito YFP fluorescência pode ser determinado, mesmo em tecido com níveis significativos de autofluorescence. </li><li> Várias configurações podem ser ajustadas para otimizar a qualidade de imagem e eficiência de coleta de fluorescência. Vamos relatar as configurações que normalmente usam, mas essas configurações podem ser ajustadas, dependendo da amostra e do microscópio confocal. Para quantificar com precisão as alterações na expressão da subunidade α4YFP com nicotina crônica garantir que o nível de intensidade em escala de cinza dos sinais de todos os pixels estão abaixo do valor de saturação (&lt;4095 para 12 em escala de cinza bit). Além disso, acomodar o potencial aumento de sinal devido a regulação positiva do receptor, ajustando as configurações confocal de modo que os pixels são cerca de um terço do valor de saturação (~ 1300-1400) ou menos. Uma vez que as configurações são otimizados, as configurações são mantidos de forma idêntica para todas as sessões de imagens e amostras. </li><li> Usamos as seguintes configurações para imagens α4YFP usando um óleo de 60X Plano TPI Apo VC objetivo (1,40 NA, 0,13 mm de distância de trabalho): 488 nm do laser de linha em 15% transmissão máxima de um 40 mW laser de argônio, O ganho de detector espectral a 220, a partir de faixa espectral imaged 496,5 nm a 656,5 nm a 5 resolução nm, 512 x 512 pixels mais de uma área de 50 um x 50 um, um tamanho médio furo (60 diam mm), um pixel 4,08 tempo de permanência, uma média de dois exames e 12 bits de escala de cinza. </li></ol> 4. Desmistura linear de imagens espectrais confocal e análise de imagem <ol><li> Para executar desmistura espectral linear sobre uma imagem de amostra tirada com um microscópio confocal espectral, deve-se primeiro adquirir um espectro de referência para YFP e um espectro de referência para autofluorescência tecido. </li><li> Um requisito importante para qualquer espectro de referência é a obtenção de um sinal de alta para espectro de ruído de fluorescência fotografada com a linha de laser mesmo utilizado para geração de imagens das suas amostras. Embora a linha de laser 514 nm de árgon tem uma maior eficiência de excitação para excitar YFP nós preferimos YFP imagem com a linha de laser 488 nm, porque há uma melhor separação da emissão de pico de YFP ea linha 488 nm é menos likely para distorcer a pico e pode-se obter o espectro de emissão inteiro YFP incluindo o aumento de pico. Nós YFP imagem solúvel transfectados em uma linha de células de modo a que um sinal forte YFP é obtido e do espectro YFP resultante é armazenado na nossa biblioteca de espectros de referência. Α4YFP transfectadas sobre expressa em linhas de células podem também ser utilizados desde que também irá proporcionar um sinal de alta ao espectro de fundo. </li><li> Para obter um espectro de referência do autofluorescência autofluorescência imagem que a partir de uma seção do tipo selvagem de cérebro de camundongos a partir das várias regiões do cérebro que pretendemos para a imagem do mouse α4YFP e obter seus espectros correspondentes. Usamos a linha de laser mesmo, 488 nm, e de imagem utilizando parâmetros de quase idênticas, embora se possa alterar o ganho do detector, a intensidade do laser ou realizar imagem média para maximizar sinal para ruído. </li><li> Após a obtenção de uma imagem confocal espectral a partir de uma região do cérebro do rato α4YFP, a imagem é, então, na sua deconvolved YFP e autofluorsinais escence mediante a aplicação de um algoritmo de desmistura linear espectral usando o espectro de referência do YFP eo espectro de referência do tipo selvagem autofluorescência rato a partir de a mesma região do cérebro. </li><li> A imagem α4YFP puro pode então ser aberto em um software de análise de imagem, tal como ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) e, em seguida, a intensidade de pixel média é calculada para a região de interesse. Um plugin para o ImageJ chamado &quot;loci_tools.jar&quot; ( <a href="http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej" target="_blank">http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej</a> ) pode ser usado para importar Nikon ics / ids arquivos confocal. </li><li> Vamos repetir o mesmo desmistura linear espectral e análise à estirpe selvagem ratos na mesma região do cérebro para obter um valor de fundo residual. </li><li> Em seguida, obtém-se a intensidade média corrigida α4YFP subtraindo o valor de fundo residual (4,6) a partir do valor médio α4YFP não corrigido (4,5). </li></ol> 5. Os resultados representativos Nós mostramos uma projecção de cor verdadeiro representante de uma pilha de lambda de imagens do habenula medial a partir de um rato α4YFP homozigótica (Fig. 3A) tomado com um microscópio confocal espectral. Nós também mostram o espectro de emissão a partir de uma região de interesse contendo α4YFP neurónios positivos