Damos las gracias al equipo de la producción de virus DKFZ y la unidad de desarrollo, en particular, Müller Marcus, Münstermann Silvia, Liebetrau Bárbara, y Roscher Mandy. Este estudio ha sido parcialmente subvencionado por el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF) y la Asociación Helmholtz en el marco de la Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est programa conjunto en el tumor Aplicada Virología.

Nótese que un laboratorio con un nivel de bioseguridad 2 se requiere para la producción de parvovirus recombinantes (recPV). El protocolo se divide en dos partes principales. La primera parte (producción de recPV a través de la transfección) se requiere para producir la cantidad mínima de recPVs que sirve como inóculo en la segunda parte del protocolo (producción de recPVs a través de la infección). Una vez que una pequeña cantidad de recPVs se produce, la primera parte del protocolo puede ser omitido, y el parvovirus recombinante puede ser amplificado sólo a través de la infección proporcionar el gen que codifica para las proteínas parvovirus cápside a través de la ayudante de adenovirus (véase más adelante). 1. Producción de recPVs través Transfección 1,1 transfección de ADN viral Es posible utilizar cualquier método de transfección de ADN establecido en esta sección del protocolo ya sea sobre la base de lípidos catiónicos o fosfato cálcico. Generalmente usamos Fugene HReactivo D transfección. Para controlar la eficacia de transfección, se recomienda que la transfección de la placa adicional con un plásmido que expresa mayor proteína verde fluorescente (por ejemplo, pEGFP-N1, Clontech). Transfección se considera eficiente y óptima para la producción de virus cuando al menos 50% de la población de células resulta EGFP-positivas 24 horas después de la transfección. <ol><li> 1 día antes de la transfección, las células HEK293T 2 millones de semillas en una placa de 10 cm, para obtener 50% de confluencia celular en el día de la transfección. Se cultivan las células en 10 ml de medio modificado de Dulbecco Eagle (DMEM) con adición de 10% de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100 U por ml de penicilina y 100 ug / ml de estreptomicina. </li><li> Preparar el virus de la toma de mezcla (1:2:1 proporción molar) en un tubo de 1,5 ml: <ol class="lalpha"><li> 3 g de recPV vector de albergar el transgen de interés (IE PhH-1-GFP 6). </li><li> 6 g de vector pCMV / VP 5 albergar la cápsida del parvovirus unidad de gen </li><li> 8 mg of adenovirus derivado de plásmido ayudante pXX6 7. </li></ol></li><li> Se diluye la mezcla plásmidos con medio libre de suero hasta 850 (concentración final de 20 ng / l) l. </li><li> Añadir 42,5 l Fugene HD (2,5:1 Fugene l ratio: ADN g). No toque el lado del tubo cuando se añade Fugene al medio. </li><li> Vortex suavemente durante 5-10 segundos. </li><li> Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. </li><li> Añadir las mezclas de transfección una sabia gota a las células. Agitar la placa suavemente para distribuir uniformemente la mezcla de todo. </li></ol> 1.2 Virus de la producción <ol><li> Incubar la placa a 37 ° C con un 92% de humedad y 5% de CO 2 durante 72 horas antes de la cosecha. Durante este período partículas progenie parvovirus se forman a partir de los plásmidos parvovirus. </li></ol> 1.3 Virus de la cosecha <ol><li> En una campana de cultivo de tejidos, raspar las células dentro de su medio, aspirar y transferir la suspensión de la placa en un 15ml tubo de plástico. </li><li> Centrifugar el tubo a 250 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el 95% del sobrenadante. </li><li> Vortex el tubo suavemente para resuspender el precipitado en el sobrenadante restante (aproximadamente 0,5 ml). </li><li> Congelar el tubo a -80 ° C. Es posible detener la producción en esta etapa o para continuar con el protocolo. </li><li> Descongelar la suspensión y llevarlo a la temperatura ambiente. </li><li> Congelar la suspensión en un baño de nitrógeno líquido y descongelación en agua caliente a 37 ° C. Vortex los tubos vigorosamente durante 15 segundos y repita los ciclos de congelación-descongelación dos veces más. </li><li> Centrifugar los tubos a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. El tubo en esta etapa contiene la preparación de virus extracto crudo. </li><li> Continúe con la titulación del virus (ver más abajo). Para el recPV que lleva el gen GFP, una típica producción debe dar de 1-3 x 10 7 unidades virales infecciosas que corresponden a alrededor de 1 -3 x 10 10 genoma viral que contiene partículas. </li></ol> 1.4 Virus de almacenamiento <ol><li> Para almacenamiento a largo plazo congele el tubo que contiene el extracto de virus de crudo a -80 ° C. Es posible utilizar extractos crudos virales como inóculo en la segunda parte del protocolo. </li></ol> 2. Producción de recPVs través de la infección Antes de comenzar con la producción recPV través de la infección, producción y purificación de adenovirus 5 que lleva el parvovirus VP gen (Ad-vicepresidente ayudante, se describe en el 5) de acuerdo a protocolo estándar de 8. También es necesario disponer de una cantidad mínima de recPVs portadores del transgén de interés (por ejemplo, producida a través de la transfección como se describió anteriormente). A continuación, se describe la producción de recPV en 175 cm 2 frasco (T175) en formato. Amplificación adicional del stock de virus producido de esta manera puede llevarse a cabo en 10 cámaras multicapa CellSTACK cultivo (Corning)con pequeños ajustes del protocolo propuesto. 