Bu teknik, fotoaktibl nikotin molekülünün lazer-flaş fotolizi ile birlikte multi-foton lazer tarama mikroskobu kullanır. Nikotinik kolinerjik reseptörlerin hassas aktivasyonuna izin. Bu teknik nikotinik reseptör agonist uygulaması üzerinde ince spatiotemporal kontrol sağlar, reseptör fonksiyonel ekspresyon desenleri ve kolinerjik sinaptik veya hacim iletimi çalışması için güçlü bir araç sağlayan.
İşleme başlamadan önce, 20 ila 40 mikrometre lik açma çapına sahip cam bir mikro pipet çekmek için programlanabilir bir pipet çekmecesi kullanın. 0,22 mikronluk bir filtre den yaklaşık bir mililitre kayıt çözeltisi süzün. Ve filtreli kayıt çözeltisinde iki milimolar son konsantrasyon elde etmek için yeterli lyophilized fotoaktivize nikotin resuspend.
Çekilen yerel uygulama mikropipeti fotoaktibl ilacın 50 mikrolitresi ile doldurun ve pipeti bir mikromanipülatöre monte edilmiş bir pipet tutucuya sabitle. Pipet tutucuyu uygun bir boru uzunluğu yla sürekli düşük basınçlı uygulama yapabilen bir basınç fırlatma sistemine bağlayın. Ve ekstrasellüler kayıt çözeltisi içine yerel uygulama pipet manevra için mikromanipülatör kullanın.
Pipet ucunu, ilgi çeken hücreden yaklaşık 50 mikrometre uzaklıktaki bir fare beyin dokusu örneğinin biraz üzerine yerleştirin. Ve kısaca pipet basınç inç kare başına 1-2 kilo uygulayın. İlgi hücresinin yer değiştirmesi çok az olmalıdır.
Kararlı bir bütün hücre yama kıskaç elde ettikten sonra, basınç ejeksiyon cihazı üzerinde düşük uygulama açın ve fotoaktiz nikotin ile hücre çevreleyen doku doygunluk bir ila iki dakika. Yerel uygulama deneme için ek karmaşıklık tanıtır. Ama bileşik yedekler ve PA-Nic yüksek konsantrasyonlarda kullanılmasını sağlar.
Fotoaktibl nikotinbanyo uygulaması için, ilk 100 mikromolar son konsantrasyonsürekli sirkülasyon için uygun kayıt çözeltisi hacminde lyophilized ilaç yeterli çözünür. Ve elde edilen karışımı bir perfüzyon sistemine yükleyin. Daha sonra fotoaktibl nikotin çözeltisinin dakikada 1,5 ila 2 milimetre lik bir hızda, gerekli sirkülasyon hacmini en aza indirmek için en az iç çapı ve genel uzunluğu ile tüp kullanarak sirkülasyon başlar.
Sirkülasyon sırasında, sürekli karbogen ile çözelti kabarcık, ve düşük ışık koşullarında 32 santigrat derece banyo sıcaklığını korumak. Banyo uygulaması, dokunun PA-Nic permeasyonunun basitliğinden ve tekdüzeliğinden yararlanır. Ama mutlaka düşük mikromolar PA-Nic konsantrasyonları kullanır, ve bileşik yüksek toplam miktarda harcar.
Medial habenula nöronun canlı görselleştirmesi için, kararlı, tam hücreli yama kelepçesi kaydı oluşturmak için iletilen ışık veya kızılötesi diferansiyel girişim kontrast optik ve video kamera kullanın. Yüksek dirençli hücre bağlı yapılandırmasını kurduktan sonra, ancak zorla girmeden önce, kurulum ve yazılımı lazer tarama moduna geçin. Zorla girdikten sonra, ilgi görüntüleme boyasının difüzyon la nöronu pasif olarak doldurduğunu doğrulamak için lazer taramasını kullanın.
Boyanın, canlı tazyimi kullanmadan önce en az 20 ila 30 dakika boyunca hücresel bölmeleri doldurmasına izin verin. Nöronal özelliklerin doğru canlı görüntülenmesine olanak tanıyan görüntüleme parametrelerini seçin, uygun ayarları değiştirerek ekran görselleştirmesini, çözünürlüğünü, sinyal-gürültü oranını ve görüntü çerçevesi edinme süresini gerektiği gibi değiştirin. Sinyal kontrastını artırmak için, arama masası penceresini açın ve arama masası zemin ve tavan ayarlarını ayarlayın.
Doku içinde ilgi alanı bulmak için, 1X optik zum seçin ve kaydırma kontrolleri kullanın. İlgi çekici hücreyi içeren bir başlangıç ve durdurma konumu seçmek için Z serisi aracını kullanın. Bir mikrometrenin adım boyutunu ayarlayın ve en yüksek çözünürlüklü görüntü verecek bir görüntü boyutu seçin.