a partir da mesma imagem pilha lambda (Fig. 3B). Um pico de emissão distinta é evidente a ~ 527 nm, que é a emissão de pico de fluorescência de YFP. A região limítrofe da habenula medial mostra um espectro de emissão falta um pico espectral em 527 nm, indicando a ausência de subunidades α4YFP nAChR. Após desmistura espectral linear usando os espectros de referência de YFP e autofluoresence cérebro do rato com a sobreposição de emissão (Fig. 4), a separação de YFP e sinal autofluorescente é possível imagem um rendimento α4YFP não misturados, uma imagem autofluorescente puro e um canal restante. Localização clara de gripe α4YFPorescence podem ser identificados no soma embaladas apertadamente do habenula medial (Fig. 4). No hipocampo α4YFP está localizada principalmente no caminho perfurante medial, o caminho Tempero-amônio eo alveus 12. Estes são todos inervação glutamatérgica do hipocampo. Foram examinados os efeitos da nicotina crónica na expressão α4YFP no caminho perfurante do hipocampo (Fig. 5). A administração crónica de nicotina (2 mg / kg / h durante 10 dias), resultou num aumento significativo (69 ± 14%) em α4YFP fluorescência a partir de ratinhos de controlo tratados com solução salina crónicas de nicotina ratinhos tratados (p = 0,001, teste de Wilcoxon Rank Sum) ( Fig. 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig1.jpg" /> Figura Fluxograma 1. Mostrando procedimento para alterações de imagem em subunidades nAChR α4YFP com nicotina crônica. Mini-bombas osmóticas são preenchidos com solução salina ou nicotina e implantado por via subcutânea em e ALPha; 4YFP camundongos homozigotos. Após 10 dias os ratos são perfundidos e fixados com paraformaldeído a 4% e os cérebros de rato são seccionados (30 mm de espessura) em lâminas. A seção do cérebro é fotografada em um microscópio confocal espectral (Nikon C1si) e sem mistura espectral em imagens YFP e autofluorescente. Em seguida, as imagens são analisadas mais α4YFP com o software ImageJ. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig2.jpg" /> Figura 2. Um diagrama esquemático de uma pilha de lambda visualizado usando um microscópio confocal espectral e linearmente não misturados em seus componentes espectrais. (A) Uma pilha lambda de imagens é coletada. (B) Uma pilha lambda consiste de imagens recolhidas em diferentes comprimentos de onda da luz de modo a que um espectro de emissão é recolhido para cada pixel do outro lado da pilha inteira. (C) Uma vez que YFP e autofluorescência tecido têm cada característicos espectrais assinaturas, a pilha de lambda pode ser deconvolved usando um algoritmo de desmistura linear algébrica em sYFP eparate e os sinais de autofluorescente. Assim, a quantificação precisa de muito YFP fluorescência pode ser determinado, mesmo em tecido com elevados níveis de autofluorescência. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig3.jpg" /> Figura 3. Imagem confocal espectral de uma região do cérebro expressar nAChRs α4YFP. (A) Uma projecção de cor verdadeira de uma pilha de lambda de imagens do habenula medial de um rato α4YFP tomado com um microscópio Nikon C1si espectral confocal. (B) A parcela de espectros a partir de uma região de interesse, que inclui α4YFP neurónios contendo (verde), e uma região de interesse fora do habenula medial (vermelho). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig4.jpg" /> Figura 4. Desmistura espectral linear do habenula medial. (A) Imagens de α4YFP pura e (B) seguindo autofluorescência desmistura linear espectral. (C) espectros de referência do YFP (verde triângulos) e autofluorescência (círculos amarelos) utilizado para desmistura espectral. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig5.jpg" /> Figura 5. Upregulation de α4 nAChRs no hipocampo de α4YFP knock-nos ratinhos expostos a nicotina crónica. (A) Uma montagem de azulejos de α4YFP fluorescência a partir do hipocampo. As duas áreas de selecção tracejadas são os locais aproximados no membro inferior do caminho perfurante do hipocampo, onde as análises foram realizadas para cada rato. (B) α4YFP fluorescência foi significativamente maior no caminho perfurante de ratinhos expostos a nicotina crónica do que salina crónica (*, p = 0,001, teste de Wilcoxon Rank Sum). Os resultados representam a média ± SEM de n = 20 medições para ratinhos nicotina tanto salinos e crónica tratado (5 ratinhos para cada grupo de tratamento). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig6.jpg" /> Figura 6. D Melhorexpressão epth de α4YFP como comparado com a rotulagem do anticorpo. Exibições XZ ortogonais de α4YFP de fluorescência (A) e VGlut2 anticorpo com Cy5 como um rótulo secundário (B). (C) As parcelas que mostram uma maior intensidade de fluorescência a degradação do sinal sobre a profundidade para a coloração de anticorpo (quadrados pretos) em comparação com α4YFP (círculos abertos).