2.1 La infección <ol><li> 1 día antes de la infección, las células NB324K placa 10 millones en un matraz T175 para obtener 60-80% de confluencia celular en el día de la infección. Preparar un segundo matraz que contiene el mismo número de células como un control (células no infectadas). Cada T175 debe tener 20 ml de Medio Esencial Mínimo (MEM) como un volumen final, suplementado con 5% de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100U por ml Penicilina y 100 estreptomicina g / ml. </li><li> A la mañana siguiente preparar la mezcla de virus en un tubo de plástico de 2 ml que consiste en: <ol class="lalpha"><li> Ad-VP-auxiliar 5 en multiplicidad de infección (MOI, las unidades infecciosas / celulares) = 10 (correspondiente a 1 x 10 8 unidades infecciosas); </li><li> recPVs en Moi = 0,5 (correspondiente a 5 x 10 6 unidades infecciosas). Completar a 1,5 ml con MEM. </li></ol></li><li> Aplicar la mezcla de virus entero en un matraz de la T175. </li><li> Incubar elmatraz durante 2 horas a 37 ° C, 92% de humedad, 5% de CO 2 agitando suavemente cada 15 min. </li><li> Incubar durante 20-24 h más a 37 ° C, 92% humedad, 5% de CO 2. </li><li> Vuelva a colocar el medio de cultivo con medio fresco. </li></ol> 2.2 Virus de la producción Incubar los matraces a 37 ° C con 92% de humedad y 5% de CO 2 durante 48 horas. Como indicación de la producción viral eficiente, claros signos de citotoxicidad se deben observar en el matraz que contenía células infectadas por virus, a partir de 36-48 horas post-infección. 2.3 Virus de la cosecha <ol><li> En una campana de cultivo de tejidos, aspirar y transferir el sobrenadante del medio desde el matraz en un tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Se lavan las células dos veces con 1,5 ml de PBS. </li><li> Trypsinize las células con 1,5 ml de 0,25% Trysin-EDTA. Añadir la suspensión de células al medio eliminado. </li><li> Centrifugar las células y el sobrenadante a 5.000 xg durante 5 min a temple habitacióntura. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 1 ml de tampón TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) al sedimento de células y vórtice suavemente el tubo para resuspender las células. </li><li> Congelar la suspensión celular en un baño de nitrógeno líquido y descongelación en agua caliente a 37 ° C. Vortex el tubo vigorosamente durante 15 segundos y repita el ciclo de congelación-deshielo en tres ocasiones. </li><li> Tratar la suspensión celular con 50 nucleasa U / ml Benzonase durante 30 min a 37 ° C con el fin de digerir el genómico de células y no envasados ​​ADNs virales. </li><li> Centrifugar el tubo a 5.000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. El sobrenadante en esta etapa contiene la preparación de virus extracto crudo. Los rendimientos típicos de recPV-GFP producido siguiendo este protocolo debe estar en el intervalo de 1-10 x 10 8 unidades infecciosas víricas. </li></ol> 2.4 Virus de almacenamiento <ol><li> Para el almacenamiento a corto plazo (máximo 2 meses), virus de la tienda de a 4 ° C. </li><li> Por long almacenamiento a largo plazo (más de 2 meses), el virus de la tienda a -80 ° C. </li></ol> 3. RecPV Purificación <ol><li> Para la purificación de recPVs de los lisados ​​crudos, se recomienda ejecutar un iodixanol gradiente discontinua de acuerdo a Zolotukhin et al. 9. Recomendamos utilizar un mínimo de 5 ml de extracto crudo viral (obtenido de la producción en cinco matraces T175) para la purificación del virus eficiente. </li></ol> 4. Titulación parvovirus recombinante <ol><li> Realizar titulación recPV como se describe en El-Andaloussi et al. 5 </li></ol> 5. Controles de calidad <ol><li> Utilizar el protocolo descrito en El-Andaloussi et al. 5 para comprobar la presencia de virus de replicación no deseados competentes (RCV) que llevan a cabo ensayos parvovirus placa en células indicadoras NB324K. </li></ol> 6. Los resultados representativos Un ejemplo de recPVs production mediante transfección en presencia o ausencia de elementos genómicos de adenovirus se muestra en la Figura 3. Las células se transfectaron con pCMV / VP (plásmido que lleva el gen que codifica para las proteínas de la cápside VP parvovirus) junto con PhH-1-GFP (una recPV que alberga el gen GFP) o PhH-1-luciferasa (una recPV que alberga el gen de luciferasa de luciérnaga) , con (+ pXX6) o sin (-pXX6) la pXX6 plásmido (llevando el adenovirus E2A, E4 (orf6) y los genes VA RNA). Volumen igual de extractos de células brutos se aplica a NB324K células y transducción de GFP o ensayos de luciferasa se ​​realizaron como se informó en El-Andaloussi et al. 5. Un claro