Genellikle 1, 024 satır başına 1, 024 piksel. Sonra hücreyi içeren her Z düzlemindeki nöronu ardışık olarak görüntüle. Lazer stimülasyonunu kalibre etmek için, sistemi minimumdan daha büyük bir görüntüleme lazer gücüyle taramaya başlayın ve objektif odak noktasını ince kırmızı marker floresan tabakasına ince ayarlayın.
Floresan alanı içinde enkaz dan temiz ve eşit marker ile kaplı bir alan seçin ve uncaging galvocalibration işlevini seçmek için araçları, kalibrasyon ve hizalama menüsünü açın. 405 nanometre lazer, 400 lazer stimülasyon gücü ve 20 milisaniye lik bir uyarılma süresi seçerek, ikinci galvanometre ayna çiftinin mekansal kalibrasyonu için yanık lekeleri öğretici izleyin. Kırmızı işaretleyicide bir ila beş mikrometre çapında delikler açmak için.
Merkezi nokta yandıktan sonra görüntüyü uyarmak ve yenilemek için güncelleştirmeyi seçin ve yuvarlak kırmızı göstergeyi dokuz noktadan oluşan bir ızgara elde etmek için merkezin, sağ ortanın ve alt orta noktaların gerçek nokta konumuna taşıyın. Kalibrasyonu test etmek için işaret noktaları penceresini açın ve doğru son kalibrasyon dosyasının işaret noktaları penceresine yüklendiğine dikkat edin, numunenin yeni bir alanında tanımlanan noktaların uyarım parametrelerini el ile etkinleştirin. Ardından doğru kalibrasyonu doğrulamak için bir test darbesi uygulayın.
Kısaca görüntü ve ilgi alt hücresel alanı bulmak için, canlı tarama seçin ve gerektiğinde herhangi bir küçük yapıları görselleştirmek için optik zoom artırmak kullanın. İşaret noktası tek noktalı crosshairs hemen hücre zarına bitişik yerleştirin ve bir-50 milisaniyelik süre, bir-dört miliwatt lazer gücü ve en az bir deneme için fotostimülasyon parametreleri ayarlayın. Ardından işaret noktaları protokolünü başlatmak için çalışma işareti noktalarını seçin ve elektrofizyoloji veri alımını gerçek zamanlı olarak gözlemleyin.
Bir milimolar PA-Nic fotoaktiz nikotin 2PE floresans kolayca gösterildiği gibi yerel bir uygulama pipet basınç ejeksiyon sırasında tespit edilir. Fotoaktipabl nikotin fotoliz reaksiyonunun ana fotokimyasal ürünlerinin teslimi ise aynı konsantrasyonda floresan sinyal üretmez, uyarma gücü ve dalga boyu. Fotoaktipabl nikotin sonuçlarının özgüllüğünü gösteren.
Gösterildiği gibi beyin dokusuna uygulanan fotoaktibl nikotinin görüntülenmesi, ilacın lokal uygulama pipetinin 100 ila 200 mikrometre içinde varlığını ortaya koymaktadır. Fotoaktipabl nikotinin lokal uygulama ile beyin dokusuna etkili bir şekilde iletilebildiği doğrulanabilir. Burada nöronal morfolojinin tamamlandığı, gürültünün en aza indirildiği ve enkazın hücresel morfolojinin yorumlanmasına engel olmadığı yüksek kaliteli görüntüler gösterilmiştir.
Ancak bu görüntüler daha düşük kalitededir. Daha düşük bir sinyal-arka plan oranı ve önemli enkaz sayesinde. Beyin dilimlerinde medial habenula nöronların iki foton lazer tarama mikroskobu ile PA-Nic lazer flaş fotolizi ile eşleştirme, hücresel morfoloji ile elektrofizyolojik yanıtların uzlaştırılması için izin verir.
10 saniyelik aralıklarla gerçekleştirilen tek noktalı fotolİz, taban çizgisi tutma akımı için yeterli bir kurtarma süresi sağlar. Daha kısa bir saniyelik aralık, protokol ilerledikçe tutma akımında kademeli bir artışa yol açarken. Nikotinin daha kısa aralıklarla sistemden uzaklaşmak için yeterli zamanı olmadığını düşündürüyor.
Fotoaktibl molekülleri kullanan deneyler tasarlanırken, floresan göstergeleri seçmeyi ve uyumlu uyarma emisyon spektrumları ile floroforları rapor etmeyi unutmamak önemlidir. PA-Nic kısa dalga boyu fotolik tepe nedeniyle en yaygın florofores ile uyumludur. En uygun PA-Nic uygulama tekniği seçerken, dikkatle fonksiyonel ifade, ilgi nöronlarda nikotinik reseptörlerin fizyolojik aktivitesi dikkate almak önemlidir.
Bu tekniğin yetenekli kullanımı nikotin uygulamasıince spatiotemporal kontrol sağlar, hangi yerli nikotinik reseptör nişan kinetik çalışma için heyecan verici yeni olanaklar sağlar, subsellüler lokalizasyon, ve nikotinik reseptör aktivasyonu ile nöronal aktivite modülasyonu.