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W., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+doesn't+nicotinic+ACh+receptor+immunoreactivity+knock+out.">Why doesn't nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out.</a> Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).</li><li>Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+suitability+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+standard+immunodetection+procedures.">Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures.</a> J. Neurochem. , (2007).</li><li>Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+demonstrates+the+interdependence+of+mouse+brain+a4+and+b2+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+expression.">Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression.</a> The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).</li><li>Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+underlies+chronic+nicotine-induced+up-regulation+of+nicotinic+agonist+binding+sites+in+mouse+brain.">Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).</li><li>Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets+of+acetylcholine-stimulated+86[Rb]++efflux+and+125[I]-epibatidine+binding+sites+in+C57BL/6+mouse+brain+are+differentially+affected+by+chronic+nicotine+treatment.">Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment.</a> Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).</li><li>King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta2-subunit-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+are+critical+for+dopamine-dependent+locomotor+activation+following+repeated+nicotine+administration.">Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration.</a> Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).</li><li>Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inbred+mouse+strains+vary+in+oral+self-selection+of+nicotine.">Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine.</a> Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).</li><li>Sparks, J. A., Pauly, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+continuous+oral+nicotine+administration+on+brain+nicotinic+receptors+and+responsiveness+to+nicotine+in+C57Bl/6+mice.">Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice.</a> Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).</li><li>Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroadaptive+changes+in+the+mesoaccumbens+dopamine+system+after+chronic+nicotine+self-administration:+a+microdialysis+study.">Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study.</a> Neuroscience. 129, 415-4124 (2004).</li><li>Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+receptors+containing+the+Î²2+subunit+are+involved+in+the+reinforcing+properties+of+nicotine.">Acetylcholine receptors containing the Î²2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine.</a> Nature. 391, 173-177 (1998).</li><li>Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habenular+&#945;5+nicotinic+receptor+subunit+signalling+controls+nicotine+intake.">Habenular &#945;5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake.</a> Nature. 471, 597-601 (2011).</li><li>Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reinforcement+and+cognition+restored+by+targeted+expression+of+nicotinic+receptors.">Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors.</a> Nature. 436, 103-107 (2005).</li><li>Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+on+nicotine+dose+selection+for+in+vivo+research.">Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research.</a> Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).</li><li>Lang, T., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+clusters+at+nanoscale+resolution:+more+than+pretty+pictures.">Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures.</a> Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