aumento en la producción recPVs se obtuvo de la presencia de pXX6 con aumento de la producción de 0,3 unidades GFP transduccionales (TU) o de células obtenidas de acuerdo con protocolos convencionales a aproximadamente 5 TU / célula obtenida siguiendo nuestro método (Fig. 3A, B). Un aumento significativo (alrededor de 24 veces) de recPV Produccionessobre también se observó en el caso de PhH-1-luciferasa (fig. 3C). Estos resultados indican que el material genético contenido en pXX6 es capaz de impulsar la producción de parvovirus. Un ejemplo representativo de la producción recPVs través de la infección se muestra en la Figura 4. Células NB324K fueron co-infectados con recPVs diferentes (como se indica en la figura) y Ad-VP-helper (que alberga el gen que codifica para las proteínas de la cápside VP PV). Ad-VP ayudante producción recPV mejorarse aún más hasta&gt; 70 TU por sembrado de células (Fig. 4A), sin aumentar la ocurrencia de indeseables replicación competentes partículas virales (Fig. 4B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" /> Figura 1. Vectores sobre la base de los parvovirus autónomos. (A) superior: El transgén sustituye una parte de los genes codificantes VP y está bajo el control del promotor viral P38. Los genes para NS1 / 2 son recontenidas y su expresión está controlada por el promotor viral P4. El genoma del vector está flanqueado por el parvovírica RTI, que contienen elementos de acción cis que se requieren para la replicación y empaquetamiento del genoma recombinante. Conclusión: Un plásmido que lleva el gen VP-bajo o bien una heteróloga (por ejemplo por CMV.), O autógeno (por ejemplo, P38.) Promotor (Px), se suministra en trans durante la producción del parvovirus recombinante con el fin de compensar la interrupción de los genes estructurales en el genoma recombinante. ITR, repetición terminal invertida. Figura adaptada de 4 (B). Vista esquemática del protocolo clásico utilizado para la producción de recPVs. HEK293T células se transfectadas transitoriamente con ADN viral (vectores y plásmidos auxiliares) y después de tres días, las células se recogen y se recogieron los virus. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" /> Figura 2. Producción de recPVs con ella ayuda de la Ad-VP. (A) Esquema de mapas de genomas recPV y Ad-VP. El recPV contiene un transgén heterólogo que sustituye parte de la región VP. El Ad-VP alberga el gen VP parvovirus. (B) Representación esquemática del protocolo descrito en este manuscrito. NB324K células están co-infectados con el virus recPV y Ad-VP. Después de tres días se cosechan las células y partículas recPV recuperado de lisado celular. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" /> Figura 3. Estimulación de la producción recPV por el adenovirus-basados ​​en plásmidos pXX6. HEK293T células, se siembran en platos de 10 cm, fueron transfectadas con pCMV / VP en combinación con PhH-1-GFP (A y B) o PhH-1-luciferasa (C) para producir recPVs. Simultáneamente, las células fueron co-transfectadas con los plásmidos auxiliares derivados de adenovirus-pXX6 o no, como se indica. Tres días después de la transfección, las células se cosecharon y se lisaron mediante tres ciclos de congelación y descongelación. Volúmenes iguales de crudextractos de correos de virus se aplicaron a NBK células indicadoras, y los ensayos de transducción se llevaron a cabo. (A) micrografías representativas que muestran las células GFP positivos en monocapas confluentes NB324K. (B) Cuantificación de los ensayos de transducción de GFP expresada en la unidad de transducción (UT) por célula cabeza de serie . (C) La cuantificación de la actividad de la luciferasa expresado como unidades relativas de luciferasa (RLU). El ensayo de luciferasa se ​​realizó como se describe en el-Andaloussi et al. 5. Las columnas representan los valores promedio de tres repeticiones con barras de desviación estándar. Número en la parte superior de la columna + pXX6, en (B y C), indica el aumento veces en los títulos de virus recPV, obtenido en la presencia de pXX6 versus sin. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" /> Figura 4. Estimulación de la producción recPV por medio de virus recombinante ayudante ad-VP. (A) células NB324K, fueron infecciónTed con virus purificado ayudante Ad-VP en MOI de 10 (Ad-X unidad / célula, se titula con adeno-X Kit para la titulación) y, a continuación superinfección con cualquiera de los parvovirus siguiente recombinante Chi-HH-1-EGFP 11 (0,1 TU / célula) o H-1-GFP (0,5 TU / célula) 5. Un día después de la infección, el medio se cambió y dos días más tarde, las células se recogieron y se lisaron mediante tres de congelación-descongelación y ciclos. Los extractos crudos de células se utilizan para determinar los títulos de virus mediante el ensayo de transducción de acuerdo con El-Andaloussi et al. 5. TU, unidad de transducción. (B) lotes virales producidos en la presencia de la ausencia de Ad-VP se analizaron para determinar su contenido de replicación competentes partículas virales (VN) por ensayo en placa en células indicadoras NB324K.