<p class="jove_content"&gt; O uso de um receptor de fluorescente num modelo de rato knock-se para determinar a quantidade e localização de um canal de ião específico fornece um número de vantagens. Em contraste com as proteínas, tais como actina, que é ubíqua expressa em todas as células, os canais de iões estão presentes em números muito menos ea sua expressão varia entre os subtipos neuronais tornando a análise exacta através tradicionais técnicas imuno-histoquímicas desafio. O produto do gene α4YFP é expresso em níveis de...

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> mini-bombas osmóticas </td><td> Alzet </td><td> modelo 2002 </td><td></td></tr><tr><td> salina </td><td> Teknova </td><td> S5819 </td><td></td></tr><tr><td> (-)-Nicotina sal tartarato de hidrogénio </td><td> Sigma </td><td> N5260 </td><td></td></tr><tr><td> colírio </td><td> Novartis </td><td> Lágrima-Gel </td><td></td></tr><tr><td> Vetbond cola </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> sal heparina sódica </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> Invitrogen </td><td> 70011 </td><td></td></tr><tr><td> ketamina </td><td> Wyeth Saúde Animal </td><td> 0856-4403-01 </td><td></td></tr><tr><td> cloridrato medatomidine </td><td> Pfizer </td><td> 1950673 </td><td></td></tr><tr><td> 23G agulha borboleta </td><td> Becton Dickinson </td><td> 367253 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldeído </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> molde plástico de encaixe </td><td> VWR </td><td> 18986-1 </td><td></td></tr><tr><td> Composto outubro de montagem </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> EMD-Calbiochem </td><td> 475904 </td><td> pH 8,5 </td></tr></table>

spectral confocal imaging of fluorescently tagged nicotinic receptors in knock-in mice with chronic nicotine administration

Canais ligando-iônicos no sistema nervoso central (CNS) estão implicados em numerosas condições com sérias consequências médicas e sociais. Por exemplo, dependência de nicotina através de fumo de tabaco é a principal causa de morte prematura em todo o mundo (Organização Mundial de Saúde) e é provavelmente causada por uma alteração de ião canal de distribuição no cérebro 1. Exposição crónica de nicotina em ambos os roedores e os resultados seres humanos em aumento do número de receptores de acetilcolina nicotínicos (nAChRs) no tecido cerebral 1-3. Da mesma forma, alterações nas glutamatérgicos GluN1 ou GluA1 canais têm sido implicados no desencadeamento de sensibilização a outras drogas como a cocaína, as anfetaminas e opiáceos 4-6. Consequentemente, a capacidade de mapear e quantificar a distribuição e os padrões de expressão de canais iónicos específicos é criticamente importante para a compreensão dos mecanismos de dependência. O estudo do cérebro específico de região efciais de drogas individuais foi avançada pelo advento de técnicas como ligantes radioativos. No entanto, a baixa resolução espacial de ligação do ligando radioactivo evita a possibilidade de quantificar canais ligando-iônicos em subtipos específicos de neurónios. Codificados geneticamente repórteres fluorescentes, tais como a proteína verde fluorescente (GFP) e suas variantes de cor muitos, têm revolucionou o campo da biologia 7. Por marcação geneticamente um repórter fluorescente para uma proteína endógena se pode visualizar as proteínas in vivo 7-10. Uma vantagem das proteínas fluorescentes de marcação com uma sonda é a eliminação do uso de anticorpos, que têm problemas de inespecificidade e acessibilidade à proteína alvo. Nós temos usado essa estratégia para nAChRs fluorescente rótulo, o que permitiu o estudo do conjunto receptor usando Förster Resonance Energy Transfer (FRET) em cultura de células transfectadas 11. Mais recentemente, temos utilizado a Knock-na abordagem aos ratos engenheiro com proteína fluorescente amarela marcado α4 subunidades (nAChR α4YFP), permitindo a quantificação exacta do ex vivo receptor em resolução submicrométricas em neurônios do sistema nervoso central através de microscopia confocal espectral 12. O alvo fluorescente knock-in mutação é incorporado no locus endógeno e sob o controlo do seu promotor nativo, produzindo níveis normais de expressão e regulação do receptor, quando comparado aos receptores não marcados em ratinhos de tipo selvagem. Esta abordagem knock-in pode ser estendido para marcar fluorescentemente canais iónicos outros e oferece uma abordagem poderoso de visualizar e quantificar os receptores do SNC. Neste artigo descrevemos uma metodologia para quantificar as mudanças na expressão nAChR em neurônios específicos do SNC após exposição crônica à nicotina. Nossos métodos incluem mini-implante de bomba osmótica, a fixação de perfusão intracardíaca, imagem e análise de fluorescência marcado rec nicotínicosubunidades eptor de α4YFP knock-em ratinhos (Fig. 1). Temos optimizada a técnica de fixação para minimizar a partir de autofluorescência tissue.We cérebro fixo descrever em detalhe a nossa metodologia de imagem utilizando um microscópio confocal espectral em conjunto com um algoritmo de desmistura linear espectral para subtrair o sinal autofluoresent, a fim de obter com precisão o sinal de fluorescência α4YFP. Finalmente, mostra resultados de upregulation nicotina induzida crónica de receptores α4YFP no caminho perfurante medial do hipocampo.

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Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Nós desenvolvemos uma nova técnica de quantificar as alterações de receptores de acetilcolina nicotínicos no interior das regiões subcelulares de subtipos específicos de neurónios no SNC a compreender melhor os mecanismos da dependência da nicotina, usando uma combinação de abordagens, incluindo a marcação da proteína fluorescente do receptor usando o arrastamento na abordagem e espectral imagiologia confocal.

Imagem Confocal Espectral de fluorescência com a tag receptores nicotínicos na Knock-em camundongos com a administração de nicotina crônica

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

spectral-confocal-imaging-fluorescently-tagged-nicotinic-receptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K visualizações.  University of Victoria. Nós desenvolvemos uma nova técnica de quantificar as alterações de receptores de acetilcolina nicotínicos no interior das regiões subcelulares de subtipos específicos de neurónios no SNC a compreender melhor os mecanismos da dependência da nicotina, usando uma combinação de abordagens, incluindo a marcação da proteína fluorescente do receptor usando o arrastamento na abordagem e espectral imagiologia confocal.

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Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo pharmacological studies of the signals essential for the formation and maintenance of mammalian NMJs. However, drug penetration into these muscles after subcutaneous or intramuscular administration is often incomplete or uneven and many NMJs can remain unaffected. Although systemic administration with devices such as mini-pumps can improve the spatiotemporal effects, the invasive nature of this approach can cause confounding inflammatory responses and/or direct muscle damage. Moreover, complete analysis of the NMJs in a hind limb muscle is challenging because it requires time-consuming serial sectioning and extensive immunostaining. 
The mouse LAL is a thin, flat sheet of muscle located superficially on the dorsum of the neck. It is a fast-twitch muscle that functions to move the pinna. It contains rostral and caudal portions that originate from the midline of the cranium and extend laterally to the cartilaginous portion of each pinna. The muscle is supplied by a branch of the facial nerve that projects caudally as it exits the stylomastoid foramen. We and others have found LAL to be a convenient preparation that offers advantages for the investigation of both short and long-term in vivo effects of drugs on NMJs and muscles. First, its superficial location facilitates multiple local applications of drugs under light anesthesia. Second, its thinness (2-3 layers of muscle fibers) permits visualization and analysis of almost all the NMJs within the muscle. Third, the ease of dissecting it with its nerve intact together with the pattern of its innervation permits supplementary electrophysiological analysis in vitro9,5. Last, and perhaps most importantly, a small applied volume (&tilde;50&mu;l) easily covers the entire muscle surface, provides a uniform and prolonged exposure of all its NMJs to the drug and eliminates the need for a systemic approach1,8.