<ol>
	<li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms.">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).</li><li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics.">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).</li><li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1,+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li><li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+based+on+autonomous+parvoviruses:+novel+tools+to+treat+cancer.">Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer.</a> J. Virol. 6, 193-193 (2004).</li><li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus.">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li><li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses.">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li><li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus.">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224 (1998).</li><li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973 (1999).</li><li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation.">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).</li><li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells.">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851 (2003).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Hemos demostrado que la producción recPV puede mejorarse por la presencia de elementos genómicos adenovirales. Hemos aumentado los rendimientos recPV por más de 10 veces (de 0,3 a 5 UT / célula), proporcionando elemento adenovirus genómico a través de la transfección y por más de 100 veces infectan co-las células con Ad-VP-ayudante en combinación con el recPV en comparación con los protocolos convencionales. El protocolo descrito aquí puede optimizarse mediante la determinación de la temporización más ade...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase nucleasa </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X rápida Titulación Kit </td><td> Clontech </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems

Parvovirus roedores (PV), tales como ratas H-1PV y MVM, son pequeñas, simples virus icosaédricas transición a la competencia, el ADN. Su genoma incluye dos promotores P4 y P38 que regulan la expresión de proteínas no estructurales (NS1 y NS2) y cápside (VP1 y VP2), respectivamente 1. Ellos atraen el interés de alta como agentes contra el cáncer para sus habilidades y oncolíticos oncosuppressive al tiempo que no patógeno para los seres humanos 2. NS1 es el efector principal de 3 citotoxicidad viral. Con el fin de mejorar aún más sus actividades antineoplásicos naturales, derivados de estos vectores se han generado mediante la sustitución del gen que codifica para las proteínas de la cápside con un transgén terapéutico (por ejemplo, un polipéptido citotóxico, citoquinas, quimioquinas, gen supresor tumoral, etc) 4. Los parvovirus recombinantes (recPVs) vector retiene las secuencias NS1 / 2 de codificación y los telómeros genoma fotovoltaicos que son necesarias para la amplificación del ADN viral y el envasado. Producción derecPVs se produce sólo en las células productoras (generalmente HEK293T), por la co-transfección de las células con un segundo vector (pCMV-VP) que expresan el gen que codifica para las proteínas VP (fig. 1) 4. Los vectores recPV generadas de esta manera son replicación defectuosa. Aunque recPVs demostrado poseer actividades mejoradas oncotoxic con respecto a los virus parentales de los que han sido generadas, su producción sigue siendo un reto importante y fuertemente obstaculiza el uso de estos agentes anti-cáncer en aplicaciones clínicas. Hemos encontrado que la introducción de un vector de Ad-5 que contiene el derivado E2a, E4 (orf6) y los genes VA RNA (por ejemplo pXX6 plásmido) en HEK293T mejoró la producción de recPVs por más de 10 veces en comparación con otros protocolos en uso. Con base en este hallazgo, hemos construido una novela Ad-VP-helper que contiene los elementos genómicos adenovirales necesarias para aumentar la producción de recPVs así como la parvovirnos VP gen la unidad 5. El uso de Ad-VP-ayudante, permite la producción de reco-PV usando un protocolo que se basa enteramente en los pasos infección viral (en oposición a la transfección del plásmido), lo que hace posible el uso de líneas celulares que son difíciles de transfectar (por ejemplo, NB324K) ( fig. 2). Se presenta un método que mejora enormemente la cantidad de virus recombinante producida, reduciendo tanto el tiempo de producción y los costes, sin afectar la calidad del producto final 5. Además, la producción a gran escala de recPV (en células en suspensión y biorreactores) es ahora concebible.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems at JoVE.com