We describe procedures for repeated administration of inhibitors of muscarinic signaling to the levator auris longus (LAL) muscle of young adult mice and for subsequent immunostaining of its neuromuscular junctions (NMJs) in wholemounts. The LAL muscle has unique advantages for revealing in vivo pharmacological effects on NMJs.

A administração subcutânea de antagonistas muscarínicos e Triple-A imunocoloração do músculo Longus Levator Auris em Ratos

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo  pharmacological studies of the signals ...

Neurociência

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Quantifying Infra-slow Dynamics of Spectral Power and Heart Rate in Sleeping Mice

Three vigilance states dominate mammalian life: wakefulness, non-rapid eye movement (non-REM) sleep, and REM sleep. As more neural correlates of behavior are identified in freely moving animals, this three-fold subdivision becomes too simplistic. During wakefulness, ensembles of global and local cortical activities, together with peripheral parameters such as pupillary diameter and sympathovagal balance, define various degrees of arousal. It remains unclear the extent to which sleep also forms a continuum of brain states-within which the degree of resilience to sensory stimuli and arousability, and perhaps other sleep functions, vary gradually-and how peripheral physiological states co-vary. Research advancing the methods to monitor multiple parameters during sleep, as well as attributing to constellations of these functional attributes, is central to refining our understanding of sleep as a multifunctional process during which many beneficial effects must be executed. Identifying novel parameters characterizing sleep states will open opportunities for novel diagnostic avenues in sleep disorders.
We present a procedure to describe dynamic variations of mouse non-REM sleep states via the combined monitoring and analysis of electroencephalogram (EEG)/electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG), and electrocardiogram (ECG) signals using standard polysomnographic recording techniques. Using this approach, we found that mouse non-REM sleep is organized into cycles of coordinated neural and cardiac oscillations that generate successive 25-s intervals of high and low fragility to external stimuli. Therefore, central and autonomic nervous systems are coordinated to form behaviorally distinct sleep states during consolidated non-REM sleep. We present surgical manipulations for polysomnographic (i.e., EEG/EMG combined with ECG) monitoring to track these cycles in the freely sleeping mouse, the analysis to quantify their dynamics, and the acoustic stimulation protocols to assess their role in the likelihood of waking up. Our approach has already been extended to human sleep and promises to unravel common organizing principles of non-REM sleep states in mammals.

Here, we present experimental and analytical procedures to describe the temporal dynamics of the neural and cardiac variables of non-REM sleep in mice, which modulate sleep responsiveness to acoustic stimuli.

Quantificando a dinâmica infra-lenta do poder espectral e da freqüência cardíaca em ratos dormindo

Three vigilance states dominate mammalian life: wakefulness, non-rapid eye movement (non-REM) sleep, and REM sleep. As more neural correlates of behavior ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Análise de marcha automatizados em ratos com lesão crônica de constrição

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.

Microscopia de reflectométrica espectral em dendritos In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with subcellular location within cells where this function is carried out. To study the subcellular location of nicotinic ACh receptors (nAChRs) in native brain tissue, an optical method was developed for precise release of nicotine at discrete locations near neuronal membranes during electrophysiological recordings. Patch-clamped neurons in brain slices are filled with dye to visualize their morphology during 2-photon laser scanning microscopy, and nicotine uncaging is executed with a light flash by focusing a 405 nm laser beam near one or more cellular membranes. Cellular current deflections are measured, and a high-resolution three-dimensional (3D) image of the recorded neuron is made to allow reconciliation of nAChR responses with cellular morphology. This method allows for detailed analysis of nAChR functional distribution in complex tissue preparations, promising to enhance the understanding of cholinergic neurotransmission.

This article presents a method for studying nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in mouse brain slices by nicotine uncaging. When coupled with simultaneous patch clamp recording and 2-photon laser scanning microscopy, nicotine uncaging connects nicotinic receptor function with cellular morphology, providing a deeper understanding of cholinergic neurobiology.

Função de receptores nicotínicos de acetilcolina em fatias de cérebro de rato através de Laser Flash fotólise de nicotina Photoactivatable de sondagem

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...