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Aquí se describe un protocolo basado solamente en la infección de células, lo que mejora la eficiencia de la producción recombinante de parvovirus por más de 100 veces en comparación con otros protocolos en uso. Este protocolo se basa en el uso de un nuevo adenovirus 5-basado auxiliar que contiene el VP parvovirus unidad de transcripción (Ad-VP).

Producción eficiente de parvovirus recombinante con la ayuda de derivados de adenovirus-Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

efficient-recombinant-parvovirus-production-with-help-adenovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K vistas.  German Cancer Research Center (DKFZ). Aquí se describe un protocolo basado solamente en la infección de células, lo que mejora la eficiencia de la producción recombinante de parvovirus por más de 100 veces en comparación con otros protocolos en uso. Este protocolo se basa en el uso de un nuevo adenovirus 5-basado auxiliar que contiene el VP parvovirus unidad de transcripción (Ad-VP).

Video: Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

Estimación de las tasas de producción de virus en los sistemas acuáticos

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Investigación

Inmunología e Infección

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

Recombinante de producción retrovirales y la infección de células B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

Generación de Arenavirus recombinante para el Desarrollo de Vacunas de la FDA aprobados células Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Metodología Para La Generación Eficiente De Proteínas Del Virus Vaccinia Marcadas Fluorescentemente

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Producción simple y eficiente y purificación de ratón mielina de oligodendrocitos de la glucoproteína de la encefalomielitis autoinmune experimental Estudios

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Detección y eliminación de nucleasa contaminación durante la purificación de prototipo recombinante Virus Espumoso integrasa

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...